1、高效液相色谱常见问题小结液相色谱保养来源：互联网1.目的确保分析科研究人员能有效地使用高效液相色谱仪,科学地保养高效液相色谱仪, 使高效液相色谱仪的使用寿命尽量地延长，保持良好的工作状态, 特制定此管理规程2.范围本规程适用于开发部分析科所有人员及其他部门科室在开发部使用开发部任一高效液相者。3.职责所属以上范围的人员都应严格遵守此项规程，保证高效液相的保养科学合理。4.程序4.1压力异常操作压力的变化往往是故障的征兆。从下表中找出所观察到的现象，并在右侧的列表中参考相应的解决方法。4.1.1没有压力显示，没有流动相流动原 因解决方法1、电源问题 1、接通电源，开机2、保险丝被烧坏2、更换保险
2、丝3、控制器设定不正确或设定失败3、a、采取恰当的设定 b、修理或更换控制器4、柱塞杆折断4、更换柱塞杆5、泵头内有空气5、溶剂脱气、启动泵抽出空气6、流动相不足6、a、补充流动相 b、更换入口滤头7、单向阀损坏7、更换单向阀8、漏液8、拧紧或更换手紧接头4.1.2流动相流动正常，但没有压力显示原 因解决方法1、仪表损坏1、更换仪表2、压力传感器损坏2、更换压力传感器4.1.3压力持续偏高原 因解决方法1、流速设定过高1、调整流速设定2、柱前筛板堵塞2、a、在允许情况下反冲色谱柱 b、更换筛板 c、更换色谱柱3、流动相使用不当或缓冲盐的结晶沉淀3、a、使用恰当的流动相 b、冲洗色谱柱4、色谱柱
3、选择不当4、选择恰当的色谱柱5、进样阀损坏5、清洗或更换进样阀6、柱温过低6、提高温度7、控制器失常7、修理或更换控制器8、保护柱阻塞8、清洗或更换保护柱9、在线过滤器阻塞9、清洗或更换在线过滤器4.1.4压力持续偏低原 因解决方法1、流速设定过低1、调整流速2、系统漏液2、确定漏液位置并维修3、色谱柱选择不当3、选择恰当的色谱柱4、柱温过高4、降低温度5、控制器失常5、维修或更换控制器4.1.5压力不断上升原 因解决方法1、见列表4.1.31、见列表4.1.34.1.6压力降为零原 因解决方法1、见列表4.1.1、4.1.21、见列表4.1.1、4.1.24.1.7压力不断下降，但不回零原
4、因解决方法1、见列表4.1.41、见列表4.1.44.1.8压力波动原 因解决方法1、泵中有气体1、a、溶剂脱气 b、从泵中除去气体2、单向阀损坏2、更换单向阀3、泵密封损坏3、更换泵密封4、脱气不充分4、a、溶剂脱气 b、改变脱气方法（使用在线脱气法等）5、系统漏液5、确定漏液位置并维修6、使用梯度洗脱6、由于流动相粘度的变化引起的压力波动4.2漏液通常可以通过拧紧或更换管路接头来解决漏液的问题。但值得注意的是过份拧紧会导致金属接头的漏液和塑料接头的磨损。如果通过稍微拧紧接头不能解决漏液的问题，就必须将接头取下，检查是否损坏（例如，卡套损坏、密封表面有杂质）；损坏的接头应该更换掉。4.2.1
5、接头处漏液原 因解决方法1、接头松动1、拧紧2、接头磨损2、更换3、接头过紧3、a、拧松，再重新拧紧 b、更换4、接头被污染4、a、拆下清洗 b、更换5、部件不匹配5、使用同一品牌的配件4.2.2泵漏液原 因解决方法1、单向阀松动1、a、拧紧单向阀（不必拧的过紧） b、更换单向阀2、接头松动2、拧紧接头（不必拧的过紧）3、混合器密封损坏3、a、更换混合器密封 b、更换混合器4、泵密封损坏4、维修或更换泵密封件5、压力传感器损坏5、维修或更换压力传感器6、脉冲阻尼器损坏6、更换脉冲阻尼器7、比例阀损坏7、a、检查隔膜，如果漏液立即更换 b、检查手紧接头，损坏的立即更换8、放空阀的损坏8、a、拧紧
6、放空阀 b、更换放空阀4.2.3进样阀漏液原 因解决方法1、转子密封损坏1、重新安装或更换进样阀2、定量环阻塞2、更换定量环3、进样口密封松动3、调整4、进样针头尺寸不合适4、使用恰当的进样针5、废液管中产生虹吸5、保持废液管高于废液液面6、废液管阻塞6、更换或疏通废液管4.2.4色谱柱漏液原 因解决方法1、尾端接头松动1、拧紧接头2、卡套内有填料2、拆下、清洗卡套、重新安装3、筛板厚度不合适3、使用合适的筛板（参考下表）4.2.5筛板选择指导物质粒径筛板孔径3-4u0.5u5-20u2u4.2.6检测器漏液原 因解决方法1、流通池垫片损坏1、a、避免过大的背景压力（压力降） b、更换垫片2、
7、流通池窗破碎2、更换窗口3、手紧接头漏液3、拧紧或更换4、废液管阻塞4、更换废液管5、流通池阻塞5、重新安装或更换4.3谱图的各种问题液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。4.3.1峰拖尾原 因解决方法1、筛板阻塞1、a、反冲色谱柱 b、更换进口筛板 c、更换色谱柱2、色谱柱塌陷2、填充色谱柱3、干扰峰3、a、使用更长的色谱柱 b、改变流动相或更换色谱柱4、流动相PH选择错误4、调整PH值。对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰5、样品与填料表面的溶
8、化点发生反应5、a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂 b、更改色谱柱4.3.2峰前延原 因解决方法1、柱温低1、升高柱温2、样品溶剂选择不恰当2、使用流动相作为样品溶剂3、样品过载3、降低样品含量4、色谱柱损坏4、见4.3.1/1、4.3.1/24.3.3峰分叉原 因解决方法1、保护柱或分析柱污染1、取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞，拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。2、样品溶剂不溶于流动相2、改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。4.3.4峰变形原 因解决方法1
9、、样品过载1、减少样品载量4.3.5早出的峰变形原 因解决方法1、样品溶剂选择不恰当1、a、减少进样体积 b、运用低极性样品溶剂4.3.6早出的峰拖尾程度大于晚出的峰原 因解决方法1、柱外效应1、a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路） b、使用小体积的流通池4.3.7K增加时，脱尾更严重原 因解决方法1、二级保留效应，反相模式1、a、加入三乙胺（或碱性样品） b、加入乙酸（或酸性样品） c、加入盐或缓冲剂（或离子化样品） d、更换一支柱子 2、二级保留效应，正相模式2、a、加入三乙胺（或碱性样品） b、加入乙酸（或酸性样品） c、加入水（或多官能团化合物） d、试用另一种方法3、二级保留
10、效应，离子对3、加入三乙胺（或碱性样品）4.3.8酸性或碱性化合物的峰拖尾原 因解决方法1、缓冲不合适1、a、使用浓度50-100mM的缓冲液 b、参照Pka值调节缓冲液适合的Ph值4.3.9额外的峰原 因解决方法1、样品中有其他组份1、正常2、前一次进样的洗脱峰2、a、增加运行时间或梯度斜率 b、提高流速3、空位或鬼峰3、a、检查流动相是否纯净 b、使用流动相作为样品溶剂 c、减少进样体积4.3.10保留时间波动原 因解决方法1、温控不当1、调好柱温2、流动相组分变化2、防止变化（蒸发、反应等）3、色谱柱没有平衡3、在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱4.3.11保留时间不断变化原 因解
11、决方法1、流速变化1、重新设定流速2、泵中有气泡2、从泵中除去气泡3、流动相选择不恰当3、a、更换合适的流动相 b、选择合适的混合流动相4.3.12基线漂移原 因解决方法1、柱温波动。（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。）1、控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器2、流动相不均匀。（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。）2、使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。3、流通池被污染或有气体3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸
12、。（不要用盐酸）4、检测器出口阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）4、取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。5、流动相配比不当或流速变化5、更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时6、用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成7、检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂8、样品中有强保留的物质（高K值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。8、使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲
13、洗柱子。9、使用循环溶剂，但检测器未调整。9、重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。10、检测器没有设定在最大吸收波长处。10、将波长调整至最大吸收波长处4.3.13基线噪音（规则的）原 因解决方法1、在流动相、检测器或泵中有空气1、流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。2、漏液2、见4.2。检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。3、流动相混合不完全3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂4、温度影响（柱温过高，检测器未加热）4、减少差异或加上热交换器5、在同一条线上有其他电子设备5、断开LC、检测器和记录仪，检查干扰
14、是否来自于外部，加以更正。6、泵振动6、在系统中加入脉冲阻尼器4.3.14基线噪音（不规则的）原 因解决方法1、漏液1、见4.2。检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查流通池是否漏液。2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成2、检查流动相的组成。3、流动相各溶剂不相溶3、选择互溶的流动相4、检测器/记录仪电子元件的问题4、断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。5、系统内有气泡5、用强极性溶液清洗系统6、检测器内有气泡6、清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器7、流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。）7、用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池8、
15、检测器灯能量不足8、更换灯9、色谱柱填料流失或阻塞9、更换色谱柱10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常10、维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置4.3.15宽峰原 因解决方法1、流动相组成变化1、重新制备新的流动相2、流动相流速太低2、调节流速3、漏液（特别是在柱子和检测器之间）3、见4.2。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。4、检测器设定不正确4、调整设定5、柱外效应影响a、柱子过载b、检测器对反应时间或池体积响应过大c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大d、记录仪响应时间太长5、a、 小体积进样（例如：10ul而不
16、是100ul）以1：10或1：100的比例稀释样品b、减少响应时间或使用更小的流通池c、 使用内径为0.007-0.01的短管路d、减少响应时间6、缓冲液浓度太低6、增加浓度7、保护柱污染或失效7、更换保护柱8、色谱柱污染或失效，塔板数较低8、更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。9、柱入口塌陷9、打开柱入口，填补塌陷或更换柱子10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果11、柱温过低11、提高柱温。除非特殊情况，温度不宜超过7512、检测器时间常数太大12、使用较小的时间常数4.3.16分离度降低原 因解决方法1、流
17、动相污染或变质（引起保留时间变化）1、重新配置流动相2、保护柱或分析柱阻塞2、去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞，可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。4.3.17所有的峰面积都太小原 因解决方法1、检测器衰减设定过高1、减少衰减的设定2、检测器时间常数设定太大2、设定较小的时间常数3、进样量太少3、增大进样量4、记录仪连接不当4、使用正确的连接4.3.18所有的峰面积都太大原 因解决方法1、检测器衰减设定过低1、采取较大的衰减2、进样过多2、减少进样量3、记录仪
18、连接不正确3、正确连接记录仪4.4进样阀的问题以下问题在使用进样阀过程中有可能发生。4.4.1手动进样阀，转动不灵原 因解决方法1、转子密封损坏1、更换或调整转子密封2、转子太紧2、调整转子的松紧度4.4.2手动进样阀，载样困难原 因解决方法1、进样阀安装不当1、重新安装2、定量环阻塞2、清洗或更换定量环3、进样器污染3、清洗或更换进样器4、管路阻塞4、清洗或更换管路4.4.3自动进样阀，不能转动原 因解决方法1、无压力（或电源）1、提供恰当的压力（电源）2、转子太紧2、调整转子的松紧度3、进样阀安装不当3、重新安装4.4.4自动进样阀，其它问题原 因解决方法1、阻塞1、清洗或更换阻塞部件2、
19、机械故障2、见随机维修手册3、控制器故障3、维修或更换控制器4.5由气味、景象和声音可以发现的问题你需要运用你所有的感官去发现液相色谱的问题。你最好养成习惯，每天花上几分钟运用你的感官（除了味觉）来“感觉”你的液相色谱是否存在问题，这样可以帮助你迅速找到问题所在。例如：在你看到漏液之前，你可能首先闻到它的气味。大部分的问题是可以通过眼睛看到。4.5.1溶剂的气味原 因解决方法1、漏液1、见4.22、溅出2、a、检查废液瓶是否已满 b、找到溅出的部位并清洗干净4.5.2热气味原 因解决方法1、仪器过热1、a、检查并调节通风设施 b、检查并调节温度设定 c、关掉仪器，查找维修手册4.5.3读数不正
20、常原 因解决方法1、压力不正常1、见4.12、柱温箱问题2、 a、检查并调节设b、参照用户手册3、检测器灯失效3、更换灯4.5.4灯警告原 因解决方法1、压力超出极限值1、 a、检查是否阻塞b、检查并调节极限值的设定2、其它警示灯2、见用户手册4.5.5警告音原 因解决方法1、溶剂泄漏/溅出1、找到并解决2、其它警告音2、见用户手册4.5.6刺耳的短音或长音原 因解决方法1、轴承失效1、见用户手册2、润滑不够2、进行恰当的润滑3、机械故障3、见用户手册4.6常见故障及日常维护下表中列出了液相色谱常见的一些问题，右侧中则列出的日常维护的方法可以减少问题出现的频率。括号中的数字是建议进行维护的时间
21、间隔。用户手册则提供您更多的维护方法。4.6.1溶剂瓶问 题维 护1、进口筛板阻塞1、 a、更换（3-6个月）b、过滤流动相，0.5u滤膜2、气泡2、流动相脱气4.6.2泵问 题维 护1、气泡1、流动相脱气2、泵密封损坏2、更换（3个月）3、单向阀损坏3、过滤流动相，运用在线过滤，准备备用单向阀4.6.3进样阀问 题维 护1、转子密封损坏1、 a、不要拧的过紧b、过滤样品4.6.4色谱柱问 题维 护1、筛板阻塞1、a、过滤流动相 b、过滤样品 c、运用在线过滤或保护柱2、柱头塌陷2、a、避免使用PH8的流动相（针对大部分硅胶的柱子） b、使用保护柱 c、使用预柱（饱和色谱柱）4.6.5检测器问
22、 题维 护1、灯失效，检测器响应降低，噪音增大1、更换（6个月）或准备备用灯2、流通池有气泡2、a、保持流通池清洁 b、池后使用反压抑制器 c、流动相脱气4.6.6一般问 题维 护1、腐蚀/摩擦损坏1、在不使用时保持系统缓冲液的清洁4.7保养为了减少故障的发生，保证试验的顺利进行，对液相应定期进行保养工作。具体可参考说明书。4.7.1泵、管路系统及色谱柱a. 使用Waters515与Waters600泵时应注意用5甲醇经常冲洗泵清洁孔。b. 色谱柱使用后务必立即清洗干净，并保存于适当的溶剂中。c. 系统如长时间不使用，应将使用纯水及盐类溶液之管路以过滤过之水清洗，再使用10甲醇冲洗。必要时应先
23、取下色谱柱。d. 溶剂瓶、流动相的过滤头应每23周采用3M的硝酸溶液超声清洗。e. 在线过滤器应每23月采用3M的硝酸溶液超声清洗。4.7.2自动取样器 a. 试验结束后应设定Purge流程或予以使用Needle Wash的功能，清洗取样针，并注意洗针液的使用情况。b. 样品控温槽如湿度水汽偏高，应使用Defrost的功能，除去水汽避免控温槽发霉，造成机器损坏。4.7.3检测器a. 应每23周清洁空气滤网。b. 应每68周采用3M的硝酸溶液清洗Flow Cell。最终保存在有机溶剂中。c. 对于486检测器应每周检查灯源486的强度。波长设定在230nm，按Display显示值应在40以上，如
24、低于40应考虑更换。4.7.5溶剂瓶与流动相瓶应保持清洁。4.7.6系统控制器、检测器、泵的面板或设备表面被污染，可用软布或纸张擦掉脏物，必要时可用洗涤剂清洗。应每12周擦拭液相表面。5.注意事项5.1避免使柱子受太大的冲击，每次开机时流速必须缓缓上升，关机时也必须缓缓下降至0。5.2使用流动相必须干净，无气泡，建议临用新配，不宜久置。应预先用0.45m的滤膜过滤，并且脱气。5.3正反相系统互换时要严格按步骤操作，用异丙醇作为两相的替换溶剂。5.4确保Waters2690与Agilent1100泵的淋洗液不能走空。走空后必须使管路中充满淋洗液。5.5在每次液相使用结束后，溶剂瓶、流动相的过滤头必须用过滤后的水替代缓冲液后再用有机相保存。
