1、血小板抗原抗体检测及临床应用,长春博德生物技术有限责任公司郭超,目 录/contents,血小板抗原,血小板抗体与疾病,血小板抗体检测的意义和临床应用,血小板简介,血小板：D:2-5um V:红细胞*1/5功能：促进止血和加速凝血正常范围：100-300109/L,骨髓干细胞,胞质块脱落,来源：,多功能祖细胞,巨核祖细胞,幼巨核细胞,巨核细胞,血小板,血小板形态,静息状态,活化状态,血小板抗原,血小板“非特异性”抗原,血小板“特异性”抗原 HPA抗原,HLA-类抗原 ABH抗原,主要存在于血小板膜的GP分子上，也少量存在于血管内皮细胞、结缔组织细胞和平滑肌细胞。1990年国际输血协会血小板免疫
2、学工作组提出了HPA命名，以发现的时间顺序排列：HPA-1、HPA-2、HPA-3等系统。,HPA抗原,已确定了33个HPA，其中12 个抗原为双等位基因表达（HPA-1,-2,-3,-4，-5和-15）。其中高频率抗原命名a，低频率抗原命名b。其余21个抗原为低频率抗原，尚未发现对偶抗原，命名为bw。单核苷酸多态性（SNP）:33个HPA中均已搞清楚基因背景，其中32个HPA的多态性型是由一个氨基酸置换所致，而这又是由编码血小板膜糖蛋白（GP）基因的一个核苷酸的不同所致。HPA-14bw不具有单核苷酸多态性。其核苷酸置换发生在 AAG1929-31。,HPA抗原,HPA抗原,HPA抗原,血小
3、板抗原定型,血清学定型即用已知特异性抗体检测血小板血型抗原缺点：特异性抗体来源困难-人血清中血小板抗体通常为多特异性-单克隆抗体匮乏，目前国际上仅有HPA-1a单抗，无其它HPA单抗。基因定型限制性片段长度多态性分析（RFLP）序列特异性寡核苷酸聚合酶链反应(PCR-SSO)序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP),用途：（1）健康人群HPA基因分型，建立已知HPA基因型的血小板献血员库。（2）检测受者HPA基因型，以便从血小板献血员库中寻找与其HPA基因型相 匹配的血小板供者。（3）检测患者HPA基因型，辅助临床胎儿/新生儿免疫性血小板减少症、输 血后紫癜及血小板输注无效症等疾病的病因诊
4、断。（4）对特定区域或种族人群HPA基因分型，可为人类遗传学研究提供相关 资料和证据。,血小板抗原定型,血小板抗体的产生方式,以上途径产生的血小板同种抗体与血小板上的相应抗原结合，导致血小板被内皮网状系统清除。,移植（骨髓、器官）,输血小板、红细胞（尤其是没有滤白的红细胞）,血小板抗体与部分相关疾病,胎盘屏障,母体同种异体免疫,胎儿血小板减少,举例NAIT,NAIT,胎母同种异体免疫血小板减少症（fetomaternal alloimmune thrombocytopenia，FMAIT）致病机理与新生儿溶血病（HDN）相似，前者是由胎儿父母血小板抗原不合引起的血小板减少症，后者为红细胞抗原不
5、合引起的溶血性疾病。由于胎儿遗传自父亲的血小板抗原刺激母体产生IgG型的抗血小板抗体，该抗体能通过胎盘进入胎儿体内并与具有相应抗原的血小板结合，此致敏血小板在胎儿的血液循环中被清除而使得胎儿血小板减少，出现瘀点和瘀斑，其严重者会导致神经系统损伤（占已报道病例的20%）、10%出现颅内出血(死亡率近100%）。因多数病例在出生后才得以诊断，故此病也称作新生儿同种异体免疫血小板减少症。初次妊娠妇女即可发生FMAIT，其发病率大约为1/800-1500。,FMAIT患儿病情变化较大，具有自限性，常在出生后 2-3周恢复。轻度血小板减少患儿有时没有任何临床症状。病情较重患儿 临床表现为皮肤、体内外黏膜
6、出血，出现紫癜、瘀点或瘀斑。严重患儿可能发生颅内出血（intracranial haemorrhage，ICH），占10%。与FMAIT相关的ICH 80%发生在子宫内，其中14%发生在妊娠20 周前，28%发生在妊娠30周前。,NAIT临床表现,母体血清抗HPA抗体检测，然而母体抗体水平到预产期时逐渐下降，约有30%的病例抗体阴性。父母双亲的HPA基因检测，在高加索地区采取对其HPA-1和HPA-5基因检测，而在亚洲地区应考虑进行HPA-4和HPA-5基因检测。父母双亲交叉配型实验，将母体血清与父亲血小板进行交叉配型实验，即使不能确切知道不相合的抗原，但这种方法也能发现母体是否存在血小板同种
7、异体免疫反应。,NAIT早期诊断与筛查,NAIT,NAIT,血小板抗体检测常用方法,方法,指标,血小板抗体检测方法-固相凝集法,血小板抗体筛检，包括HLA抗体、HPA抗体及其它血小板反应性抗体。辅助血小板相关免疫性疾病的诊断。患者自身抗体检测，包括血小板结合抗体和血清中游离抗体。检测血小板结合抗体可将患者血小板平铺在反应孔后，直接加入抗人IgG和指示红细胞进行检测。血清中的游离抗体可通过患者自身血小板和血清反应来检测。,用途：,血小板抗体检测方法-固相凝集法,1.主要应用科室：检验科，血液病科，妇产科，新生儿科。2.检验科：检验科在常规血型鉴定中加入血小板抗体检测，可对临床输血中出现发热、黄疸
8、、急性肺损伤等非溶血性输血反应的风险作出评估。,血小板抗体检测临床意义,3.妇产科:孕前，孕期，产后1).反复流产、不孕不育查因：对于反复和习惯性流产史（尤其是孕早期）和不孕不育史的患者，检测患者血清和血浆中血小板抗体的水平，可对其造成流产和不孕不育的原因作出辅助诊断。2).产检（尤其针对高龄和二胎产妇）孕早期检测：在孕早期（三个月）产检中常规检测母亲与胎儿的血小板相容性，对于孕早期出现流产和死胎的风险评价具有非常重要的意义孕晚期检测：在孕晚期（胎儿出生前）检测母体血清或血浆中血小板抗体水平，对胎儿出生后罹患新生儿血小板同种免疫性疾病风险评价具有非常重要的意义。3).妊娠期血小板降低的查因：孕
9、妇在妊娠期血小板减少是一种常见现象，如是生理性降低则危害不大，往往生产后会恢复正常。但如果血小板的降低是由于孕妇自身免疫性疾病引起的则会引起流产、死胎、以及新生儿相关的血小板减少性疾病，危害严重。,血小板抗体检测临床意义,4.血液病科：1）自身免疫性疾病的辅助诊断：检测患者血清和血浆中自身血小板抗体的水平和特异性，可辅助诊断自身免疫性疾病如白血病、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合症、血小板减少症、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、特发性血小板减少性紫癜等。2）药物性抗体的检测：某些药物的存在如肝素、奎宁、奎尼丁、环磷酞胺、甲氨蝶呤、阿司匹林、水杨酸钠等，选择性的抑制了骨髓巨核细胞造血功能，使血小板的生成减
10、少，同时应用某种药物后，产生药物相关抗体，药物抗体复合物附着血小板膜上与补体结合，使血小板聚集破坏，一些药物进入人体后也可直接破坏血小板，造成血小板破坏增多，从而引发血小板减少。5.新生儿科：新生儿血小板同种免疫性疾病的辅助诊断。,血小板抗体检测临床意义,妇产科领域 检验科常规血型鉴定检测（门诊血型）自身免疫性疾病的辅助诊断药物性抗体检测,血小板抗体检测临床应用,曾有反复流产史的育龄妇女，可在怀孕前进行夫妻双方的血小板相关抗体检测，对由于母婴血小板血型不合而导致的流产或 NAIT进行早期的诊断和治疗。,青年女性流产率逐年上升,每一次怀孕、流产都可能造成母体因外来抗原刺激而产生抗体，危及下一次妊
11、娠。,如何在孕前/孕期正确地评估因父母血小板血型不合引起的流产、NAIT的风险？,血小板抗体检测在妇产科领域的应用,血小板抗体检测在妇产科领域的应用,父母血小板血型不合引起新生儿同种免疫性血小板减少症的初步研究 邓晶、夏文杰、叶欣、徐秀章、邵媛、陈扬凯、丁浩强、罗广平、王嘉励（广州血液中心临床输血研究所）热带医学杂志 2012年11月第12卷第11期文中观点：通过收集22例临床上确诊为新生儿免疫性血小板减少症（NIT）的患儿为研究对象，采用 ELISA 方法检测患儿及其父母的血小板相关抗体，应用 PCR-SSP法对患儿及父母进行 HLA及HPA基因分型，根据相应的抗原进行抗体特异性分析。结果2
12、2例NIT患儿中，14 例是由于同种免疫性因素引起的，其中 27.3（6例)由 HLA抗体引起,13.6（3例）由HPA抗体引起，22.7（5例）由HLAHPA 抗体引起；9.1（2例）由于被动免疫性因素引起;27.3（6例）由自身抗体引起。其中,同种免疫性抗体以抗 HLA-A2、19，抗-B40 及抗 HPA-3a多见。结论：在新生儿免疫性血小板减少症中，主要以父母血小板血型不合引起新生儿同种免疫性血小板减少症为主，临床产前诊断预防和产后治疗具有重要意义。,血小板抗体检测在妇产科领域的应用,血小板抗体检测在妇产科领域的应用,检测方案（仅供参考）,目前临床对不良孕产史查因、不孕不育查因、反复和
13、习惯性流产查因多采用综合检测方案排因如遗传因素、感染因素、免疫性因素等。血小板抗体检测可归类在免疫性因素套餐中。如深圳某三甲医院的免疫类检测套餐项目包括抗甲状腺微粒抗体（TMab）抗甲状腺球蛋白抗体（TGab）抗核抗体滴度检测狼疮抗凝物质检测血浆D-二聚体检测（D-Dimer）抗2糖蛋白I型抗体抗精子抗体抗磷脂抗体血小板特异性和组织相关融性抗体检测（HPA+HLA I类）,检测时段方案（仅供参考）,结果解释,治疗方案（仅供参考）,由血小板抗体阳性引起的相关性疾病可结合患者的个人情况建议采取茵陈汤调理并可适时服用阿司匹林（孕晚期禁用），丙球配合激素的治疗方案（1）血小板抗体弱阳：可服用茵陈汤或阿
14、司匹林调理。（2）血小板抗体阳性：起始剂量为泼尼松10-20 mg/d，起效后逐渐减至维持量5-10mg。（3）首次诊断者出现明显血小板减少及出血倾向：起始剂量为泼尼松 0.5-1 mg/（kgd），血小板计数维持（20-3010 9/L以上且出血倾向改善后 2 周可逐渐减量。（4）血小板抗体强阳性：期待快速起效时，可考虑大剂量的丙球0.4 g/（kg.d）持续3-5d，或甲基泼尼松龙1g/d持续3d。（5）糖皮质激素和丙球可同时使用。,血小板抗体检测应用：非溶血性输血反应的风险评估,白细胞特异性和组织相容性（HLA）抗体是引起临床非溶血性发热性输血不良反应的最主要原因，尤其是有输血史、输血小
15、板史、妊娠史、器官移植史、自身免疫性疾病史等的患者的临床输血工作中，非溶血性发热反应是临床最常见的输血不良反应（约70%），文献报道输注红细胞为26%，输注血小板为2030%，多次输血患者高达 2763，而非溶血性发热性输血反应与白细胞特异性和组织相容性（HLA）抗体密切相关，是影响临床安全输血的严重因素。白细胞特异性和组织相容性（HLA）抗体的检测对于预防和减少非溶血性发热性输血反应非常有意义。,血小板抗体检测应用：非溶血性输血反应的风险评估,吴宇辰，徐笑红，叶宏宇.血小板抗体对非溶血性输血反应的影响.中国输血杂志，2015年第28卷第8期.,输血反应与血小板抗体的关系,血小板抗体检测应用：
16、非溶血性输血反应的风险评估,分两个步骤：1、高危高发人群必检2、可进入相关检测套餐,血小板抗体检测应用：非溶血性输血反应的风险评估,检测建议：常规普检已成为趋势浙江、贵州为代表的全国近50家医院,血小板抗体检测应用：非溶血性输血反应的风险评估,检测套餐参考：,血小板抗体检测应用：非溶血性输血反应的风险评估,检测套餐参考：1、常规血型鉴定套餐2、术前配血套餐3、与红细胞血型抗体筛查检测捆绑,1、能不输血就不输血2、输滤白、辐照血3、输自体血4、血浆置换5、临床干预（免疫抑制、丙球、激素、中医中药调理）并告知输血风险,血小板抗体检测应用：非溶血性输血反应的风险评估,临床处理方案参考：,进行血小板抗
17、体检测，可以辅助诊断血小板免疫性疾病，如ITP。,自身免疫性疾病的辅助诊断,一般认为，ITP的发病机制包括血小板自身抗体导致的血小板破坏和清除。,检测患者血小板自身结合抗体，了解血小板是否在体内致敏，是血小板自身抗体导致ITP发生的直接证据,检测患者血小板自身游离抗体，了解血浆中的自身抗体是否能在体外与患者自身血小板结合，是血小板自身抗体导致ITP发生的间接证据,自身免疫性疾病的辅助诊断,血液病患者血小板抗体检测及其与血小板输注疗效的相关性研究夏世勤 苏莉 刘秋洪 杨眉 安邦权 王茂玲 于慧芳1贵州省人民医院输血科，2遵义医学院检验系，结论 血小板抗体的产生与血小板输注疗效密切相关，血小板抗体
18、是直接影响血小板输注效果 的重要免疫因素之一；血液病患者的病因与血小板抗体的产生有一定相关性；血小板抗体的产生与患者性别无关；血小板输注次数与血小板抗体产生密切相关：血小板抗体的产生与输注的血小板种类有关，单采组明显低于浓缩组。医学检验 2013年8月第2O卷第22期,流式细胞技术检测血小板相关抗体在ITP诊断中的应用研究吴国才，王珍(广东医学院附属医院 血液内科，广东 湛江 524001)摘要：目的 探讨流式细胞技术检测血小板相关抗体在ITP诊断中的意义。方法 选择2012年5月至2013年6月在我院血液科住院的3O例ITP患者为观察组,同期本院健康体检正常者3O例为对照组，采用流式细胞技术
19、检测两组对象的外周血血小板相关抗体PAIg(PAIgG、PAIgM、PAIgA)水平。结果FCM检测观察组患者血小板抗体，PAIgG阳性率为7O,平均荧光强度为(25.154-2.61)，对照组平均荧光强度为(5.09士0.54),两组比较有显著性差异(P 0.05)。结论 流式细胞仪检测血小板相关抗体 在ITP诊断中具有重要的临床意义 中国实验诊断学 2O14年6月第18卷第 6 期,自身免疫性疾病的辅助诊断,许多药物会导致血小板减少，常见的有肝素、奎宁、奎尼丁等，均会诱导产生药物依赖性血小板抗体，从而产生血小板减少症。药物性抗体产生的机制尚不完全明了。目前认识的产生机制主要有：免疫复合物机
20、制：药物与抗体结合形成免疫复合物，与血 小板上的Fc受体结合，介导血小板的破坏。半抗原机制：药物小分子与血小板膜蛋白结合，形成新的 抗原，刺激免疫系统产生抗体，从而破坏血小板。,药物性抗体检测,可能产生药物性抗体的用药：抗生素类：头孢他啶、头孢曲松、磺胺类、万古霉素镇痛剂：芬太尼、布洛芬、对乙酰氨基酚消化系统用药：雷尼替丁、心血管系统用药：ACEI、阻滞剂抗肿瘤药：奥沙利铂,2.MF Leach.Detection of drug-dependent platelet antibodies by use of solid-phase red cell adherence assay.Briti
21、sh Journal of haematology,1997,97,755-761.,1.Alan D.Michelson Platelets,Third Edition，Chapter 42,药物性抗体检测,怀疑患者因应用药物而导致血小板减少症时，应准备相应的药物。如果为液体剂型，可以直接使用。如果为固体剂型，需要将其破碎、溶解于蒸馏水中。对于免疫复合物机制，可以将药物直接加入待检标本中；对于半抗原机制，可将其加入0.5%缓冲液中。检测时加入药物的浓度，应参照相应药物的药代动力学数据，选用下列三个浓度：1.略低于谷浓度 2.峰浓度 3.峰浓度的5-10倍。,药物性抗体检测,对照标本与血小板,
22、无药物性血小板减少症的健康人标本，作为本实验的对照标本。,4-6人份混合，O型血小板。该血小板与待检血小板做配型实验，结果应为阴性。,药物性抗体检测,每一个标本使用三条试剂，一条用于免疫复合物机制，两条用于半抗原机制。,PC,NC,免疫复合物机制,半抗原机制,对 照 标 本,阳 性 对 照,阴 性 对 照,检 测 标 本,药物性抗体检测,操作步骤：免疫复合物机制,1.将血小板包被在微孔板上，洗板3次2.加入两滴低离子强度溶液3.加入两滴已加入不同浓度药物的待检标本（同时加入不添 加药物的待检标本作为对照）4.向阳性对照、阴性对照对照孔中分别加入试剂盒中的阳性 对照、阴性对照5.37气育45分钟
23、6.洗板5次7.立即加入抗人IgG及指示红细胞，混匀8.离心，观察结果,药物性抗体检测,操作步骤：半抗原机制,1.将血小板包被在微孔板上，洗板3次2.加入两滴低离子强度溶液3.加入三滴已加入不同浓度药物的BSA溶液4.37气育30分钟5.洗板3次6.向相应孔中加入两滴低离子强度溶液，待检标本、对照表本；阳性对照、阴性对照对照孔中分别加入试剂盒中的阳性对照、阴性对照（每种药物浓度均做阳性对照、阴性对照）7.37气育45分钟8.洗板5次9.立即加入抗人IgG及指示红细胞，混匀10.离心，观察结果,药物性抗体检测,总 结,1.血小板表面有复杂的抗原系统，能够刺激机体产生相应的抗体，导致自身免疫性疾病、不良输血反应、NAIT、流产等疾病。,2.血小板抗体检测对评估常规输血中非溶血性输血反应发生的风险，保障输血安全具有重要意义，同时可响应国家精准输血的号召，节约血液资源，合理控费。,3.血小板抗体检测对诊断NAIT、评估胎母血小板血型不合导致的流产、死胎风险有重要意义。,Thank You!,
