1、ISO标准沙门氏菌检测的基准方法国际标准 ISO 6579食品和动物饲料的微生物学 沙门氏菌检测的基准方法内容1 范围2 参考标准3 定义4 原理4.1 概要4.2前增菌非选择性液体培养基4.3 增菌选择性液体培养基4.4 划平板和鉴定4.5 确认5 培养基、试剂和血清5.1 概要5.2 培养基和试剂5.3 血清6 设备和玻璃器皿7 采样8 检验样品的制备9 程序9.1 试验样品和原始悬浮液9.2 非选择性前增菌9.3 选择性增菌9.4 划平板和鉴定9.5 确认10 结果表示11 检验报告12 质量保证附录A （标准化）程序图表附录B （标准化）培养基和试剂的成份及准备附录C （非标准化）实验
2、室间试验结果参考书目前言ISO（国际标准化组织）是国际标准化团体的全世界同盟。通常由ISO技术委员会来执行国际标准的制订工作（ISO成员体）。通常由ISO技术委员会来完成国际标准的准备工作。在委员会中，若对建立的技术委员会有兴趣的话，每个成员体有权作为代表。国际组织、政府或非政府组织，通过ISO联系，也可以参加这项工作。在所有电工标准方面，ISO与国际电工委员会（IEC）紧密合作。国际标准按照ISO/IEC指南第三章所列的规则草拟。 技术委员会的主要任务是准备国际标准。被技术委员会采用的国际标准草案以投票方式在成员体内运行。至少要75%成员体的投票赞成，才能作为一个国际标准发布。要引起注意的可
3、能性是:本国际标准的一些要素可能是专利权主体。ISO不应承担鉴定部分或全部的这种专利权。ISO6579是由食品ISO/TC34技术委员会、微生物SC9分委员会所准备的。第四版删除或更换了第三版（ISO6579：1993），并已作了技术性修订。附录A和附录B形成了本国际标准的标准化部分。附录C仅为资料。 介绍因为有大量的不同种类的食品和饲料产品，本基准方法可能对某些产品并不完全适用,而另一些产品可能得用到其他方法。既然这样，如果为论证技术上的原因而绝对需要时，那么就可使用这些产品指定的不同方法。不过，应尽可能地使用本基准方法。在下一次审查这个国际标准时，我们会考虑所有有用关于这些指标所涉及的范围
4、内以及个别产品不遵照这些指标的原因的信息。(产品的)检测方法无法在短时间内达到统一,而且,对于某些产品,可能已经有与本基准方法不符的国际标准/或国家标准存在。但是我们希望,在以后审查这些标准时能进行修改,使其同本国际标准保持一致,以保证除了因技术原因确实需要外不会发生背离本基准方法的情况.微生物学检测沙门氏菌方法的通用指南警告为了保护实验室工作人员的身体健康，在适当装备的实验室、在熟练的微生物学家的控制下检测沙门氏菌、特别是伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌，这是非常关键的。另外最要关注的是所有培养物的处置。1 范围本国际标准详述了沙门氏菌的基准方法，包括伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌。在绪论中受讨论
5、的局限性，本国际标准适用于供人类消费或动物饲养所使用的产品。 在食物生产和处理范围内的环境样品。警告本方法并不包括所有的伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌。2 标准的参考资料 通过本文中的参考目录，下列标准化文件包含组成本国际标规定的条款。对后来更正或修订的陈旧参考资料，这些条款并不适用。然而，鼓励那些基于赞同本国际标准的成员，去调查下面提到的大多数新版标准化文件应用的可能性。对更新的参考资料，最新版的标准化文件作了参考应用。ISO和IEC的成员保持对现行有效国际标准的注册。ISO6887-1，食品和动物饲料的微生物学微生物检验中测试样品、原始悬浮液及十倍稀释液的制备第一章：原始悬浮液和十倍稀释液制
6、备的通用规则ISO 7218：1996，食品和动物饲料的微生物学微生物检验的通用规则ISO 8261，牛奶及奶制品微生物检验中测试样品、原始悬浮液及十倍稀释液制备的通用指南3 术语和定义应用下列定义来表达本国际标准的用途。3.1 沙门氏菌：在选择性培养基上形成典型或少典型的菌落，当依照本国际标准进行试验时，它们表现出特有的生化反应和血清学特征的微生物。3.2 沙门氏菌检测：当依照本国际标准进行试验时，在一定重量或体积的产品中，测定这些沙门氏菌的存在与否。4 原理4.1 概要沙门氏菌检测需四个连续阶段（也可以见附录A）注 沙门氏菌可能少量存在，并经常伴随着相当数量的其它肠杆菌属或其它菌属。因此，
7、选择性增菌是必需的；此外，为尽可能地检测到受伤沙门氏菌，经常需要进行前增菌。4.2 前增菌非选择性液体培养基 将试验部分接种于缓冲蛋白胨水，在371培养18h2h。对于某些食品，则需利用其它的前增菌程序，见9.1.2。数量比较庞大时，在接种测试样品前应将缓冲蛋白胨水加热到371。4.3 增菌选择性液体培养基 将4.2得到的培养物接种到RVS肉汤和MKTTn肉汤。RVS肉汤在41.51孵育24h3h，MKTTn肉汤在371孵育24h3h。4.4 划平板和鉴别从4.3中获得的培养物接种于两种选择性固体培养基上。木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD琼脂）对XLD琼脂的任何其它补充性的选择性培养基，特别是适
8、合于分离乳糖阳性的沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌的培养基，实验室可以选择使用。XLD琼脂在371孵育，在24h3h后检查结果。第二种选择性琼脂按照厂家说明书进行孵育。注 作为资料，亮绿琼脂、亚硫酸铋琼脂等，可用作第二种平板划线培养基。4.5 确认挑选可疑沙门氏菌的菌落进行次培养，再按4.4所描述的划线分离，通过适当的生化试验和血清学试验加以证实。5 培养基、试剂和血清5.1 概要供常规实验室使用，见ISO 7218。5.2 培养基和试剂注 由于培养基和试剂的数量庞大，为了表述清晰，我们认为将它们的组成和配制在附录B中列出更适当。5.2.1 非选择性前增菌液：缓冲蛋白胨水见B.15.2.
9、2 第一种选择性增菌液：RVS肉汤见B.25.2.3 第二种选择性增菌液：MKTTn肉汤见B.35.2.4固体选择性平板培养基5.2.4.1 第一种培养基：木糖赖氨酸去氧胆酸盐琼脂（XLD琼脂）见B.45.2.4.2 第二种培养基第二种培养基的选择是留给检测实验室自定。在它的准备使用时应准备按厂家说明书准确执行。5.2.5 营养琼脂见B.55.2.6 三糖/铁琼脂（TSI 琼脂）见B.65.2.7 尿素琼脂（Christensen） 见B.75.2.8 L-赖氨酸脱羧酶培养基见B.85.2.9 -半乳糖苷酶检测试剂（或依照厂商说明书使用的比色盘） 见B.95.2.10 V-P反应试剂见B.10
10、5.2.11 吲哚反应试剂见B.115.2.11.1 半固体营养琼脂见B.125.2.13 生理盐水溶液见B.135.3 血清含有一种或多种O抗原的多价血清型可由商品化获得，也就是包含一个或更多个O群抗血清（称单价或多价抗O血清），抗Vi血清和含有一个或多个H因子的抗血清（称单价或多价抗菌素H血清）。应确保所用的抗血清足以检测所有的沙门氏菌血清型。6 设备和玻璃器皿如果操作规范，对于可重复使用的玻璃器皿，重复使用是可以接受的。通常或特殊情况下微生物实验室设备（见ISO 7218）如下：6.1 干灭菌（烘箱）或湿灭菌（高压灭菌器）设备见ISO 72186.2 干燥柜或烘箱，通过对流通风，能在37
11、1和551之间调节温度。6.3 培养箱，能调节温度至351或371。6.4 水浴，能调节温度至41.51，或孵育，能调节温度至41.51。6.5水浴，能在44-47间调节温度。6.6水浴，能调节温度至371。由于沙门氏菌的低传染性，推荐使用含有抗菌剂的水浴锅（6.4、6.5和6.6）。6.7 灭菌环，直径约为3mm或10l的灭菌吸管。6.8 pH计，要求在20-25时精确校准到0.1单位。6.9适当容量的试管或烧瓶可以使用带无毒金属或塑料螺旋帽的试管或烧瓶6.10 分别以0.5ml和0.1ml间隔标示，容量为10ml和1ml的刻度吸管或自动吸管。6.11 小规格（直径为90mm-100mm）和
12、/或大规格（直径为140mm）的皮氏培养皿。7 制样实验室收到具有代表性的，且在运输或贮存过程中没有损坏或改变的样品是非常重要的。制样不是本国际标准指定方法的一部分。可参见处理相关产品的特定国际标准。如果没有特定国际标准，可推荐这一方面已被公认的相关部分。8 测试样品的制备根据处理相关产品的特定国际标准来制备测试样品。如果没有特定国际标准，可推荐这一方面已被公认的相关部分。9 程序（见图附录A）9.1 测试样品和原始悬浮液9.1.1 概要特定的国际标准处理相关的产品，见ISO 6887-1。牛奶及奶制品见ISO 8261。准备原始悬浮液，通常用5.2.1和4.2（缓冲蛋白胨水）指定的前增菌培养
13、基作为稀释液。如果指定测试样品的重量超过25g，则需用一定量的前增菌液做约1：10稀释。为减少检测工作量，当检测指定食品中超过25g样品时，或有证据表明混合物（将测试样品堆聚）不会影响到特殊食品的检测结果时，则样品可以混合测定。例如，如果要测定10份25g的样品，则各取10份样品混合形成一个250g混合测试样品，加入2250ml前增菌肉汤。另外，还可从10份单独测试样品（9.3.1）的前增菌液中取0.1ml（10mlRVS肉汤）和1ml（10mlMKTTn肉汤）混合加入到100ml选择性增菌液中进行增菌培养。9.1.2 某些产品原始悬浮液的特殊制备注 下列特殊的制备仅涉及沙门氏菌的情况。在IS
14、O 6887-2、ISO 6887-3、ISO 6887-4和ISO 8261中描述了适用于其它病原微生物检测的特殊制备。9.2 非选择性前增菌液将原始悬浮液（9.1）于371孵育18h2h。9.3 选择性增菌液9.3.1 将9.2获得的培养物0.1ml接种到含有10mlRVS肉汤（5.2.2）的试管中；另取9.2获得的培养液1ml接种到含有10mlMKTTn肉汤（5.2.3）试管中。9.3.2 接种的RVS肉汤（9.3.1）于41.51孵育24h3h；接种的MKTTn肉汤于371孵育24h3h。引起注意的是不得超过最高允许的孵育温度（42.5）9.4 划线和鉴定9.4.1 在孵育24h2h后
15、，取RVS肉汤（9.3.2）培养物一环（6.7）接种于含有第一种选择性平板培养基（XLD平板，见5.2.4.1）的大规格皮氏培养皿表面，以便获得好的单个菌落。若缺少大的培养皿，则可采用两个小的培养皿，用相同的接种环一个接着一个地划平板。用消毒过的接种环和皮氏培养皿象上面一样按相同的步骤接种于第二种选择性平板培养基（5.2.4.2）。9.4.2 在孵育24h3h后，用MKTTn肉汤（9.3.2）培养物，重复9.4.1描述的步骤接种于两种选择性平板培养基上。9.4.3 倒置培养皿（9.4.1和9.4.2）使底部在最上面，将第一种选择性培养基（5.2.1）放在设定为37的培养箱内。第二种选择性培养基
16、（5.2.4）则按照生产厂家的说明书执行。9.4.4 在孵育24h3h后，检查平板（9.4.3）上存在的沙门氏菌的典型菌落或可能是沙门氏菌非典型菌落（见注）。在培养皿的底部标示它们的位置。在XLD平板生长的沙门氏菌典型菌落是中心一个黑点，周围由于指示剂颜色的改变而出现淡红色的轻微透明带。注 H2S阴性的变种沙门氏菌在XLD平板上长成粉红色菌落，中间是暗红色。在适当的温度下培养第二种选择性平板培养基，经过适当的时间，通过它们的特征，检查并核对被认为可疑沙门氏菌菌落的存在。9.5 确认9.5.1 概要如果显示是可靠的，那么，可以使用商业化的可供沙门氏菌生化试验用的鉴别试剂盒。鉴别试剂盒的使用关系到
17、菌落的生化确认。这些试剂盒应在生产厂商的说明书指导下使用。注 辨认沙门氏菌菌落，在很大程度上依靠经验，它们外表各有不同，不仅是种与种之间，每批培养基之间也有不同。9.5.2 确认菌落的选择为了确认，从每个选择性培养基的第个培养皿上挑取至少一个被认为典型的中可疑的菌落，如果第一种选择培养基为阴性，则需挑选4个菌落以上。在流行病学研究的情况下，建议至少有五个菌落需被鉴别。如果一个培养皿上少于五个典型的或可疑的菌落，则取所有典型的或可疑的菌落做确认。用一种便于好的单个菌落形成的方式在预先干燥的营养琼脂平板表面上划经挑选的菌落。将接种的平板（9.4.3）在371孵育24h3h。用纯培养物进行生化试验和
18、血清学确认。9.5.3 生化确认9.5.3.1 概要用接种针，将9.5.2所选菌落的每个培养物接种于9.5.3.2至9.5.3.7指定培养基。9.5.3.2 TSI琼脂（(5.2.6)先在TSL琼脂斜面上划线，再于底层穿刺。在371孵育24h3h。在培养基上颜色变化的解释如下：a）底部黄色 葡萄糖阳性（葡萄糖被利用）红色或未变 葡萄糖阴性（葡萄糖未被利用）黑色 硫化氢形成气泡或裂缝 葡萄糖产气b）斜面黄色 乳糖和/或蔗糖阳性（乳糖和/或蔗糖被利用）红色或不变色 乳糖和/或蔗糖阴性（乳糖和蔗糖均不被利用）典型的沙门氏菌培养物显示碱性（红色）斜面和酸性（黄色）底部，伴随着产气（气泡）和（约90%情
19、况下）硫化氢产生（琼脂变黑）（9.5.3.8）。当分离到乳糖阳性的沙门氏菌时，TSI的斜面是黄色的。因此，沙门氏菌培养物的初步确认并不能仅仅根据TSI琼脂试验的结果。9.5.3.3 尿素琼脂（5.2.7）在琼脂斜面上划线。在371孵育24h3h，间隔一定时间检查。如果反应是阳性，尿素裂解释放氨，其颜色由酚红变成玫瑰红，最后变成深樱红色。反应通常在2h-4h后可见。9.5.3.4 L-赖氨酸脱羧酶培养基（5.2.8）接种于液体培养基表面以下，在371孵育24h3h。培养后出现混浊及出现紫色表明为阳性反应。黄色表明阴性反应。9.5.3.5 -牛乳糖试验取满环可疑菌落放于含有0.25ml生理盐水的试
20、管中。加1滴甲笨并摇匀。把试管放入37水浴（6.6），保持几分钟（约5分钟）。加0.25ml检测-牛乳糖的试剂，混匀。再将试管放入37水浴，保持24h3h，间隔一定时间检查试管。黄色表明为阳性反应。反应通常在20分钟后可见。如果用准备好的纸片（5.2.9），则按照生产厂商的说明书操作。9.5.3.6 V-P反应培养基取满环可疑菌落放于含有3mlVP培养基的灭菌试管中。在371孵育24h3h。孵育后，加入2滴肌氨酸溶液，3滴1-萘酚-乙醇液，随后加入2滴氢氧化钾溶液；每种试剂加完后要摇匀。15分钟内颜色由粉红变为鲜红表明阳性反应。9.5.3.7 吲哚反应培养基将可疑菌落接种于含有5ml的胰蛋白胨
21、/色氨酸培养基的试管中。在371孵育24h3h。孵育后，加1ml Kovacs 试剂。出现红色环表明阳性反应。黄褐色环表明阴性反应。9.5.3.8 生化试验的解释常见沙门氏菌出现的反应结果见表1。9.5.4 血清学确认和血清型9.5.4.1 概要在消除自凝现象后，用适当的血清通过玻片凝集试验对纯菌落（9.5.2）检测沙门氏菌O抗原、Vi抗原和H抗原的存在。如果与以下描述有差异的话，则按照产品说明书使用抗血清。9.5.4.2自凝现象的消除放一滴生理盐水（5.2.13）于仔细清洁过的玻片上。用接种环挑取部分被测菌落并将水滴打散，以获得均一混浊的悬浮液。注 将部分被测菌在一滴水打散，然后用一滴生理盐
22、水（5.2.13）与它混匀，这也是可能的。轻轻摇动玻片30s-60s。在暗背景下观察结果，用放大镜更好。如果细菌凝集成或多或少的明显块状，则可认为是自凝集，那么按照下列方法进行沙门氏菌的抗原测定是不可行的。9.5.4.3 O-抗原测定用一个无自凝集的纯菌落，用一滴抗O血清（5.3）代替生理盐水（5.2.13），按9.5.4.2步骤操作。如果出现凝集，则认为该反应为阳性。用多价和单位血清接连凝集。9.5.4.4 Vi-抗原测定按9.5.4.2步骤操作，但用一滴抗Vi血清代替生理盐水。如果出现凝集，则认为该反应为阳性。试 验a（9.5.3.2-9.5.7）沙门氏菌属伤寒沙门氏菌A型副伤寒沙门氏菌B
23、型副伤寒沙门氏菌C型副伤寒沙门氏菌其它菌属反应%b反应% b反应% c反应% c反应% bTSI葡萄糖产酸+100+100+100TSI葡萄糖产气- d0+100+92TSI乳糖产酸-2-100-1TSI庶糖产酸-0-0-1TSI硫化氢产生+97-10+92尿素水解-0-0-1赖氨酸脱羧酶+98-0+95-牛乳糖反应-0-0-2 eV-P反应-0-0-0吲哚反应-0-0-1a 来源于参考资料5b 这些百分率表明并不是所有分离到的沙门氏菌血清型都会显示出+或-的反应结果。在食物中毒不同部位间或食物中毒里面所分离出的沙门氏菌血清型，其百分率是可以变化的。c 这些百分率不能从现有的文献中获得。d 伤
24、寒沙门氏菌不产气。e 亚利桑那亚型肠炎沙门氏菌为乳糖阳性或阴性反应，但通常-牛乳糖为阳性反应。为便于这些菌属的研究，执行补充试验可能很有用处。表1 生化试验的解释9.5.4.5 H-抗原测定将纯的无自凝集的菌落接种于半固体营养琼脂。在371孵育24h3h。用此培养物来检测H-抗原，按9.5.4.2步骤操作，但用一滴抗H血清代替生理盐水。如果出现凝集，则认为该反应为阳性。9.5.5生化和血清学反应的解释表2给出的是所用菌落（9.5.2）完成确认试验（9.5.3和9.5.4）的解释。表2确认试验的解释生化反应自凝集血清学反应解释典型的无O-，Vi-或H-抗原阳性考虑是沙门氏菌典型的无所有反应为阴性
25、典型的有未做（见9.5.4.2）可能是沙门氏菌不典型反应无/有O-，Vi-或H-抗原阳性不典型反应无/有所有反应为阴性排除沙门氏菌9.5.6最后确认被考虑为沙门氏菌，或可能是沙门氏菌（见表2）的菌落，应送公认的沙门氏菌参比中心做最后的血清型确认。送确认时应同时附上关于此菌的所有尽可能多的信息，以及是一次爆发流行还是在食物中。10 结果表达与解释的结果相一致，揭示g或ml测试样品中是否存在沙门氏菌。多实验室间的试验所获得的精密数据见附录C。11 测试报告测试报告应详细说明：制样方法，如果知道的话；试验过程中任何增菌液或孵育条件的偏离；所有非本国际标准指定的操作条件，或者被认为可选择的、和可能影响
26、结果的任何事件的细节；得到的结果；测试报告也应该声明得到的阳性结果是仅用了划线培养基（5.2.4）而不是本国际标准指定的方法。12 质量保证为检查实验室用本国际标准描述的方法和培养基来检测沙门氏菌的能力，提出参考样品加入含前增菌液的质控瓶中。对质控瓶的检测过程与测试样品培养相一致。附 录 A（标 准 化）检测程序图371孵育（9.2）18h2h在温度下的蛋白胨水缓冲溶液XLD培养基和选择第二种琼脂（9.4.1）371孵育24h3h划平板从每块平板上检测一个特征菌落，如果阴性，检测所有明显的菌落（9.5.2）营养琼脂，371孵育24h3h（9.5.2）结果表示（条款10）附 录 B（标准化）培养
27、基和试剂的组织和制备B.1 缓冲蛋白胨水B.1.1 成份酷蛋白消化酶 10.0gNaCl 5.0gNa2HPO412H2O 9.0gKH2PO4 1.5g水 1000mlB.1.2 制备将上述成分溶解于水，如需要可以加热。如需要，调节pH值，以便在消毒后25下pH值为7.00.2。分装培养基于适当容量的烧瓶中，以便满足实验的需要。置于高压灭菌锅中121灭菌15分钟。B.2 RVS肉汤B.2.1 溶剂AB.2.1.1 成份大豆消化酶 5.0gNaCl 8.0gKH2PO4 1.4gK2HPO4 0.2g水 1000mlB.2.1.2 制备将上述成分溶解于水，如需要可以加热到70左右。溶液在完全R
28、VS培养基制备时应已经准备就绪。B.2.2 溶剂BB.2.2.1 成份MgCl 212H2O 400.0g 水 1000mlB.2.2.2 制备将氯化镁溶于水中。由于氯化镁容易吸湿，依据相关公式，可取整个的MgCl.6H2O溶解于新开的容器内。例如，250gMgCl.6H2O加入625ml的水，得到一个总体积为788ml的溶液，MgCl.6H2O的重量浓度约为31.7g/100ml。B.2.3 溶剂CB.2.3.1成份孔雀绿草酸盐 0.4g水 100mlB.2.3.2制备将孔雀绿草酸盐溶于水中。溶液置于棕色瓶中，室温保存至少8个月。B.2.4完全培养基B.2.4.1 成份溶液A（B.2.1）
29、1000ml溶液B（B.2.2） 100ml溶液C（B.2.3） 10mlB.2.4.2 制备加入1000ml溶液A、100ml溶液B、10ml溶液C。如需要，调节pH，以便在灭菌后pH值为5.20.2。使用前，用10ml量分装试管。置高压灭菌锅中115灭菌15分钟。已配好的培养基于32保存。隔天使用该培养基。注 最终培养基成分是：大豆消化酶，4.5g/l；氯化钠，7.2g/l；磷酸二氢钾（KH2PO4+K2HPO4），1.44g/l； MgCl2，13.4g/l或MgCl212H2O，28.6g/l；孔雀绿草酸盐，0.036g/l。B.3 MKTTn肉汤7B.3.1 基础培养基B.3.1.1 成份肉浸膏 4.3g酷蛋白消化酶 8.6gNaCl 2.6gCaCO3 38.7gNa2
