1、食品中沙门氏菌检验操作规范已完食品中沙门氏菌检验操作规范(已完)食品中沙门氏菌检验操作规范1 检验依据本方法参照GB4789.4-2010食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 冰箱：2 5 。2.2 恒温培养箱：36 1 ，42 1 。2.3 均质器。2.4 振荡器。2.5 电子天平：感量0.1 g。2.6 无菌锥形瓶:容量500 mL，250 mL。2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。2.8 无菌培养皿：直径90 mm。2.9 无菌
2、试管：3 mm50 mm、10 mm75 mm。2.10 无菌毛细管。2.11 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。2.12 全自动微生物生化鉴定系统。3 培养基和试剂（按说明书配置或灭菌）3.1 缓冲蛋白胨水（BPW）；3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液；3.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液；3.4 亚硫酸铋（BS）琼脂；3.5 HE 琼脂；3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂；3.7 沙门氏菌属显色培养基；3.8 三糖铁（TSI）琼脂；3.9 蛋白胨水、靛基质试剂；3.10 尿素琼脂（pH 7.2）；3.11 氰化钾 （KCN） 培养基；3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基；3.1
3、3 糖发酵管；3.14 邻硝基酚-D 半乳糖苷（ONPG）培养基；3.15 半固体琼脂；3.16 丙二酸钠培养基；3.17 沙门氏菌O 和H 诊断血清；3.18 生化鉴定试剂盒。4 检验程序沙门氏菌检验程序见图1。图1 沙门氏菌检验程序5 操作步骤5.1 前增菌称取25 g（mL）样品放入盛有225 mL BPW 的无菌均质杯中，以8 000 r/min10 000 r/min 均质1 min2 min，或置于盛有225 mL BPW 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH 值，用1 mol/mL 无菌NaOH 或HCl 调pH
4、 至6.80.2。无菌操作将样品转至500 mL 锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36 1 培养8 h18h。如为冷冻产品,应在45 以下不超过15 min,或2 5 不超过18 h 解冻。5.2 增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL，转种于10 mL TTB 内，于42 1 培养18 h24h。同时，另取1 mL，转种于10 mL SC 内，于36 1 培养18 h24 h。5.3 分离分别用接种环取增菌液1 环，划线接种于一个BS 琼脂平板和一个XLD 琼脂平板（或HE 琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36 1 分别培养18 h24 h （XLD 琼脂平板、HE
5、琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板） 或40 h48 h （BS 琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1。表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征5.4 生化试验5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36 1 培养18 h24 h，必要时可延长至48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。表2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试
6、验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水 （供做靛基质试验）、尿素琼脂 （pH7.2）、氰化钾 （KCN） 培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36 1 培养18 h24 h，必要时可延长至48 h，按表3 判定结果。将已挑菌落的平板储存于2 5 或室温至少保留24 h，以备必要时复查。表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表5.4.2.1 反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶3 项中有1项异常，按表4 可判定为沙门氏菌。 如有2 项异常为非沙门氏菌。表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表5.4.2.2 反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏
7、菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。5.4.2.3 反应序号A3：补做ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。5.4.2.4 必要时按表5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。表5 沙门氏菌属各生化群的鉴别5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据5.4.1 的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。5.5 血清学鉴定5.5.1 抗原的准备一般采用1.21.5琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O
8、血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的 （如23） 培养基上再检查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了O 凝集反应时，可挑取菌苔于1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时，将菌株接种在0.550.65半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.30.4半固体琼脂的小玻管1 次2次，自远端取菌培养后再检查。5.5.2 多价菌体抗原（O）鉴定在玻片上划出2 个约1 cm2 cm 的区域，挑取1 环待测菌，各放1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1 滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1 滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。5.5.3 多价鞭毛抗原（H）鉴定同5.5.2。6 结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。
