1、铁皮石斛转录因子基因DoWRKY1的克隆与表达分析铁皮石斛转录因子基因DoWRKY1的克隆与表达分析 摘要WRKY转录因子是植物中发现的新型转录调控因子，在调控植物生长发育和代谢等生理过程中发挥重要作用。该研究采用RT-PCR和RACE技术从铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆得到一个新的WRKY转录因子基因cDNA全长，命名为DoWRKY1，提交GenBank获得登录号KF716131。生物信息学分析表明，该基因全长cDNA为1 704 bp，其中开放阅读框 （ORF） 1 629 bp，编码1条由542个氨基酸组成的多肽，具有2个WRKY保守结构域，属于WRKY家族第类
2、转录因子。酵母单杂交表明，DoWRKY1可以激活下游报告基因 （His3，Ade2） 的表达，具有转录激活功能，属于转录激活子。半定量RT-PCR显示，DoWRKY1在根、茎、叶和类原球茎中均有表达。qRT-PCR分析表明，DoWRKY1响应茉莉酸甲酯 （MeJA） 和壳聚糖 （chitosan） 诱导，分别在2 h和1 h，表达量达到最高峰。研究结果为进一步研究其在铁皮石斛次生代谢过程的调控功能奠定基础。 关键词铁皮石斛;WRKY转录因子;基因克隆;转录激活;表达分析 Cloning and expression analysis of transcription factor gene D
3、oWRKY1 in Dendrobium officinale ZHAO Jun， SUN Shi-wei， MENG Can-can， JIN Qing， FAN Hong-hong， LIN Yi， CAI Yong-ping* （School of Life Sciences， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China） AbstractWRKY transcription factors are novel transcriptional regulatory factors， which play an important
4、role in regulating plant development， metabolism and other physiological processes. In this study， a new Dendrobium officinale WRKY transcription factor， designated as DoWRKY1 was cloned by using RT-PCR and RACE （GenBank Accession No. KF953910）. Bioinformatic analysis demonstrated that， the full-len
5、gth cDNA of DoWRKY1 was 1 704 bp. And DoWRKY1 contained a 1 629 bp open reading frame （ORF） that encoding a peptide of 542 amino acid residues. The putative DoWRKY1 protein contained two conserved WRKY domains and it belonged to the groupWRKY family protein. Yeast one-hybrid experiment showed that D
6、oWRKY1 had transcriptional activation ability in yeast， and it could activate the expression of downstream report genes （His3 and Ade2）. Semi-quantitative RT-PCR experiment showed that DoWRKY1 expressed in roots， stems， leaves and protocorm-like bodies. Real-time qRT-PCR proved that DoWRKY1 could be
7、 induced by methyl jasmonate （MeJA） and chitosan （Chitosan）， and the expression level of this gene can reach the expression peak at 2 h and 1 h， respectively. These results are useful for further determination of the regulation function of this gene in secondary metabolism of D. officinale. Key word
8、sDendrobium officinale; WRKY transcription factor; gene cloning; transcription activation; expression analysis doi：10.4268/cjcmm20151423 铁皮石斛Dmdrobitm officinale Kimura et Migo又名黑节草，为兰科Orchidaceae石斛属Dendrobium Sw. 多年生草本植物，是我国药用石斛中的珍品。铁皮石斛因富含多糖、芪类、生物碱类、氨基酸类、微量元素等多种有效成分，在增强免疫与刺激造血、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳和降血糖等方面具有
9、显著功效<sup>1-3</sup>。近年来，对铁皮石斛萜类代谢途径的研究成为热点<sup>4-5</sup>。然而，植物萜类代谢途径是由多种酶参与的多步反应，受发育、环境等因素的影响，仅对单个基因进行修饰有时难以奏效。随着后基因组工作的深入，转录因子以其独有的“多点调控”优势常作为调控植物代谢途径的重要工具。在众多的转录因子中，WRKY转录因子是近年来发现的一种新型转录调控因子，因其在N 端含有 WRKYGQK组成的高度保守氨基酸序列而得名，它在植物生长发育和代谢等生理过程<sup>6</sup>和非生物信号刺激<
10、sup>7-8</sup>中都发挥重要作用。 本研究通过克隆铁皮石斛DoWRKY1转录因子基因全长cDNA，利用生物信息学对其序列的结构和功能进行初步预测分析，丰富WRKY家族数据库;通过酵母单杂交对DoWRKY1的转录激活活性进行分析;同时，采用半定量RT-PCR分析DoWRKY1的表达谱;实时荧光定量PCR（quantitative Real-time PCR）分析DoWRKY1对茉莉酸甲酯（MeJA）和壳聚糖的响应情况，以期为后续深入研究DoWRKY1的功能奠定一定的理论基础。 1材料 1.1植物样品及处理铁皮石斛试管苗，取自安徽农业大学生命科学学院植物组织培养室，经安
11、徽农业大学蔡永萍教授鉴定为铁皮石斛D. officinale。选取生长健壮的试管苗用于总RNA提取及cDNA合成，用于基因克隆;在液氮处理下，分离整株苗的根、茎和叶，并取铁皮石斛类原球茎（protocorm-likebodies， PLBs）<sup>9</sup>为材料，用于半定量实验;选取长势相同的试管苗，经100 mol?L-1茉莉酸甲酯（MeJA）和150 mg?L-1壳聚糖处理后，用于qRT-PCR分析实验。 1.2菌株、载体和试剂植物总RNA提取试剂盒、FastQuant RT Kit（With gDNase）反转录试剂盒购自TIANGEN公司（TIANGE
12、N，中国北京）;SMARTer RACE cDNA Amplification Kit试剂盒购自Clontech公司（Clontech，美国）;TransStart Tip Green qPCR SuperMix购自全式金生物技术有限公司（TransGen Biotech，中国北京）;pMD18-T基因克隆试剂盒、限制性内切酶（BamH， Xho ， Nde， Pst）、T4连接酶等均购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa，中国大连）;大肠杆菌DH5菌株、酵母菌株AH109、酵母效应载体pGBKT7均由本实验室保存;质粒DNA小量抽提试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份
13、有限公司（Sangon Biotech，中国上海），引物和测序也由该公司完成。 2方法 2.1RNA提取和cDNA合成按照植物总RNA提取试剂盒说明书提取铁皮石斛的总RNA，用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher，USA）分析RNA的质量、纯度，再经琼脂糖凝胶电泳检测完整性。按照FastQuant RT Kit（With gDNase）反转录试剂盒说明书将提取的总RNA反转录成cDNA第一链，-20 储存。 2.2DoWRKY1基因的克隆根据GenBank上其他植物WRKY蛋白的保守结构域设计简并引物DoWRKY1-F，DoWRKY1-R（表1），以铁皮石斛的cDN
14、A为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系（25 L）为：10Easy Taq Buffer 2.5 L，dNTPs（2.5 mmol?L-1）2.0 L，上、下游引物（10 mol?L-1）各1.5 L，Easy Taq DNA聚合酶（5 U?L-1）0.25 L，补充ddH2O至25 L。 PCR扩增程序如下：94 预变性5 min，32个循环（94 变性45 s，51 退火30 s，72 延伸45 s），72 延伸10 min。产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化目的条带，连接到pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5，将PCR验证的阳性克隆送上海生工完成测序。 根据测序结果，利用Pr
15、imer Premier 5.0 软件设计3RACE和5RACE反应所需引物：3-RACE Outer， 3-RACE Inter;5-RACE Outer，5-RACE Inter （表1）。3RACE和5RACE方法采用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit试剂盒说明书，进行PCR扩增。同样，产物经纯化回收后，将目的片段连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5，将PCR验证的阳性克隆送上海生工完成测序。最后，将测序结果进行拼接，利用NCBI在线工具ORF finder确定该全长序列的开放阅读框（open reading frame，ORF）。 根据DoWR
16、KY1的ORF，设计验证引物cds-F和cds-R，经PCR扩增，纯化回收，连接pMD 18-T载体，转化大肠杆菌DH5，将PCR阳性克隆送上海生工完成测序。 2.3DoWRKY1生物信息学分析利用NCBI网站 的BLASTp（http：/blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi）在线分析工具，对DoWRKY1编码的氨基酸序列进行相似性分析;采用DNAman软件对同源性较高的氨基酸序列进行比对、分析;用MEGA 5.0软件构建DoWRKY1的系统进化树，进行聚类分析。 2.4DoWRKY1转录激活功能分析根据DoWRKY1的ORF，设计带有酶切位点的引物Y-D
17、oWRKY1-F和Y-DoWRKY1-R（表1），经PCR扩增，纯化回收，产物和pGBKT7载体分别经Nde I和Pst I双酶切，酶切产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化后，用T4连接酶将目的片段连接pGBKT7载体，将PCR阳性克隆送上海生工完成测序。测序验证目的基因与BD（DNA-binding domain）融合表达的读码框正确后，采用PEG/LiAc法（相关步骤参考酵母转化手册Yeastmaker Yeast Transformation System 2）分别将pGBKT7-DoWRKY1及空载体pGBKT7转化酵母菌株AH109，然后分别涂布于SD/-Trp和SD/-Tr
18、p-His-Ade营养缺陷型培养基上，于30 培养23 d，观察酵母菌的生长情况。 2.5DoWRKY1表达模式分析根据已获得的DoWRKY1全长序列设计特异性引物Q-DoWRKY1-F，Q-DoWRKY1-R;以铁皮石斛18S rRNA （GenBank： KC465231.1）作为内参基因<sup>10</sup>，设计内参引物18S rRNA-F，18S rRNA-R，引物序列见表1，采用半定量RT-PCR分析DoWRKY1在铁皮石斛根、茎、叶和类原球茎中的表达模式。反应总体积为25 L，包括反转录产物2 L，10Easy Taq Buffer 2.5 L，dNT
19、Ps（2.5 mmol?L-1） 2.0 L，基因上、下游引物（10 mol?L-1）各1.5 L， Easy Taq DNA 聚合酶（5 U?L-1）0.25 L，补充ddH2O至25 L。PCR扩增程序如下：94 预变性5 min;94 变性45 s，60 退火30 s，72 延伸45 s，共25个循环;最后72 延伸10 min，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，实验设置3个生物学重复。 2.6DoWRKY1在茉莉酸甲酯（MeJA）和壳聚糖诱导下的表达分析取长势相同的铁皮石斛试管苗，分别经MeJA（100 mol?L-1）和壳聚糖（150 mg?L-1）处理0.5，1，2，4，6 h，以未
20、做处理的试管苗为对照。DoWRKY1荧光定量特异性引物和内参基因引物与上述半定量实验所用引物相同（表1），采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术分析DoWRKY1的相对表达情况。实验使用ABI7500荧光定量PCR仪，分别以不同处理的cDNA为样本，每个样本设置3个生物学重复，按照2-Ct（Ct=Ct目的基因-Ct18S rRNA）法<sup>11</sup>计算基因的相对表达量。反应体系：cDNA 2 L，上、下游引物各0.8 L，2TransStart Tip Green qPCR Super Mix 10 L，Passive Reference
21、Dye 0.4 L，补充ddH2O至20 L。PCR反应程序为 95 预变性30 s;95 变性5 s，60 退火34 s，共40个循环。 3结果与分析 3.1DoWRKY1基因的克隆利用引物DoWRKY1-F和DoWRKY1-R扩增得到2条特异性条带（图1-A），测序后分别得到长670，148 bp序列;采用3 RACE方法经两轮巢式PCR反应，扩增产生目的条带（图1-B），测序长555 bp;采用5 RACE方法，扩增出目的条带（图1-C），测序长790 bp;将特异性片段、3 RACE和5 RACE序列拼接获得DoWRKY1的cDNA全长为1 704 bp，利用NCBI在线工具ORF f
22、inder（http：/www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/gorf/）确定该基因的ORF为1629 bp，5-UTR长40 bp，3-UTR长35 bp。以cds-F和cds-R为引物，PCR扩增产生单一条带（图1-D），测序表明该序列与拼接序列结果一致，表明已成功获得DoWRKY1全长cDNA。 3.2DoWRKY1生物信息学分析经NCBI数据库中BLASTp检索，发现DoWRKY1与多种植物WRKY基因编码的氨基酸序列有较高的相似性。其中，DoWRKY1与海枣Phoenix dactylifera L.序列相似度最高，为60%，其次为非洲油棕Elaeis
23、guineensis Jacq和野大豆Glycine soja Sieb. et Zucc等，由此可以判断，实验所得到的基因属于WRKY家族基因，命名为DoWRKY1，同时将其提交GenBank获得基因登录号KF716131。 用DNAman软件将与DoWRKY1同源性较高的海枣（XP_008804160.1）、观赏灯笼椒（ABD65255.1）、非洲油棕（XP_010921056.1）、野大豆（KHN46110.1）和绒毛烟草（XP_009603221.1）编码的氨基酸序列进行多重对比，这些序列在188246位和362420位氨基酸之间各含有一个WRKY保守结构域和一个C2H2锌指结构（图2
24、），图2中双箭头所示位置。其中，都具有WRKYGQK七个高度保守的氨基酸残基，而N端锌指结构为C-X4-C-X22-H-X1-H，C端锌指结构为C-X4-C-X23-H-X1-H，表明该基因编码蛋白属于第I类WRKY转录因子。 利用MEGA5.0软件<sup>12</sup>，采用邻接法（Neighbour-joining，NJ），构建DoWRKY1与其他植物WRKY氨基酸序列的系统进化树，进行聚类分析，以1 000次回抽的置信度作置信分析（图3），可以看出各组、分枝及深部节点都有较高的置信度支持，说明聚类分析是成功的。该分析结果表明铁皮石斛DoWRKY1与海枣（XP_
25、008804160.1）、非洲油棕（XP_010921056.1）亲缘关系最近，可信度达99%。 3.3DoWRKY1转录激活功能分析酵母单杂交结果（图4）表明，含有pGBKT7和pGBKT7-DoWRKY1质粒的酵母菌能够在SD/-Trp单缺培养基中生长，说明表达载体已成功转入到酵母AH109中;在SD/-Trp-His-Ade三缺培养基中，含空载质粒pGBKT7的酵母菌不能生长，而含pGBKT7- DoWRKY1质粒的酵母菌能够正常生长，表明DoWRKY1在酵母中具有转录激活能力，能够激活下游报告基因His3和Ade2的表达，属于转录激活子。 3.4DoWRKY1表达模式分析半定量检测结果
26、（图5）表明，DoWRKY1在铁皮石斛不同部位（根、茎和叶）中均有表达，说明DoWRKY1广泛存在于铁皮石斛各个部位中，组织特异性不强。同时，DoWRKY1在类原球茎中的表达量与根、茎和叶的表达量相当，说明DoWRKY1在铁皮石斛不同生长时期均有表达，且表达水平差异不大。 糖（150 mg?L-1）胁迫处理后，DoWRKY1的表达量呈现不同的变化规律。经MeJA处理，DoWRKY1表达量呈现先上升，后下降的趋势（图6）。前1 h，表达量缓慢上升，差异显著（P<0.05）;处理2 h后，表达量迅速上升，达到峰值;4 h时，表达量小幅度下降，但仍维持在高水平，2，4 h的基因表达量与0 h相
27、比差异均达到极显著水平（P<0.01），6 h后，表达量迅速回落。 从图6中还可以看出，与MeJA不同，DoWRKY1在壳聚糖处理后，短时间内表达量就明显上升，在0.5 h时，表达量与0 h相比差异极显著（P<0.01）;然后迅速升高，在1 h时，表达量上升到最大值，随后虽然快速下降，但在2 h处的表达量仍维持在极显著水平（P<0.01）;此后，表达量呈现下降到低谷，再小幅度上升的趋势。 4讨论 近年来，铁皮石斛因其具有重要的经济和药用价值，成为国内、外学者研究的热点。WRKY类转录因子作为植物特有的一类转录因子，过去一直被研究于植物的抗逆、抗胁迫领域，鲜有研究参与植物次生代
28、谢的调控。目前，研究人员开始高度关注WRKY类转录因子对植物次生代谢的调控作用，已有研究表明WRKY类转录因子在红豆杉Taxus chinensis （Pilger） Rehd.<sup>13</sup>、黄花蒿Artemisia annua Linn.<sup>14</sup>、长春花Catharanthus roseus（L.） G. Don<sup>15</sup>中，参与调节相关次生代谢产物的合成。因此，研究铁皮石斛WRKY转录因子将具有巨大的潜在价值和广阔的应用前景。 本研究从铁皮石斛中分离到的DoWRKY1蛋白
29、在188246位和362420位氨基酸各含有1个WRKY保守结构域和1个C2H2锌指结构。根据WRKY转录因子结构域的数量和锌指结构的特征将WRKY家族分为， 3类<sup>16</sup>：第一类WRKY家族成员含有2个WRKY结构域，其锌指结构类型为C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H）型;第二类成员只含有1个WRKY结构域，其锌指结构同样为C2H2型;第三类成员也只含有1个WRKY结构域，但是其锌指结构却为C2HC（C-X7-C-X23-H-X1-C）型。由此可知DoWRKY1属于第类WRKY蛋白。Ulker<sup>17</s
30、up>认为，第类WRKY基因起源最早。而Xie<sup>18</sup>研究发现，在长期的进化过程中，第类是由第类WRKY基因丢失1个WRKY结构域形成的。由此可以推测，DoWRKY1是铁皮石斛WRKY家族起源较早基因之一，至于和铁皮石斛第，类WRKY基因之间的关系有待后续进一步研究。 转录因子依据其是否具有转录激活活性，被分为激活子和抑制子。酵母单杂交<sup>19</sup>是人们根据酵母双杂交技术原理提出来的，是可以判断一个转录因子是否具有激活活性的有效方法。本研究采用该方法来研究DoWRKY1的转录激活功能，表明DoWRKY1具有转
31、录激活活性，属于转录激活子，为今后进一步研究DoWRKY1的转录调控功能提供必要条件。 鉴于已有研究对WRKY类转录因子的启动子区进行分析时，发现WRKY基因的启动子区含有响应茉莉酸类物质的元件<sup>20</sup>，而本实验也证实了DoWRKY1响应MeJA的诱导，表达量明显升高的结果。壳聚糖作为一种真菌诱导子，是可以引起植物细胞合成积累次生代谢物的活性物质，已经被广泛研究在药用植物次生代谢产物积累中。本实验结果表明，在壳聚糖的处理下，强烈且迅速地诱导了铁皮石斛DoWRKY1的表达。对比MeJA和壳聚糖诱导处理，发现在MeJA的诱导下，DoWRKY1的表达量呈现先
32、缓慢上升，再迅速下降的趋势，且在较长的时间内，维持在高水平;而对于壳聚糖的诱导，基因表达量虽然响应迅速，但是持续时间较短。MeJA和壳聚糖诱导DoWRKY1表达的机理有待进一步研究。 本研究从铁皮石斛中克隆得到DoWRKY1转录因子全长cDNA，qRT-PCR分析显示其响应MeJA和壳聚糖的诱导，酵母单杂交实验表明其具有转录激活活性，为进一步研究DoWRKY1的生物学功能打下了坚实的基础。 参考文献 1吕圭源，颜美秋，陈素红. 铁皮石斛功效相关药理作用研究进展J. 中国中药杂志，2013，38（4）：489. 2李玲，邓晓兰，赵兴兵，等. 铁皮石斛化学成分及药理作用研究进展J. 肿瘤药学，2011，1（2）：90. 3李娟，李顺祥，黄丹，等. 铁皮石斛资源、化学成分及药理作用研究进展J. 科技导报，2011，29（18）：74. 4Guo X，Li Y，Li C
