1、贵州省食品安全地方标准贵州省食品安全地方标准蔬菜中三唑磷残留的测定 酶联免疫吸附法编制说明（征求意见稿）北京勤邦生物技术有限公司1、任务来源本标准的制定是根据“贵州省重大科技专项计划项目”“贵州省茶叶、蔬菜质量安全评价、检测、预警与可追溯关键技术研究与应用”项目要求而确定的，同时根据贵州省卫生和计划生育委员会办公室关于同意贵州苕粉等25项贵州省食品安全地方标准立项的通知（黔卫计办函201594号）文件的通知要求，我单位承担的茶叶、蔬菜中三唑磷残留的快速检测 酶联免疫吸附法贵州地方标准于2015年11月获得立项。2、标准制定的背景和必要性三唑磷，又名三唑硫磷，英文通用名Triazophos，化学
2、名称O,O-二乙基-O-(1-苯基-1,2,4-三唑-3-基)硫代磷酸酯。纯品为浅棕黄色液体，20时在水中的溶解度为3040mg/L，可溶于大多数有机溶剂；对光稳定，在酸、碱介质中水解，140分解。三唑磷具有强烈的触杀和胃毒作用，杀虫效果好，杀卵作用明显，渗透性较强，无内吸作用，是一种中等毒性、广谱有机磷杀虫剂、杀螨剂，兼有一定的杀线虫作用，已在我国水稻、棉花、蔬菜和苹果等作物上登记，主要用于防治粮食、棉花、果树、蔬菜等主要农作物上的许多重要害虫。由于三唑磷的应用效果好，相对甲胺磷等高毒农药其毒性低，因此，在农作物上应用较广泛。然而，三唑磷的大量使用也给一些食用农产品及环境带来了残留问题。三唑
3、磷属有机磷农药，中等毒性，对神经、肝、肾、心、肺及生殖系统等多脏器均有明显的毒副作用，其中毒主要机理是抑制胆碱酯酶的活性。欧盟规定三唑磷最大残留限量（maximum residue limit，MRL）为不得检出的农药品种；日本“肯定列表制度”中规定，除了小麦、大麦、黑麦、玉米、荞麦、其他粮谷、棉籽和棉籽油设定了最大残留限量，其余适用“一律标准”，即0.01mg/kg；我国国家标准GB 2763-2016 食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量中限定三唑磷的MRL为：稻谷、麦类、旱粮类等谷物0.05mg/kg，棉籽及结球甘蓝、节瓜等蔬菜0.1mg/kg，柑橘、苹果、荔枝等水果0.2mg/kg
4、。因此，建立三唑磷残留的快速检测技术，加强监测、科学使用三唑磷，对于保障人类健康与食品安全，降低环境污染，减少对农副产品出口产生的影响等具有重要意义。贵州属于传统的农业省，农业人口和农业产业比重较大。近年来，我省充分发挥资源优势，加大农业结构调整力度，突出抓好蔬菜等优势特色产业。蔬菜面积1763万亩，蔬菜已成为我省农业结构调整的支柱产业和农民收入的主要来源。然而随着我省蔬菜产业的不断发展壮大，质量安全也逐渐凸显。蔬菜中残留的农药会通过食物链进入人体，危害人类健康，而且农产品会因质量安全问题被进口国（地区）拒绝、扣留、退货、索赔和终止合同，制约我省的经济发展。因此，加强蔬菜等农产品中三唑磷等农药
5、的检测和控制是一项刻不容缓的工作。本项目建立三唑磷的酶联免疫吸附（ELISA）法，采用特异性强的单克隆抗体，检测灵敏度可达到1g/kg，对蔬菜样本的最低检测限为50g/kg，满足我国国家标准规定的最大残留限量，样本加标回收率为60%120%，检测结果准确度高，并且该方法具有特异性强、快速方便、不需要昂贵仪器设备等优点，适合大批量样品的集中快速筛查，可为我省蔬菜等农产品的质量安全监管控制提供技术支撑和重要保障，对我省食品安全快速检测方法的发展具有重要意义。3、国家标准、行业标准以及其他省外标准的制定发布情况 在国际标准化组织（ISO）标准体系、国际分析化学师协会（AOAC）标准体系和欧盟标准委员
6、会（CEN）标准体系中，均尚未检索到单独针对三唑磷的检测方法标准；我国标准体系中提供的测定蔬菜中三唑磷的方法均是多残留检测方法，有国家标准（GB/T 5009.218-2008、GB/T 20769-2008）、行业标准（NY/T 1379-2007、NY/T 761-2008、SN/T 0148-2011）和地方标准（DB34/T 1076-2009），主要采用液相色谱法、液相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱法、气相色谱法和气象色谱-质谱法等分析仪器检测方法。这些仪器法具有检测度高、灵敏度高、稳定性好等优点。但仪器方法的推广具有一定的局限性，仪器昂贵、操作方法繁琐耗时，不适合用于现场监管和企
7、业大规模质量筛查，不能满足农业大省贵州省质量监管部门以及企业对蔬菜中三唑磷的现场快速筛选、检测需求。4、主要工作过程、主要编制成员、参加成员1、主要工作过程该标准由北京勤邦生物技术有限公司（以下简称勤邦生物）组织专家成立了标准编制工作组，并负责编制起草工作，确定标准的主要技术内容。编制组成立后，进行了广泛的调查和研究工作，主要包括以下几个方面：（1）详细查阅了国内、国外有关标准和相关专业期刊上发表过的参考文献等技术资料，并对这些资料进行了详细的对比，从方法的先进性、可靠性和实用性等几个方面考虑，选取了几个代表性的参考资料作为标准起草中的主要技术参考文本。（2）及时购置相关的实验试剂、标准品和其
8、他材料；已得到三唑磷半抗原；将三唑磷半抗原与牛血清白蛋白和卵清蛋白分别进行偶联得到免疫原和包被原；已将制备获得的抗原通过免疫小鼠获得三唑磷单克隆抗体；完成抗原抗体筛选、配对，获得最优抗原、抗体稀释倍数组合；建立了酶联免疫吸附法的反应体系，摸索不同条件对方法进行最优化，最终确定了最佳的检测方法。（3）针对蔬菜样品与其他参考资料中样品之间的差异，开展多种蔬菜酶联免疫吸附法的试验，包括白菜、胡萝卜，这是方法的重要步骤和关键环节。不同样品用同一种方法进行试验和验证，确保本检测方法能够灵敏、特异、准确地检测出蔬菜样品中三唑磷的含量。如：方法的检测限，对20份空白样本进行检测，以检测结果的平均值加上3倍标
9、准差来确定检测限；方法的准确率，通过对50g/kg、100 g/kg、200g/kg三种浓度添加的蔬菜样本进行检测，得到本检测方法的回收率，盲样测定与仪器方法的结果进行比对，确保本方法的检测结果可靠。（4）在技术指标完成试验工作之后，严格按照标准样本的格式，起草编写标准文本内容和编制说明内容。2、主要成员、参加成员序号标准名称主要编制成员参加成员1蔬菜中三唑磷残留的测定 酶联免疫吸附法贵州省农产品质检中心、北京勤邦生物技术有限公司蔡韬、冯才伟、扶胜、李占斌、张莉、陆洋、袁旭、卢平、王震、周雪莉、罗华兰、丁静五、标准主要内容确定的依据1、主要技术内容确定的依据技术内容确定的依据：方法的检测限为5
10、0 g/kg，主要是依据我国国家标准GB 2763-2016 食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量中限定三唑磷的MRL为稻谷、麦类、旱粮类等谷物0.05mg/kg，棉籽及结球甘蓝、节瓜等蔬菜0.1mg/kg，柑橘、苹果、荔枝等水果0.2mg/kg。因此，本方法的检测限能够符合相关部门的要求。方法的定量限、准确率、特异性等技术指标确定主要依据：一是兽药残留检测试剂盒（条、卡）备案技术资料要求及审查工作程序的规定要求；二是农业部农牧发20031号文件“关于发布兽药残留试验技术规范（试行）的通知”中的规定要求；三是按照国际食品法典委员会（CAC）通用要求。其他参数、公式、性能要求、实验方法、检验
11、规则等主要依据包括：GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则(ISO.IEC Directives,Part3,1997,Rules for structure and drafting of International Standard,NEQ)；GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。2、标准技术内容和技术指标的论证2.1 酶联免疫吸附法主要材料制备2.1.1 半抗原的合成三唑磷是小分子物质，不具备免疫原性，只有反应原性，需与大分子载体蛋白共价结合后才能使动物免疫系统识别，产生相应的抗体。本研究先对三唑磷小分子进行结构改造获得半抗原，然后将半抗原与
12、载体蛋白（BSA、OVA等）偶联制备人工抗原。具体操作如下：100mL三口烧瓶中加入10mL二氯甲烷和0.5当量的三唑磷，降温至-5，搅拌下加入1.01当量的乙酰氯，控温加入2当量的三氯化铝，控温5反应6小时后，加稀盐酸和冰水，乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥有机相，减压蒸干溶剂，石油醚-乙酸乙酯体系重结晶得乙酰化物。100mL三口烧瓶中加入上步乙酰化物，10mL吡啶溶解，加1.2当量的羧甲基羟胺，65反应5小时，乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸镁干燥有机相，减压蒸馏，得到半抗原产物，经核磁鉴定，结构正确，鉴定图谱如下：图1 三唑磷半抗原结构式鉴定氢谱图2.1.2 抗原的合成2.1.2.1 免疫
13、原的合成将三唑磷半抗原与牛血清白蛋白进行偶联得到免疫原，具体操作如下：取5mg 三唑磷半抗原用1mL DMF溶解，取30mg EDC和NHS用0.2mL水充分溶解后加入三唑磷半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取50mg BSA充分溶解在3.8mL PBS（pH7.2）中，将反应液A逐滴缓慢加到蛋白溶液中，于室温下搅拌24h；用0.01mol/L PBS于4透析3d，每天换液34次，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20保存备用。2.1.2.2 包被原的合成将三唑磷半抗原与卵清蛋白进行偶联得到包被原，具体操作如下：取5mg 三唑磷半抗原用1mL DMF溶解，取30mg EDC
14、和NHS用0.2mL水充分溶解后加入三唑磷半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取50mg OVA充分溶解在3.8mL PBS（pH7.2）中，将反应液A逐滴缓慢加到蛋白溶液中，于室温下搅拌24h；用0.01mol/L PBS于4透析3d，每天换液34次，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20保存备用。2.1.2.3 三唑磷免疫原与包被原的鉴定方法确定偶联是否成功：一般通过紫外扫描法鉴定半抗原与载体蛋白的偶联是否为有效偶联，因为半抗原与蛋白在紫外下有不同的特征吸收，当偶联成功时，偶联物的紫外吸收会有二者的叠加效应出现，因此比单独的蛋白特征吸收会发生一定的偏移，可用于检测偶联是否
15、成功。偶联比的测定：用纯水稀释三唑磷半抗原、BSA、OVA及两种蛋白与三唑磷半抗原的结合物，配制成一定浓度的溶液，然后用紫外分光光度计进行全波长扫描，得到它们的紫外吸收光谱图。根据公式K=A/CL分别计算出三唑磷半抗原、BAS、OVA的摩尔消光系数。在载体蛋白和三唑磷半抗原的最大波长处检测偶联物的光吸收值，按公式计算两种物质在偶联物中的摩尔浓度比，即偶联比：Ca/Cb =（A偶264KBSA280-A偶280 KBSA264）/（A偶280K三唑磷264-A偶264K三唑磷280）蛋白含量的测定：将偶联物稀释到适当倍数后，测定280nm和260nm的分光光度值，按公式计算蛋白的浓度即偶联物的浓
16、度：蛋白质（mg/mL）=1.45OD280-0.74OD260免疫原和包被原的鉴定结果：将三唑磷半抗原、载体蛋白以及两者的结合物配制成一定浓度的溶液，然后用紫外分光光度计进行全波长扫描，经过计算分析得到人工抗原的结合比和浓度。三唑磷-BSA和三唑磷-OVA结合比分别为1:5和1:7。2.1.3 抗体的制备2.1.3.1 动物免疫以三唑磷-BSA作为免疫原，免疫雌性BALB/c小鼠（810周龄）。免疫方案如下：首免时，每只小鼠用150 g的三唑磷-BSA（以载体蛋白计）与FCA按1:3比例混合制成的乳化剂，颈背部皮下多点注射；二免和三免时，将FCA换成FICA，剂量和方法同上。每次免疫间隔时间
17、为2周。融合前3天每只小鼠腹腔注入100 g 三唑磷-BSA进行加强免疫。2.1.3.2 单克隆抗体的制备 三免后第7天，采血清测效价。效价达1.6105以上的小鼠于四免后第12天，摘除眼球放血，并分离阳性血清作对照。无菌操作取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合（比例数8:1）。融合剂为聚乙二醇（PEG）4000，作用2 min，随后即加入20 mL无血清的1640营养液（时间4 min）。离心后，用20 mL完全营养液悬浮混匀。将细胞悬液分别加入已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中（4板），0.1 mL/孔置37 饱和湿度、含5% CO2的培养箱中培养。待细胞长至孔底的1/21/3时，用间接竞争
18、ELISA方法筛选。阳性细胞迅速扩大培养并采用有限稀释法进行亚克隆。1014天后，取细胞上清检测，计算阳性率。阳性率100%时，得到稳定的细胞株。采用体内诱生腹水法进行大量单克隆抗体的制备，将BALB/C小鼠（68周龄）腹腔注入灭菌石蜡油0.5 mL/只，10天后，再注入阳性细胞1106个/只，植入细胞后第7天起，每天观察小鼠腹部，待小鼠腹部明显膨大，用9#针头穿刺腹腔抽取腹水。每只小鼠可采腹水约23 mL/次。离心去脂肪层和细胞层后，用饱和硫酸铵法纯化，分装冻存。阳性细胞经过3次亚克隆，阳性率达90%，得到了2株稳定分泌单克隆抗体的细胞。2.2 检测方法的建立2.2.1 抗原、抗体的筛选1）
19、用常规包被液（pH9.6，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液）将1#、2#、3#抗原分别进行1:1104、1:3104、1:9104稀释，包被酶标板100 L/孔，37 恒温避光反应2 h，PBST洗液洗涤1次，用常规封闭液（pH7.2，含有5%卵清蛋白，5%奶粉，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液）封闭，37 恒温避光反应2 h，甩干；2）向板孔中加入三唑磷标准品溶液50 L，用常规酶标二抗稀释液（pH7.2，6%山羊血清，0.2 mol/L磷酸盐缓冲液）稀释1:2000的酶标二抗50 L，用常规抗体稀释液（pH7.2，含有8%牛血清白蛋白，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液）稀释1:2104，1:
20、4104，1:8104，1:16104的1#、2#、3#抗体各50 L，25 反应30 min，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物液A液和B液各50 L，25反应15min，加入50 L终止液终止；4）按以上操作方法，分别测定零标准品OD值及0.025 g/L标准品的OD值，计算抑制率，以零标准品OD值为1.52.0，0.025 g/L标准品抑制率为70%80%作为评定标准，选择较好的抗原抗体组合和抗原抗体工作浓度见表1（a）（c）。表1（a）方阵法确定最佳的抗原、抗体及最佳的工作浓度（表格中W表示1104）抗体稀释倍数检测项目1#抗原2#抗原3#抗原1:1W1:3W1:9W1:1W1:3W
21、1:9W1:1W1:3W1:9W1#抗体1:2W0g/L标准品OD值2.1481.951.6842.1071.7581.5232.6232.141.8491g/L标准品OD值1.9361.6631.4721.9151.581.2642.2691.7271.685抑制率（%）9085879089838681911:4W0g/L标准品OD值1.7961.6171.481.7651.4971.3162.1201.8631.6721g/L标准品OD值1.8151.4821.2361.6491.2381.0751.7071.5461.51抑制率（%）10191839382818182901:8W0g/L
22、标准品OD值1.5831.3941.3051.4891.3521.2431.6541.4381.2951g/L标准品OD值1.4391.2751.0361.3751.1470.9781.4761.3541.293抑制率（%）9091799284788994991:16W0g/L标准品OD值1.3511.1831.0491.2781.0490.9271.441.1741.0461g/L标准品OD值1.170.9540.7070.9560.8610.6031.2530.9480.762抑制率（%）868067748265878072表1（b）方阵法确定最佳的抗原、抗体及最佳的工作浓度（表格中W表示
23、1104）抗体稀释倍数检测项目1#抗原2#抗原3#抗原1:1W1:3W1:9W1:1W1:3W1:9W1:1W1:3W1:9W2#抗体1:2W0g/L标准品OD值2.4862.1781.7543.1622.662.0472.0541.6781.2451g/L标准品OD值2.2691.661.492.8962.1431.9982.1231.4361.078抑制率（%）91768491809710385861:4W0g/L标准品OD值2.0541.8721.552.6482.0971.6731.7351.4511.3391g/L标准品OD值1.881.5531.2652.3721.8631.614
24、1.7071.2540.948抑制率（%）9182818988969886701:8W0g/L标准品OD值1.5931.5061.3721.7831.5761.3951.5051.3281.1671g/L标准品OD值1.3181.2730.8461.8141.531.141.3191.1360.926抑制率（%）82846110197818785791:16W0g/L标准品OD值1.3461.3271.0491.5441.3521.1681.3371.1520.9841g/L标准品OD值1.0030.9560.5871.4061.0950.8451.1181.0790.685抑制率（%）747
25、255918072839369表1（c）方阵法确定最佳的抗原、抗体及最佳的工作浓度（表格中W表示1104）抗体稀释倍数检测项目1#抗原2#抗原3#抗原1:1W1:3W1:9W1:1W1:3W1:9W1:1W1:3W1:9W3#抗体1:2W0g/L标准品OD值3.2152.7842.0932.5822.1761.9682.7482.2531.9861g/L标准品OD值2.8722.1681.8452.3161.9091.7832.5062.0341.857抑制率（%）8977888987909190931:4W0g/L标准品OD值2.5962.231.8742.1491.8541.5272.23
26、51.9471.671g/L标准品OD值2.4671.8941.7031.7651.4391.0611.8931.6151.508抑制率（%）9584908277698482901:8W0g/L标准品OD值2.1481.9651.4862.0721.4561.3821.8731.4731.3781g/L标准品OD值1.7541.6391.4921.3341.1631.0541.2541.2421.065抑制率（%）81831006480766784771:16W0g/L标准品OD值1.7341.531.2491.4151.2841.0961.5291.3651.1071g/L标准品OD值1.5
27、861.2850.9631.3421.0590.7381.2740.9590.632抑制率（%）918377948267837057由表1（a）（c）可知，2#抗原1:3104稀释，3#抗体1:4104稀释时，零标准品OD值在1.52.0之间，1 g/L标准品抑制率为77%，均符合要求。2.2.2 反应温度确定1）包被抗原：用常规包被液将2#抗原进行1:3104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2h，用PBST洗液洗涤1次，用常规封闭液封闭，37恒温避光反应2h，甩干；2）加样方式：向板孔中加入50 L标准品/样品溶液、50 L用常规酶标二抗稀释液稀释1:2000的酶标二抗和50
28、L用常规抗体稀释液稀释1:4104的3#抗体，混匀，分别在25 、37 下反应30 min，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物A液和B液各50L，25反应15min，加入50L终止液终止；4）按照以上操作方法，分别测定零标准品OD值、1g/L标准品OD值、空白白菜样本OD值，计算抑制率，以零标准品OD值为1.52.0，空白蔬菜样本OD值接近零标准品OD值，抑制率在70%80%为判定标准，选择较好的反应温度（见表2）。表2 反应温度的确定试验反应温度零标准品OD值1g/L标准品 OD值抑制率（%）空白白菜OD值251.8421.301711.820372.1361.91490.02.281由表2可知，25条件下，加入50 L标准品/样品溶液、50 L酶标二抗和50 L抗体工作液进行反应时，测定的零标准品OD值在1.52.0之间，1g/L标准品的抑制率在70%80%之间，空白蔬菜样品的OD值与零标准品OD值偏差较小。2.2.3 抗原、抗体反应时间确定1）包被抗原：用常规包被液将2#抗原进行1:3104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2h，用PBST洗液洗涤1次，用常规封闭液封闭，37恒温避光反应
