1、基因工程与克隆技术讲义答案基因工程与克隆技术 考点1基因工程1.(2015浙江10月选考,节选)答案:限制性核酸内切酶2.(2016浙江4月选考,节选)答案:(1)逆转录重组DNA分子农杆菌B (2)摇床维持渗透压3.(2018浙江4月选考,节选)回答与基因工程和植物克隆有关的问题:(1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcoR酶切,在切口处形成。选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI121用DNA连接酶连接,在两个片段相邻处形成,获得重组质粒。(2)已知用CaCl2处理细菌,会改变其某些生理状态。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内
2、进行混合等操作,使重组质粒进入农杆菌,完成实验。在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,其目的是 ,从而表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。解析:(1)EcoR酶切目的基因和载体,在切口处形成粘性末端;DNA连接酶使具有相同粘性末端的两个片段形成磷酸二酯键,能获得重组质粒。(2)目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为转化。经转化的农杆菌,在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,以使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态。答案:(1)粘性末端磷酸二酯键(2)转化使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态1.基因工程的工具2.基因工程的原理与操作
3、步骤(1)基因工程的原理基本原理:让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳定和高效地表达。基本要素:多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等。(2)基因工程的基本操作步骤3.形成重组DNA分子(1)单酶切法将同一种限制性核酸内切酶切割的质粒与目的基因片段混合,加入DNA连接酶,两两连接的产物(重组DNA分子)有以下3种:目的基因与目的基因的连接物;质粒与质粒的连接物;目的基因与质粒的连接物。其中,只有目的基因与质粒的连接物才是真正需要的。(2)双酶切法双酶切法的优点主要在于防止质粒和目的基因自身环化以及保证目的基因单向插入质粒。【自我诊断】1.转入外源基因的动物称为转基因动物。()2.从猪
4、血液中提取的胰岛素属于基因工程药物。()3.限制性核酸内切酶作用于DNA分子的氢键,使DNA双链断开。()4.限制性核酸内切酶能够特异性识别并切割烟草花叶病毒遗传物质。()5.基因工程的工具酶包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶及质粒。()6.质粒中的抗生素合成基因等标记基因通常会用于含有目的基因受体细胞的筛选。()7.质粒是一种直链DNA分子,可作为基因工程中的载体。()8.DNA聚合酶和限制性核酸内切酶是基因工程中常用的两种工具酶。()9.土壤农杆菌转化法是将目的基因与农杆菌质粒重组,然后将重组DNA分子导入植物受体细胞。()10.基因工程的原理是让人们感兴趣的基因在宿主细胞中稳定的保存和表
5、达。()11.多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞是进行基因工程操作的基本要素。()12.目的基因序列未知,可采用PCR扩增获得目的基因。()13.构建基因文库时需包含目的基因。()14.将目的基因导入动物细胞和植物细胞最常用的方法分别是农杆菌转化法和显微注射法。()15.利用氯化钙处理农杆菌细胞,可以增加其细胞膜的通透性。()16.在宿主细胞中检测到目的基因存在,说明转基因技术操作成功。()17.限制性核酸内切酶和DNA连接酶为基因的分离和重组提供了必要手段。()18.基因治疗是向目的细胞中导入正常基因以替换细胞中不正常的基因。()考向1基因工程的工具【例1】 下列关于基因工程的有关叙述,正
6、确的是()A.基因工程常用的工具酶是限制性核酸内切酶、DNA连接酶、载体B.一种限制性核酸内切酶能识别几种特定的核苷酸序列,并在特定的切点上切割DNAC.质粒是一种常用载体,是拟核外能自主复制的很小的环状DNA分子D.DNA连接酶可代替DNA聚合酶用于DNA的复制解析:基因工程常用的工具酶是限制性核酸内切酶、DNA连接酶,载体是工具;一种限制性核酸内切酶能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定的切点上切割DNA;质粒是独立于拟核区之外的特殊环状DNA分子,具有自主复制能力;DNA聚合酶以DNA的一条链为模板进行复制,DNA连接酶不需要模板,将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起,形成重组DN
7、A分子。答案:C基因工程操作中的6点易错(1)在切割目的基因时要求用同一种限制性核酸内切酶,目的是产生相同的粘性末端。(2)将目的基因从DNA分子中切割出来需要消耗4分子水,形成4个粘性末端,目的基因上含有2个粘性末端。(3)不同DNA分子用相同限制性核酸内切酶切割产生相同的粘性末端,同一种DNA分子用不同的限制性核酸内切酶切割,产生的粘性末端一般不同。(4)基因工程中用到的载体并非只有质粒,还有噬菌体、植物病毒和动物病毒,其中质粒和噬菌体可将外源基因载入到大肠杆菌等宿主细胞中,而植物病毒和动物病毒能够将外源基因分别载入到植物细胞和动物细胞内。(5)基因工程中载体与细胞膜上载体本质不同,前者化
8、学本质为DNA,后者为蛋白质。(6)标记基因与目的基因的表达无关,其作用为筛选含有目的基因的受体细胞。考向2基因工程中形成重组DNA分子的形成方式【例2】 如表所示列出了几种限制性核酸内切酶识别序列及其切割位点,图1、图2中箭头表示相关限制性核酸内切酶的酶切位点。下列说法错误的是()限制酶BamHHindEcoRSma识别序列及切割位点A.一个图1所示的质粒分子经Sma切割后,含有4个游离的磷酸基团B.用图1中的质粒和图2中的目的基因构建重组质粒,不能使用Sma切割C.图2中为防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状,不能使用EcoRD.为了获取重组质粒,最好用BamH和Hind同时
9、切割质粒和外源DNA解析:质粒切割前是双链环状DNA分子,所有磷酸基团参与形成磷酸二酯键,故不含游离的磷酸基团。从图1可以看出,质粒上只含有一个Sma的切点,因此被该酶切割后,质粒变为线性双链DNA分子,因每条链上含有一个游离的磷酸基团,因此切割后含有两个游离的磷酸基团;重组DNA分子中应具备目的基因、标记基因等,图中质粒的标记基因为抗生素抗性基因,而Sma的切割位点就在该基因上,因此用质粒和外源DNA构建重组质粒,不能使用Sma切割;由于同种限制性核酸内切酶切割形成的粘性末端相同,图2中为防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状,不能使用EcoR;使用BamH和Hind两种限制酶同
10、时处理质粒、外源DNA,各自会有不同粘性末端,能防止自身环化。答案:A考向3基因工程的应用【例3】 (2018浙江全能生9月联考)重瓣紫堇具有较高观赏和药用价值,但自然状态下几乎高度不育。为解决重瓣紫堇的繁殖难题,科学家利用另一种植物的可育基因M,完成了对重瓣紫堇的改造,流程如图:(图中箭头指的是不同限制性核酸内切酶识别的位点)请回答:(1)在本例中,应选用的限制性核酸内切酶是,以避免质粒自身环化、错向连接等问题。连接目的基因和质粒时,关键需要催化键的形成。(2)导入受体细胞时,应先用CaCl2处理 ,使其,从而有利于重组质粒的导入。(3)利用紫堇根尖细胞培养成完整植株,依据的原理是 ,理论上
11、,(填“能”或“不能”)用紫堇的叶肉细胞代替根尖细胞完成上述改造工作。(4)若图中所得的转基因紫堇植株自交一代,子代中能稳定遗传的个体所占的比例为 。解析:(1)根据质粒和目的基因所在DNA均存在三个限制性核酸内切酶切位点,且Bal酶切位点处于目的基因M的中间,不适宜选用,因此应该选择Hind和Xho进行酶切,且符合题中“避免质粒自身环化、错向连接”等问题;目的基因与质粒的连接需要DNA连接酶,具体催化的化学键是磷酸二酯键。(2)本题采用的是农杆菌转化法,其中重组质粒首先导入的受体细胞为农杆菌,再借助农杆菌侵染植物细胞的特性,将农杆菌细胞内的目的基因转移至最终的植物细胞中,因此CaCl2处理的
12、对象是农杆菌,其具体机理是使得细菌处于感受态。(3)植物组织培养的理论基础是植物细胞的全能性,由于叶肉细胞同样具有本物种生长、发育、繁殖的全部遗传信息,所以也可作为受体细胞进行培养。(4)该转基因植物可写作“MO”型,在自交时,相当于杂合体,会导致后代性状分离,具体为MMMOOO=1/41/21/4,因此可稳定遗传的植株基因型为MM,占1/4。答案:(1)Hind和Xho磷酸二酯(2)农杆菌处于感受态(3)植物细胞的全能性能(4)1/4基因工程中分子或个体水平的检测方法【热点变式】 人血清蛋白(HSA)具有重要的医用价值。如图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。(1)如果HS
13、A基因序列未知,可以采用的方法获取该目的基因,为了使目的基因能够在宿主细胞中复制和稳定保存,通常要先构建后才能导入宿主细胞。(2)方框中的“?”一般选用的生物是,为了提高过程的导入成功率,通常用处理大肠杆菌。(3)人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性,所以,选择(填“”或“”)途径获取rHSA更有优势。(4)为了鉴定宿主细胞中是否产生rHSA,可以用方法来进行检验。A.检验HSA基因是否导入B.检验细胞中是否产生相应的mRNAC.抗原抗体杂交D.检测是否有标记基因解析:(1)获取目的基因的方法有:从基因文库中获取、采用PCR技术扩增(适用于目的基因的核苷酸序
14、列已知的情况下)、人工化学合成(适用于目的基因较小且序列已知的情况下)。因此如果HSA基因序列未知,可以采用从基因文库中提取的方法获取该目的基因;为了使目的基因能够在宿主细胞中复制和稳定保存,通常要先构建基因表达载体(重组DNA)后才能导入宿主细胞。(2)将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法,因此方框中的“?”一般选用的生物是农杆菌;将目的基因导入微生物细胞时常用感受态细胞法,即用氯化钙处理微生物细胞,使之成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态。(3)由于大肠杆菌是原核生物,其细胞中不含内质网和高尔基体,而人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性,所以,选择
15、途径获取rHSA更有优势。(4)检测目的基因是否表达形成蛋白质可以采用抗原-抗体杂交法。答案:(1)从基因文库中提取重组DNA分子(2)农杆菌氯化钙(3)(4)C考点2克隆技术1.(2018浙江4月选考,节选)取田间不同品种水稻的幼胚,先进行,然后接种到培养基中培养,幼胚发生形成愈伤组织,并进行继代培养。用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织,再培养愈伤组织,以便获得抗虫的转基因水稻。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有:培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比以及 (答两点即可)。解析:组织培养时对幼胚先进行消毒处理,以免污染;幼胚经脱分化形成愈伤组织;影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素还有水
16、稻的基因型、愈伤组织继代的次数等。答案:消毒脱分化水稻的基因型、愈伤组织继代的次数2.(2017浙江11月选考,节选)(1)利用植物愈伤组织获得再生植株主要有两条途径:一是由愈伤组织的细胞先分化产生芽和根后再形成一个完整植株的途径。二是由愈伤组织的细胞产生胚状体后再萌发形成完整植株的胚胎发生途径。另外也可不通过愈伤组织阶段而直接采用带腋芽的茎段培养成丛状苗,再诱导生根获得再生植株,其原因是腋芽中存在。(2)利用植物克隆培育新品种,一方面可利用带有目的基因的侵染植株,若将目的基因通过的方法导入植物细胞、组织或器官获得转基因植株。另一方面利用异源植物的进行融合产生杂种植株,或利用异源植物在试管内进
17、行,对其产生的胚进行培养产生杂种植株。(3)下列属于植物克隆和动物克隆共有的培养方法是。A.悬浮培养、器官培养B.贴壁培养、传代培养C.器官培养、愈伤组织培养D.原生质体培养、传代培养解析:(1)利用愈伤组织获得再生植株,可以将愈伤组织通过器官发生途径分化成根和芽等分生组织后,获得完整植株,也可以由愈伤组织的细胞产生胚状体后再形成完整的植株。若不采用愈伤组织获得植株,还可利用茎段培养成丛状苗,然后诱导其生根,进而获得再生植株,该方法之所以采用腋芽等幼嫩组织进行培养,主要原因是腋芽等幼嫩组织中存在分生组织,能够完成器官分化和重建。(2)利用植物克隆培育新品种,可以利用带有目的基因的农杆菌侵染植株
18、,或将目的基因通过显微注射导入植物细胞,进而获得转基因植株。也可利用异源植物的原生质体进行原生质体融合产生杂种植株,或利用异源植物进行试管内受精,将获得的未分化的胚进行培养进而获得杂种植株。(3)植物克隆和动物克隆时,都可进行液体悬浮培养,都存在组织和器官培养,贴壁生长是动物细胞培养的特点,愈伤组织和原生质体培养是植物克隆所特有的。答案:(1)器官发生分生组织(2)农杆菌显微注射原生质体受精(3)A3.(2016浙江10月选考,节选)某小组欲进行烟草原生质体分离与培养的研究。请回答:(1)原生质体的分离:在无菌条件下,取烟草无菌苗的叶片,放入含有0.5 mol/L甘露醇(维持较高渗透压)的混合
19、液处理,经过离心纯化后获得原生质体。(2)原生质体的培养:将原生质体进行培养,重新长出细胞壁,形成胚性细胞。此时,应该培养基中甘露醇的浓度,以利于胚性细胞继续培养形成细胞团,然后经两条途径形成再生植株。途径一:细胞团经球形胚、和胚状体,最后发育成植株。途径二:细胞团增殖为愈伤组织,然后在发芽培养基上诱导出芽,切割芽经过生根后形成完整植株。上述发芽培养基中含量相对较高的激素是,胚性细胞的主要特点是(A.液泡小、细胞核小B.液泡大、细胞核大C.液泡大、细胞核小D.液泡小、细胞核大)。(3)为了对烟草的某些性状进行改良,分离得到两种烟草的原生质体后,通过方法将它们的遗传物质组合在一起,经培养获得具有
20、新性状的再生植株。提取再生植株的DNA,采用扩增相关基因,来鉴定遗传物质是否成功重组。解析:(1)用纤维素酶和果胶酶处理植物细胞获得原生质体。(2)降低培养基中甘露醇的浓度,利于细胞团的形成。再生植株的形成途径之一是经球形胚、心形胚和胚状体,后发育成植株;发芽培养基中细胞分裂素浓度大于生长素浓度。胚性细胞液泡大,细胞核大。(3)两种烟草的原生质体通过原生质体融合将其遗传物质组合在一起。扩增DNA的技术是PCR。答案:(1)纤维素酶和果胶酶(2)降低心形胚细胞分裂素B(3)原生质体融合PCR1.植物细胞全能性与表达能力下降原因分析(1)概念:植物体的每个生活细胞都具有遗传上的全能性,因而都具有发
21、育成完整植株的潜能。(2)植物细胞全能性的原因:生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质,都有发育成为完整个体所必需的全部基因。(3)植物细胞全能性表达的条件离体、无菌操作。一定的营养物质,如水、无机盐、蔗糖、维生素等。添加植物激素,如细胞分裂素和生长素。一定的外界环境条件(温度、酸碱度、光照的控制等)。(4)植物细胞全能性的体现植物体的几乎所有组织的细胞通过诱导都可再生新植株。植物细胞的全能性比动物细胞更容易体现。植物组织培养中细胞全能性下降的原因a.有可能是遗传物质变化:染色体畸变、细胞核变异、非整倍体产生等。b.生长发育条件变化:激素平衡被打破;细胞对外源生长物质的敏感性改变
22、。c.随时间推移,由于其他各种原因产生缺乏成胚性的细胞系。2.植物组织培养的途径(1)理论基础:植物细胞的全能性。(2)植物组织培养途径配制培养基:配制含有适当营养物质和植物生长调节剂的半固体培养基切取消毒的组织块获得愈伤组织:由相对没有分化的活的薄壁细胞团组成的新生组织器官发生途径愈伤组织芽和根完整植株胚胎发生途径愈伤组织胚性细胞(单细胞)细胞团球形胚心形胚胚状体完整植株(3)植物组织培养的意义可以在实验室、试管等器皿中进行植物受精过程和自受精卵进行的植物胚胎发育过程,以及调节控制这些过程的环境因素、遗传基础和分子及生理生化机理研究。可以进行遗传工程的操作,完成与植物生长发育有关的重要基因或
23、影响因素的研究。可以方便地通过实验手段培育植物新品种。3.原生质体培养与植物细胞工程(1)原生质体的获得方法:在0.50.6 mol/L的甘露醇溶液环境(较高渗透压)下用纤维素酶和果胶酶混合液处理根尖、叶片、愈伤组织或悬浮培养细胞,除去细胞壁。(2)植物细胞工程操作过程外源遗传物质(DNA)受体植物细胞(包括原生质体受体)转基因细胞或重组细胞新植株。4.动物细胞和组织培养流程及相关名词(1)动物细胞和组织培养流程(2)动物细胞、组织培养过程中的相关名词原代培养:从机体取出后立即进行的细胞、组织培养的过程。传代培养:将原代培养细胞分成若干份,接种到若干份培养基中,使其继续生长、增殖。细胞系:指可
24、连续传代的细胞。可分为连续细胞系(恶性细胞系,具有异体致瘤性;不死性细胞系,保留接触抑制现象,不致癌)和有限细胞系。细胞株:通过一定的选择或纯化方法,从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞。可分为连续细胞株和有限细胞株。克隆培养法:把一个单细胞从群体中分离出来单独培养,使之繁衍成一个新的细胞群体的技术。基本要求是必须肯定所建成的克隆来源于单个细胞。5.动物的细胞融合技术及其应用(1)细胞融合多核体杂交细胞多个杂交细胞聚乙二醇(PEG)、灭活的仙台病毒等(2)单克隆抗体的制备流程优点:特异性强、灵敏度高,可大量制备。用途:用于治疗疾病;作为特异探针,研究相应抗原蛋白的结构、细胞学分布及其
25、功能。6.细胞核移植和动物的克隆繁殖(1)核移植:利用一个细胞的细胞核来取代另一细胞中的细胞核,形成一个重建的“合子”。(2)动物的克隆繁殖(3)动物难以克隆的根本原因在动物的个体发育过程中,分化的结果使得细胞在形态和功能上高度特化,这是由于细胞内伴随着它们在发育过程中时间、空间的变化,基因表达的调控使得细胞中合成了专一的蛋白质。7.植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养理论基础细胞的全能性细胞的增殖培养基类型固体或半固体培养基液体培养基成分水、无机盐、维生素、蔗糖、琼脂、植物激素葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清取材部位植物幼嫩部位或花药动物胚胎或幼龄动物的器
26、官和组织对光的需求再分化阶段需光不需光过程结果获得植株新个体或获得大量的细胞和细胞产物只能获得大量细胞或细胞产物,不能得到生物个体用途植株快速繁育脱毒植物的培育制造人工种子生产药物、杀虫剂等转基因植物的培育蛋白质生物制品的生产;皮肤移植材料的培养;检测有毒物质;生理、病理、药理学研究共性都需无菌条件,培养基中含有有机物和无机物等营养物质;细胞都进行有丝分裂过程【自我诊断】1.植物组织培养的理论基础是植物细胞具有全能性。()2.通过液体悬浮培养,可将愈伤组织分散成单细胞。()3.动物细胞培养过程中,用胰蛋白酶处理可使动物细胞分散开来。()4.胚性细胞具有细胞核大,细胞质丰富,液泡大的特点。()5
27、.去掉植物细胞壁常用的酶是纤维素酶与果胶酶。()6.恶性细胞系具有异体致瘤性,不死性细胞系保留接触抑制。()7.植物组织培养过程中,器官发生和形态重建主要是通过平衡植物激素的种类进行调控。()8.制备原生质体时,采用低渗甘露醇,防止原生质体失水过多失去生物活性。()9.不同种类植物或同种植物的不同基因型个体,其细胞全能性的表达程度大不相同。()10.植物组织培养过程中,培养物的胚胎发生和器官形成能力下降的可能原因有染色体畸变、细胞核变异或非整倍体产生等,但其结果是可逆的。()11.克隆培养必须保证分离出来的细胞是一种类型的多个细胞,而不是多种类型细胞。()12.动物细胞培养时,通入CO2的目的
28、是刺激细胞呼吸。()13.原生质体培养需要先对原生质体的活力进行检测,可以采用质壁分离的方法。()14.诱导动物细胞融合常用的化学方法有聚乙二醇(PEG)或灭活的仙台病毒作为诱导剂。()15.获得植物次生代谢产物(如某些中药:紫草素等),通过大量培养特定细胞系即可(获得愈伤组织即可),无需获得植株。()16.单细胞发育成胚的过程为单细胞细胞团心形胚球形胚胚状体。()17.有限细胞系大多是发生转化了的细胞系,具有异倍体核型。()18.理论上各种细胞都可被克隆,但是单细胞通常不如群体细胞;原代细胞、有限细胞系通常不如无限细胞系、转化或肿瘤细胞。()19.在单克隆抗体的制备中,取小鼠的B淋巴细胞之前
29、,一定要给小鼠注射相应的抗原(或相应的疫苗)。()考向1植物克隆【例1】 如图中的代表通过植物组织培养技术培育新植株的三条途径,请回答:(1)外植体c来自同种植株,植株C中的细胞,全能性表达程度(填“相同”或“可能不同”)。(2)途径和需要用到和(填培养基的物理性质)两种培养基。将含B1的试管放在摇床上,通过培养可以分散成单细胞。(3)外植体c脱去细胞壁过程中需要加入适宜浓度的(A.甘露醇B.盐酸C.蒸馏水D.氯化钠)以保持一定的渗透压。原生质体培养成功标志着技术又向前迈进了一步。(4)通过大量培养特定细胞系,可以实现能产生重要(如某些中药)的细胞的大量克隆和产物的工业化生产。解析:(1)外植体a、b、c来自同种植株,由于不同细胞的分化程度不同,因此植株C中的细胞全能性表达程度可能不同。(2)途径中用到摇床,因此需要用液体培养基,而途径需要用到固体(或半固体)培养基。将含B1的试管放在摇床上,通过液体悬浮培养可以分散成单细胞。(3)外植体c脱去细胞壁过程中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压。原生质体培养成功标志着植物细胞工程技
