1、药用植物次生代谢工程研究进展药用植物次生代谢工程研究概况摘要 高等植物的次生代谢产物是许多天然药物的重要来源， 随着对药用植 物次生代谢合成途径日渐全面的认识， 采取有效的代谢工程策略对植物次生代谢 途径进行遗传改良，已经取得了诸多研究成果。本文介绍了黄酮类化合物 ( flavonoids )、萜类化合物( terpenoids )及生物碱( alkaloid )这三种重要 药用植物次生代谢产物的结构及生物合成途径， 说明了次生代谢工程在提取高质 量药用植物活性物质中的研究现状， 为今后药用植物次生代谢产物的大规模研究 和利用提供借鉴。关键词 植物药；次生代谢产物；代谢工程高等植物的次生代谢产
2、物是许多天然药物的重要来源，植物药在国际医 药市场中占有重要的地位。由于许多植物的天然活性物质的结构特殊，很难 用化学方法完全合成，因此这类物质的生产必须依赖于天然植物资源。针对 植物天然药物可持续发展问题，药用植物次生代谢产物的应用吸引了国内外 众多研究者的关注。植物次生代谢的概念最早于 1891年由 Kossel 明确提出。次生代谢产物 (Secondary metabolites) 是由次生代谢 (Secondary metablism) 产生的一类 细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子有机化合物，其产 生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。次生代谢产 物
3、可分为苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、萜类、甾体及其甙、生物碱七 大类。还有人根据次生产物的生源途径分为酚类化合物、萜类化合物、含氮 化合物 ( 如生物碱 ) 等三大类。代谢工程( Metabolic engineering )是生物工程的一个新的分支，通过基因 工程的方法改变细胞的代谢途径， 主要是针对提高某种重要的次生代谢物或其前 体的含量， 以期在较广范围内改善细胞性能， 满足人类对生物体的特定需求。 随 着现代生物工程技术的发展， 充分利用基因组学的研究成果， 解析和调控植物次 生代谢的生物合成途径， 进而利用代谢工程的方法大幅度提高药用植物中目标产物的含量，不仅具有理论上的可行性，而
4、且已经成为改造物种的有力工具1.植物次生代谢产物合成途径了解植物次生代谢合成途径是实施次生代谢工程的基础。尽管在一些动物和微生物中也能分离到一些次生化合物，但目前所发现的次生代谢产物大约有 80%来自植物组织。植物合成次生代谢产物的途径主要有苯丙烷代谢途径、 异戊二烯代谢途径和生物碱合成途径等，如下图1。:甲羟戊酸炉*倍半詰(椁酚、赤為索),鲨烯PAS图1植物主要次生代谢途径以下介绍几种次生代谢产物合成途径。1.1黄酮类化合物(flavonoids )1.1.1黄酮类化合物结构与分类黄酮类化合物(flavonoids )是一类重要的天然有机化合物，是植物在长期 自然选择过程中产生的一类次生代谢
5、产物。黄酮类化合物具有 2-苯基色原酮(flavone )结构，它们分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，故又称黄碱素或黄酮。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态(苷元)的形式存在。依据中央三 碳链的氧化程度、B环连接位置(2-位或3-位)以及三碳链是否成环等特点,可将 主要的黄酮类化合物分为黄酮类、异黄酮类、查耳酮类、花色素类以及黄烷酮类2绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，它在植物的生长、发育、开花、结 果以及抗菌防病等方起着重要的作用。图2黄酮类化合物母核结构21.1.2黄酮类化合物生物合成途径3大量实验证实，植物黄酮类生物
6、合成的前期途径是相同的，都是以丙二酸单 酰CoA( malonyl CoA)与香豆酰CoA( coumaro yl-CoA)为直接前体,如图3。这 两种前体分别与糖代谢、脂质代谢以及氨基酸代谢有关。除了这3种初级代谢外， 黄酮类的生物合成还与某些次级代谢有关。如番茄红素 (ly copene )的生物合成以乙酰CoA为前体,而乙酰CoA恰好也是类黄酮生物合成的直接前体丙二酸 单酰CoA的来源。经过长期进化，植物黄酮类合成代谢的后期途径往往产生物种 特异性。如异黄酮类(isoflav o no id) 合成代谢途径通常只存在于豆科植物与个别裸子植物中。PAL-丙氨襲解氨酗 匚舶罰杜襲削渥 4灶斗
7、曲臣嘏：1：皿连按斷4帶豆戲口川连攪餉 L2-乙盛1：川拔优酵CHS-耳刑合应酶CHI-gJ异构脚F3H-氢黄SR供化凿JFS黄酣合成酶FLS黄剖醉合成餉片弘 黄陶类孑虽化怕F姑-黄鬧舍成的Hit-二氯黄醐醇月-述恳酣 背盍合腔秸3GT-黄鬧李W羊葡鞋施垄巒阳昴黄酣书宰5基臨虚线刑头表示淫羊牯特有黄酮类生物合成的椎途甩PA L-ph yl4iliiiii, am 川们口1111丫血$ C 4H -r in n j hi u Ir -44tydr xy I us f 斗 CL -4-oHmaodlr: coe nzy mar A li 呂炉 f ( 4 -uniijiniyl- (:d “尉汕
8、A.A(：-awty Cn A rarlwKylafip CllSr ha Im ne synth e (u 131 fdi fil ron isn-mfirias s IIH* h v jdu i -Hliy- d rexylase IFS-i沁f邮nr： symhast- FL-fhivoia(4 synlhae F3 H, flavothiitl-3 -h ydroKyltte FNS-flavmnr synt hDFH-ililiydrcpfLiw d J-rtdu rtust- ANS-urithoi-yanidhi 苦乍iiLh山沁 3GT-fhv-unhlT韦lucd綽Itrii
9、nsft-rabt- IM OT一 bicLavne-fJ =mKhy 1 trJinsfrrajm*; Dml Irdl urrawn rpriznt mff!r!nlial binsyn1 path.ways 2),含有两个异戊二烯单位的称为单萜,含有三个异戊二烯单位的称为 倍半萜,含有四个异戊二烯单位的则称为二萜,以此类推。倍半萜约有7 000多 种，是萜类化合物中最大的一类。二萜类以上的也称“高萜类化合物” ,一般不具挥发性。此外,有的萜类化合物分子中具有不同的碳环数，因此又进一步区分为链萜、单环萜、双环萜、三环萜等。其中,单萜和倍半萜及其简单含氧衍生物是挥发油的主要成分，而二萜是形成
10、树脂的主要成分，三萜则以皂甙的形式广泛存 在。萜类化合物是挥发油（又称香精油）的主要成分，从植物的花、果、叶、 茎、根中得到有挥发性和香味的油状物，其作用有一定的生理活性，如痰、止咳、驱风、发汗、驱虫、镇痛。图4几种萜类化合物的结构1.2.2萜类化合物生物合成途径在植物细胞质中通过萜类生物合成的前体均为异戊二烯焦磷酸（IPP） , IPP乙酰CoA始的甲羟戊酸途径（MVA pathway）合成；在植物质体、细菌、蓝细菌中 经由丙酮酸起始的非甲羟戊酸途径（non 2MVApathway）,亦称5-磷酸脱氧木酮糖途径（DXP pathway ）合成（图5） , IPP再经过重复叠加形成一系列异戊二
11、烯二磷 酸同系物，在特异的萜类合酶的作用下产生各种萜类的骨架 （图6）。高等植物中 的单萜和二萜合成的IPP来源于DX途径,而倍半萜生物合成的IPP既可来源于 MV途径,也可来源于DX途径。植物萜类化合物的生物合成受关键酶与限速酶的调控,如转移酶、合酶、环化酶等。其中,关键酶的表达决定代谢途径的启动及相 关特定物质的合成，而限速酶的表达则与物质的合成量相关。萜类合酶是萜类生 物合成的关键酶，是研究萜类代谢途径的重点。ftM斛斟网 O 2?J1tSIWIiDAMPP)那图5 IPP生物合成的甲羟戊酸途径（a）和非甲羟戊酸途径（b）颖滌豔护OPMi胜|屈轉欷cmIswb（fpp：i霸！!好1锹絢图
12、6由IPP生成萜类化合物1.3 生物碱（ alkaloid ）1.3.1 生物碱定义及分类生物碱（ alkaloid ）是存在于自然界（主要为植物，但有的也存在于动物） 中的一类含氮的碱性有机化合物， 有似碱的性质， 所以过去又称为赝碱。 大多数 有复杂的环状结构， 氮素多包含在环内， 有显著的生物活性， 是中草药中重要的 有效成分之一。具有光学活性。有些不含碱性而来源于植物的含氮有机化合物， 有明显的生物活性， 故仍包括在生物碱的范围内。 而有些来源于天然的含氮有机 化合物，如某些维生素、氨基酸、肽类，习惯上又不属于“生物碱 。生物碱的 发现始于 19世纪初，是人们研究得最早而且最多的一类天
13、然有机化台物。 据统计， 已知生物碱种类很多，约在 2000种以上，有一些结构式还没有完全确定。它 们结构比较复杂，可分为 59种类型。生物碱的分类方法较多。按其植物来源可分为茄科生物碱、毛茛科生物碱、 百合科生物碱、罂粟科生物碱等； 按其生理作用可分为降压生物碱、 驱虫生物碱、 镇痛生物碱、抗疟生物碱等；按其性质可分为挥发碱、酚性碱、弱碱、强碱、水 溶碱、季铵碱等 7 。药用生物碱临床应用主要表现为抗癌、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎作用， 同时还可以作用于神经系统和心血管系统。1.3.2 生物碱生物合成途径大多数生物碱分子都是由L-氨基酸（如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和 精氨酸等 ）单独
14、合成, 或者与类固醇、 类裂环烯醚萜 （如次番木鳖苷 ）或其他类萜配 基结合生成。根据合成前体不同 , 生物碱可分为真生物碱、 伪生物碱和原生物碱。 真生物碱和原生物碱都是氨基酸衍生物 ,但后者不含杂氮环 , 而伪生物碱则不来 源于氨基酸 , 是由萜类、嘌呤和甾类化合物转化而来。普通氨基酸经三羧酸循环 一两次转变即可成为具高度特异性的生物碱合成前体。目前研究发现 , 植物生物碱的主要类型为萜类吲哚生物碱、 苄基异喹啉生物碱、 茛菪碱、烟碱和嘌呤生物碱等 , 这些生物碱在植物体内均有其特定的生物合成途 径。如烟碱和茛菪碱等生物碱的合成前体为鸟氨酸，腐胺-N-甲基转移酶、托品酮 还原酶、东茛菪胺羟
15、基化酶等为该类物质生物合成的关键酶。莽單酸迷径Shikimic acid pathwayA B12.药用植物次生代谢工程的主要策略植物的次生代谢基因工程中，大多是通过转入某些关键酶的基因或其反义基因，促进或抑制该基因的表达，而引起植物次生代谢产物发生改变。分析整个细胞代谢产物的理论合成图(图7)不难发现，调控特殊代谢物积累水平的策略有 很多，包括：代谢产物的生物转化；增强关键酶的表达或活性；阻止关键酶的反馈抑制；降低竞争途径的代谢流向；增强途径中多个基因的表达或活性； 增强目 的产物的转运与释放；增加新的支路与产物。在实际应用中，目前只有部分策略得到了实验的证实，其中关键酶基因的过量表达应用较
16、多。关键酶往往位于代谢途径中的支路分叉口或合成途径的下游， 它们对特定代谢物的合成和积累往往起到限速作用， 所以过量表达关键酶基因可 大大提高终产物的含量； 另外，转录因子可以调控整个代谢途径， 这为代谢工程 的发展打开了一条快速通道； 转运蛋白的过量表达可以快速将有毒的化合物从胞 内转运到胞间，也可以增加目的化合物的合成。3.药用植物次生代谢工程的研究进展植物次生代谢物的重要应用价值和日益成熟的植物基因工程技术， 促进了植 物次生代谢工程的研究， 人们已经初步完成了黄酮类、 生物碱和萜类化合物生物 合成途径中多数基因的分离和功能验证工作，并取得了部分研究成果。(1)植物的次生代谢基因工程中，
17、 大多是通过转入或者剔除某些关键酶基因， 促进或抑制该基因的表达，而引起植物次生代谢产物发生改变 9 。通过反义 RNA 和RN干涉等技术降低目标基因的表达水平，从而抑制竞争性代谢途径，改变代 谢流和增加目标物质的含量。如Davies等在开白花和深粉红色花的矮牵牛变种中转入苜蓿的查尔酮还原酶( CHS) , 分别得到了开黄色花和浅粉红色花的转基因植株 10 。这是因为转入 的查尔酮还原酶与受体细胞自身的查尔酮合成酶协同作用生成了异甘草根亭基 质( Isoliquirit igenin) , 而该化合物不能为矮牵牛的查尔酮异构酶催化 , 造成6-脱氧查尔酮衍生物的积累。Allen 11 等研表明
18、 , 阻断罂粟中产生吗啡的代谢途径 , 会导致香荔枝碱( reticuline) 及其甲酯的积累。Huang 12 等在大肠杆菌中导入经改造后去掉了氨基端 78 个氨基酸的紫杉烯 合酶( taxadiene synthase) 基因, 从而获得了能高效表达的可溶性酶 , 在胞外可使70%勺GGD生成紫杉烯。段小瑜冋等从大豆总RNA中分离了合成异黄酮的关键酶异黄酮合酶( isoflavone synthase, IFS) 基因 , 含1583个核苷酸 , 与已报道的大豆异黄酮 合酶基因的核苷酸同源性为 92%。(2)代谢工程不但可以修饰或扩展寄主植物中本身已经存在的途径，还可以 转化其他目标植物
19、， 在植物细胞内存在反应底物的基础上，使转基因植物启动 新的次生代谢物合成支路 14 。唐克轩教授课题组15将PMT（1,4- 丁二胺-氮甲基转移酶）基因和H 6H （莨菪碱 6- B -羟化酶）基因共转化莨菪,使转基因莨菪发根中东莨菪碱含量（411mg.L -1 ） 比野生型 （ 43 mg.L -1 ） 提高了9倍, 大大提高了莨菪烷类生物碱的合成与积累。将葡萄STSS因转化番茄后不但表达了白藜芦醇及其糖苷衍生物， 而且转基因植物抗氧化能力提高两倍 16。Jay D Keasling 17等采用一系列的基因调控方法 , 通过基因工程酵母合成了 青蒿素的前体物质 -青蒿酸。将胡萝卜素代谢途径
20、下游的四个关键酶 （八氢番茄红素合成酶、 八氢番茄红素 去饱和酶、B -胡萝卜素去饱和酶和番茄红素环化酶）基因共同导入水稻中，其 协同表达使转基因水稻胚乳中合成和积累了 B -胡萝卜素（维生素A原）,成为表 明黄色、富含 VA 的“黄金稻” 18。（3） 代谢工程的一个新策略是以信号途径和转录因子为调控靶标。 对控制多个生 物合成基因的转录因子进行修饰 , 将更有效地调控植物次生代谢以提高特定化合 物的积累 19。如对长春花二萜类吲哚生物碱生物合成途径上的、具有 AP2 /ERF功能域的转录因子0RCA3高表达,会导致几种与二萜类吲哚生物碱生物合成相关基因的过 量表达以及二萜类吲哚生物碱累积
21、20。4.问题及展望近年来 , 植物药以其天然低毒的特点倍受青睐，由于部分天然活性物质的作 用机理尚不清楚 , 要进一步开发植物药物， 需要加强深层次的研究， 特别应加强 关于其构效关系的研究。 在弄清构效关系的基础上就能够以所提取的天然活性 物质为先导化合物来进行结构改造和结构优化， 使其具有针对性和高效性， 这样 必将会开发出新一代的药物，对新药的发展产生重大的影响。到目前为止植物细胞中天然活性物质的低产问题也未得到很好解决。植物体 内的次生代谢物质的生物合成非常容易受外界因素的影响 , 植物次生代谢产物 的多样性及其相关酶和基因表达调控的复杂性增加了植物次生代谢工程的难度， 人们在代谢途
22、径的总体调控以及次生代谢途径之间的协调等方面，仍然了解甚 少，如何掌握好植物次生代谢的调控规律对从药用植物中提取高质量的天然活性物质有重要意义虽然存在着很多问题，但是在植物药功能基因研究中 , 与基因组测序相比 , 药用植物次生代谢工程的研究是药用植物基因研究中最为活跃的领域 , 进展较 快, 吸引了大批的科研工作者从植物化学、植物生理学、生物化学及分子生物学 等方面进行了系列研究 , 并取得了一定的实践经验和理论成果。 现代科技日新月 异 , 植物次生代谢基因工程必将为人类更好地利用植物资源做出更大的贡献。参考文献1何水林，郑金贵，王晓峰， 等. 植物次生代谢 : 功能、调控及其基因工程 J
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