1、统计学方法在药学研发生产与质量管理中的应用统计学方法在药学研发、生产与质量管理中的应用(2014-05-30 20:37:17)分类：专业知识与综合材料统计学方法在药学研发、生产与质量管理中的应用代骏豪，郑强（北京大学药物信息与工程研究中心，北京大学工学院工业工程与管理系，北京 100871）DAI Jun-hao, ZHENG Qiang(Center for Pharmaceutical Information and Engineering Research, Peking University, Beijing 100871, China; Department of Industry
2、 Engineering and Management, College of Engineering, Peking University, Beijing 100871, China)摘要 本文综述统计学在药品的化学、生产、控制和质量管理中的应用，涵盖试验设计，配方和工艺优化，稳定性研究和有效期确定，分析方法验证，中间控制和放行标准制定，工艺和质量监测，取样方案。综述关注统计学方法与制药领域应用的联系，系统地梳理了统计学方法对制药领域具体问题的适用性，以及监管部门对统计学应用的要求和引导。关键词 统计学；化学、生产、控制；质量；试验设计；制药应用Application of Statist
3、ics Methodology in Pharmaceutical R&D, Manufacturing and Quality ManagementAbstract A review of pharmaceutical applications of statistics of chemistry, manufacturing, control and quality management, including topics of experimental design, formulation and process optimization, stability study and sh
4、elf life determination, analytical method validation, in-process control and releasing specification determination, process and quality monitoring, and sampling. The review focuses on the linkage between the methodology of statistics and the pharmaceutical application, aiming to gain understanding o
5、n how to choose proper statistical methods for particular tasks. The relationship between the usage of statistics and the regulatory requirement and encouragement is also presented.Key words statistics; chemistry, manufacturing, control; quality; design of experiment, pharmaceutical application监管科学是
6、关于发展新工具、标准及方式来评估药物安全性、有效性、质量可控性及效用的科学，是基于量化数据的科学。药物的安全性和有效性，往往是基于临床试验或观测数据，与这类数据相关的试验设计及分析方法是生物统计学范畴，无论在学术界和企业界都受到长期和积极的关注。相比之下，与药物的配方和工艺研究、生产与质量管理相关的统计学应用，虽然历史悠久，但学术界和企业界的重视程度一直偏低。这种重视程度的差别可能与药品监管部门在注册审评及上市后监管方面对统计学应用要求的高低有关。随着仿制药（又名“通用名药”或“学名药”）在整个药品处方量中所占比例的逐年提高（2013年美国市场的仿制药处方量占总处方量的84%1），各国监管部门
7、对与药学研发、生产与质量管理领域的统计学要求也逐渐提高。部分原因是仿制药的安全问题主要源于药学研发与生产中的质量问题。同时，与原研药和品牌药相比，仿制药是薄利多销产业，成本控制至关重要。在全球劳动力和原料成本日益增高的大趋势下，企业自身也有内在的动力在保证质量和合规的前提下，降低研发和生产成本。而统计学方法是已被传统制造业证明有效的解决方法。在监管要求和企业自身动因的驱动下，预期统计学方法在药学研究和生产质量管理方面的应用会迎来快速发展阶段。从我们自己的教学与研究中发现，国内企业和药品监管部门广泛使用统计学工具2345，但对工具所基于的前提条件、何时该使用何种工具收集哪些数据、使用时应重点关注
8、的点等，并不熟悉。因此，难以看清形式上复杂的数学公式中关键变量和参数所代表的实际意义，难以真正达到使用统计学方法的目的。本文第一部分综述美国的法规政策要求。第二部分综述常用的统计学方法。第三部分综述现阶段常见的统计学应用。1涉及的法规政策2002年8月，美国食品药品管理局（FDA，Food and Drug Administration）启动了“21世纪药品生产质量管理规范（CGMP，Current Good Manufacturing Practice）”计划6。此后，FDA相继采纳发布了人用药品注册技术要求国际协调会（ICH，International Conference on Harm
9、onization）指南Q8药品开发7，Q9质量风险管理8和Q10药品质量体系9，最终于2011年发布了工艺验证：一般原则与规范指南10（后文简称“工艺验证指南”）。Q8中提到，“保证药品质量不能依靠检验，而应当将质量设计于药品之中”。Q9中建议，“使用统计学工具支持和促进质量风险管理，帮助做出更可靠的决策。”Q10中建议，“生产企业应当运用统计学工具，识别影响工艺性能和产品质量的变异（variation）来源，持续改进地减少或控制变异”。工艺验证指南将“工艺验证”的概念重新定义为，“收集和评估从工艺设计到商业化生产全过程的数据，用于建立科学的证据，保证工艺有能力持续地生产出质量有保障的产品”
10、。这些行动表明，美国的药品质量监管政策正在从传统的“检验合格”11（test to compliance）转向“质量源于设计”（QbD，Quality by Design），重视在药品开发和生产中使用量化的证据。这样的转变将促使统计学的应用形成规范，而非企业的自由实践。美国联邦法规（CFR，Code of Federal Regulations），FDA发布的行业指南和采纳发布的ICH指南，以及美国药典（USP，The United States Pharmacopeia）发布的标准均涉及统计学方法的建议和要求。CFR第21卷21012、21113部分（21 CFR 210211）CGMP是联
11、邦食品、药品和化妆品法案（FDCA，Federal Food, Drug, and Cosmetic Act）第501(a)(2)(B)和701(a)条授权下具有法律约束力的行政规章，法规中直接提到对稳定性研究和有效期确定、分析方法验证、中间控制和放行标准制定、工艺和质量监测、取样等方面的统计学要求14。FDA发布的行业指南是CGMP法规的实施指导。FDA发布的指南和采纳发布的ICH指南涉及配方和工艺优化、稳定性研究和有效期确定、分析方法验证、中间控制和放行标准制定、工艺和质量监测和取样等方面的统计学要求。其中，工艺验证指南建议工艺验证团队中包含统计学人员，“强烈建议”企业应用统计学等客观度量
12、方法识别和刻画变异，在工艺验证方案中描述用于分析收集数据的统计学方法，定义批内和批间变异的统计学指标。USP的标准制定也有统计学考虑。美国药典委员会下设统计学专家委员会，负责开展药典附录的编纂工作，帮助药典使用者正确地运用统计学工具处理数据，不断改进和完善现有附录中与统计学数据处理相关的附录，确保药典中所有标准的制定和更新都建立在可靠的科学和统计学原则之上，并为其它专业委员会提供统计学及生物统计学方面的支持15。表1 各应用方面的监管要求、主要法规政策和常用统计学方法应用方面监管要求主要法规政策常用统计学方法配方和工艺优化在配方和工艺开发中运用试验设计的方法理解产品和工艺。确定物料属性和工艺参
13、数与关键质量属性的关系，系统地识别变异来源FDA指南工艺分析技术ICH指南Q8（R2）ICH指南Q11试验设计稳定性研究和有效期确定样本量和检验间隔基于统计学标准，以保证对稳定性合理的估计21 CFR211.166ICH指南Q1A(R2)ICH指南Q1DICH指南Q1EICH指南Q5C试验设计分析方法验证证明和记录检验方法精密度、灵敏度、专一性和重复性21 CFR211.165ICH指南Q2(R1)试验设计中间控制和放行标准制定合理的中间控制质量标准应当运用恰当的统计学方法确定，放行标准应保证药品批次满足恰当的质量标准和统计质量控制标准21 CFR211.11021 CFR211.165USP
14、 37统计工艺控制验收取样工艺和质量监测收集物料、中间产品和成品的质量数据，通过统计工艺控制方法持续监控工艺趋势，评价工艺能力21 CFR211.110FDA指南工艺分析技术FDA指南药品CGMP法规的质量体系方法FDA指南工艺验证ICH指南Q8（R2）统计工艺控制取样方案取样容器数和每个容器应取的物料量，应当依据恰当的标准，如变异性、置信区间、精确度等统计学标准21 CFR211.84FDA指南工艺验证验收取样1.1配方和工艺优化FDA工艺分析技术创新药品开发、生产和质量保证的框架指南16建议，对于配方和工艺的知识来自于对多因子关系的科学理解，可以得益于运用多变量数学方法，如试验设计，响应曲
15、面等方法。数学关系和模型知识的适用性、可靠性可以通过对模型预测能力的全面统计学评估得到。ICH指南Q8（R2）药品开发提出“质量源于设计”的理念，建议在配方和工艺开发中运用试验设计的方法理解产品和工艺。Q11原料药开发和生产17建议，通过试验设计的方法识别和确定物料属性和工艺参数与关键质量属性的关系，系统地识别变异来源。1.2稳定性研究和有效期确定21 CFR211.166小节“稳定性研究”要求，“样本量和检验间隔应当基于统计学标准，以保证对稳定性合理的估计。”ICH指南Q1A(R2)18新原料药和制剂的稳定性研究，Q1D19括弧法和矩阵法设计应用于新原料药和制剂的稳定性研究，Q1E20评估稳
16、定性数据和Q5C21生物技术产品的质量：生物技术产品和生物制品的稳定性研究均涉及稳定性研究的统计学考虑。1.3分析方法验证21 CFR211.165小节“成品检验和放行”要求，“证明和记录分析方法的精密度、灵敏度、专一性和重复性”。FDA治疗性蛋白免疫原性分析方法开发指南草案22中建议，应当采用统计学方法，通过阴性对照样本确定分析方法的临界点。生物分析方法验证指南草案23建议，响应方程通过恰当的统计学检验。药品和生物制品的分析流程和分析方法验证指南草案24建议，运用统计学方法分析验证数据、对比分析方法。ICH指南Q2(R1)分析方法验证：文本和方法论25涉及分析方法验证的统计学考虑。1.4中间
17、控制和放行标准制定21 CFR211.110小节“中间产品和成品取样和检验”要求，“合理的中间控制质量标准应当与药品最终质量标准一致。如果可能，应当由历史中可接受的工艺均值和变异估计得到。适用时，应当运用恰当的统计学方法确定。”211.165小节“成品检验和放行”要求，“质量部门的取样和检验的接受标准应恰当地保证药品批次满足每一项恰当的质量标准和统计质量控制标准，作为批准放行的条件。统计质量控制标准应当包含恰当的接受水平和（或）拒绝水平。”USP 37凡例中说明，“个论、附录和凡例有关的标准，从药品生产到有效期期间的所有时间都适用。生产者的质量标准，CGMP实践（包括诸如质量源于设计的提议）都
18、必须保证药品在有效期内符合药典标准。也就意味着，药典收录的药品一旦经过药典流程检验，必须符合标准以表明合规。尽管有时药典标准涉及统计学流程，取多个样本，通过顺序的流程设计确定被测样本是否符合标准，但所有情况下，关于是否符合药典标准的结论都只适用于被检验的样本。检验的重复，统计学拒绝异常值，将检验结果外推到更大范围，合适的批检验频率，都不在USP中论述。企业可以根据药品特征，制定适合于风险的中间控制和放行标准，在一定的置信度上保证药品凡经检验，都符合标准。”261.5工艺和质量监测21 CFR211.110小节“中间产品和成品取样和检验”要求，“应当建立书面的中间控制规程，对每批产品的中间物料取
19、样检验，监测可能对中间物料和药品质量属性带来变异工艺。”FDA工艺分析技术创新药品开发、生产和质量保证的框架指南建议，多变量统计工艺控制可以发挥实时测量的优势。药品CGMP法规的质量体系途径指南27建议，通过统计工艺控制方法持续识别和评估工艺趋势。正电子放射断层造影剂CGMP指南28建议，恰当的实验室控制可以采用统计工艺控制的方法对质量属性连续地监测。工艺验证指南建议，在日常生产中持续地收集相关工艺趋势，物料、中间产品和成品的质量数据，由经专门训练的人员负责统计学趋势分析并审核。建议由统计学家或受过充分的统计工艺控制技能训练的人员制定数据收集方案和用于衡量工艺稳定性和工艺能力的统计学方法和流程
20、。ICH 指南Q8（R2）药品开发指南建议，在生产中运用统计工艺控制的方法监测生产工艺。Q9质量风险管理列出建议使用的常用统计学工具，包括控制图，工艺能力分析等。1.6取样方案21 CFR211.84小节“物料取样和检验”要求，“取样容器数和每个容器应取的物料量，应当依据恰当的标准，如成分变异性、置信区间、精确度等统计学标准。”FDA工艺验证指南中建议，取样样本量应足以达到充分的统计学置信程度，保证批内和批间质量。2常用统计学方法试验设计（DoE，Design of Experiments）、统计工艺控制（SPC，Statistical Process Control）和验收取样（accept
21、ance sampling）分别是“质量源于设计”，“质量源于生产”和“质量源于检验”三个质量管理阶段的主要统计学方法。2.1试验设计试验设计是“质量源于设计”阶段常用的质量管理方法，用于研究影响因子（factor）和响应变量（response）的关系。试验中干扰因子的存在使得即便将影响因子控制在相同水平，试验结果也无法精确重复。干扰因子可分为三类，第一类是可测且可控的干扰因子，例如在研究工艺参数对质量属性的影响时，原料批间差异的干扰。这类干扰可以通过区组设计等方法排除。第二类是可测而不可控（不论是技术原因还是成本考虑）的干扰因子，例如压片室环境湿度的变化。这类干扰可通过协方差分析等方法排除。
22、第三类是不可测或不可知的干扰因子，可以看作工艺各个步骤中许多微小扰动引起的试验结果的随机波动。试验设计方法用于在干扰因子的存在下，用尽量少的试验数，得出影响因子与响应变量关系尽量可靠的结论。试验设计按目的通常可分为两个阶段，第一阶段为因子筛选（screening）试验，用形式简单而精确度较低的数学模型，通过较少试验从候选因子中筛选出少数对响应变量有显著影响的重要因子。第二阶段为响应曲面（response surface）的刻画（characterization）试验，用较为复杂的数学模型，得到这些重要影响因子与响应变量较为精确的函数关系。本节综述试验设计的基本原理和常用的设计29303132。
23、2.1.1基本原理试验设计的基本原理是用经验模型近似影响因子和响应变量之间的真实函数关系。在经验模型中引入随机波动后成为统计模型。统计模型在一些前提假设上得到的统计学性质，用于指导试验点的选取，估计经验模型的参数并评估估计的精确性，评价经验模型选取的恰当性。当影响因子为连续型变量时，经验模型可以用连续函数表示，用回归分析等统计学方法求解。而当影响因子为非连续型变量时，经验模型不是连续方程，需要用方差分析等统计学流程解决。A.连续型变量试验设计研究因子x1（例如，压片速度）和x2（例如，压片压力），对响应变量y（例如，30分钟溶出度）的影响。控制其余条件不变，影响因子x1，x2和响应变量y的关系
24、可以用函数y=g(x1, x2)表示。一般地，y和f个因子的相关关系，可以用函数y=g(x1, x2., xf)表示。多数情况下，真实的函数关系未知，需要选取恰当的函数形式近似。最简单的经验模型只包含常数项和一次项系数： （1）其中，n是试验数。xij称为第i个试验中第j个因子的取值水平，共f个因子。y1是对应的响应变量取值。参数0和j分别是经验模型的常数项和一次项系数，共p=f 1个参数。将随机波动记作随机误差i，（1）式改写为统计模型：（2）用矩阵形式表示：（3）其中，X是(np)矩阵，y是(n1)向量，是(p1)向量，是(n1)向量。当i服从互不相关的、均值为零且方差Var(i)=2的统
25、计分布时，可求得的最小二乘估计：（4）由n个试验的观测值计算得出，是随机向量，即在相同条件下重复n个试验，将得到新的值。的协方差矩阵Cov( )衡量重复试验中得到的估计值 在真实值附近的波动大小： （5）在随机波动大小2确定时，的协方差矩阵仅依赖于矩阵X，即试验设计中各因子水平的选取，不依赖于试验结果。下文将介绍的常用设计中因子水平的选取原则，均以的协方差矩阵为基础。特别当(XTX)为对角矩阵时，参数的估计值之间相互独立，称设计具备正交性（orthogonality）。进一步当i服从正态分布时，j服从正态分布，可以构造参数j的置信区间，评价估计的精确度。也可以利用假设检验（一次试验得到的估计值
26、j是否比给定的边界值更极端，以至于不太可能在j=0成立时得到）、计算p值（在j=0成立时，出现比一次试验得到的估计值j更极端结果的概率）等统计学流程，检验参数估计值的统计学显著性。参数j统计学显著意味着有信心认为因子有不为零的效应（j0 ），效应大小是否有实际意义则需要结合实情判断。得到估计值 后，可以预测响应变量y在某点x=x0处的平均响应 = 。预测值是随机变量，服从均值为，方差为的正态分布。可以构造y(x0)的置信区间（又称为“预测区间”），评价模型在x=x0处预测平均响应值的精确度。预测精确度也是评价试验设计的重要指标。注意，如果i背离互不相关性或零均值、同方差前提，估计值将存在系统偏
27、倚（bias）。如果i背离正态性前提，置信区间、统计推断和预测区间等结论将不可靠。在得出结论前应当先检验模型假设的符合性。在一些不符合的情形下，可以尝试数据变换33、改用更复杂的线性模型34或改用广义线性模型35等修正措施。B.非连续型变量的试验设计研究因子A（例如，填充剂类型，乳糖、磷酸钙和微晶纤维素）和B（例如，压片机型号，甲、乙和丙），对响应变量y（例如，30分钟溶出度）的影响。由于A和B是非连续型变量，不能用连续函数表示与A和B的关系，常用效应模型表示：（6）其中，n是A和B所有水平组合的试验的重复次数。yijk是响应变量在第k次重复中，因子A在第i水平，因子B在第j水平时的取值。参数
28、称为总均值效应。参数i称为因子A在第i水平的主效应，共a水平。参数j称为因子B在第j水平的主效应，共b水平。参数()ij称为i与j的交互效应（interaction）。多于两因子的效应模型类似地包含总均值效应、主效应、交互效应和随机误差项。当随机误差ijk服从互不相关的、零均值且同方差2的正态分布时，可求得各参数的最小二乘估计。方差分析（ANOVA，ANalysis Of VAriance）等方法可以检验因子效应的统计学显著性，评价估计的精确度。在得出结论前同样应当先检验模型假设的符合性。当因子有确切的取值水平时，称模型为固定效应模型（fixed effect model）。当因子的取值水平随
29、机，称模型为随机效应模型（random effect model）。两类模型的统计学流程和解释均有差异。固定效应模型的结论只适用于参与研究的水平，而随机效应模型的结论可以外推到随机选取的任意水平，并可以通过方差成分分析（variance component analysis）方法计算模型中各因子变异和随机误差分别对总变异的贡献。例如，研究乳糖、磷酸钙和微晶纤维素三种填充剂类型的试验，适用于固定效应模型，结论只适用于参与研究的三种填充剂；而任选三个批次用于稳定性研究，适用于随机效应模型，结论可以外推到随机选取的其它批次。2.1.2因子筛选设计因子筛选试验通过形式简单而精确度较低的经验模型，从候选
30、因子中筛选出少数对响应变量有显著影响的因子。因子为连续型变量时，通常采用带常数项、一次项和交互效应项的经验模型：（7）参数0，j，jk和jkl等分别是经验模型的常数项、一次项系数、一阶交互效应项系数和高阶交互效应项系数，共p=2f个。参与研究的因子一般多于两个，因子取值一般仅两水平，所需试验数相对少。筛选试验的经验模型与真实函数的近似度不高，不宜用于预测响应变量的取值。A.两水平全析因设计两水平全析因设计（2fFD，Factorial Design）适用于因子数较少的筛选试验，试验包含f个因子两水平取值的全部组合，试验数n=2f。以三因子两水平全析因设计（23设计）为例，23设计共需要n=23
31、=8个试验，研究空间（各因子水平取值范围的几何表述形式）呈立方体，试验点（一次试验中，各因子水平的几何表述形式）是立方体的各顶点，如图1。取值-1和 1分别代表因子的低水平和高水平值。在试验设计中使用规范变量-1和 1对应于自然变量，一方面可以避免由于物理单位不同带来的干扰，另一方面规范变量更容易保证正交性。图1 23全析因设计的几何表述带交互效应项的线性模型共2f个参数，而2f个试验只能求得一组确切的参数，无法估计随机误差i，判断各参数估计值的统计学显著性。通过添加中心点、重复2f个试验等手段可以得到随机误差的估计，但不引入额外试验的统计分析仍然可行，而且广泛应用。效应稀疏原则36（sparsity of effect principle）假定模型中不为零的参数应当占少数，而其余本应为零的参数之所以在一次估计中显现出接近零而不为零的数值，是随机误差的体现，可用于估计随机误差。正态概率图、半正态概率图等定性方法结合定量方法，可以用于推断各模型参数的统计学显著性。B.两水平分式析因设计两水平分式析因设计（ 2f-rFFD，Fractional Factorial D
