1、果酒酵母实验报告果酒酵母的分离纯化及选育果酒是利用新鲜水果为原料，在保存水果原有营养成分的情况下，利用自然发酵或人工添加酵母菌来分解糖分而制造出的具有保健、营养型酒。果酒富含多种氨基酸、维生素及矿物质等营养成分，还含有丰富的生理活性物质，经常适量饮用具有一定的保健作用。酵母品种是酿造果酒的关键因素之一，酵母性状的好坏直接影响到所酿果酒的口感和风味，决定果酒品质的优劣。果酒酵母包括醇酿酒酵母和非酿酒酵母，前者的应用提高了果酒酿造的生产效率，后者的应用则对果酒的总体风味产生积极的影响。野生型果酒酵母经分离纯化后，结合诱变、杂交、原生质体融合、基因工程及其他育种技术，其酿造性能显著提高，酿造的果酒品
2、质明显改善，因此果酒酵母的选育研究得到了重点关注。本实验选用葡萄为原料，分离纯化了3株酵母菌，并对其筛选使其适合果酒酿造。一、实验目的1、学习掌握果酒酵母分离纯化的方法；2、对分离纯化得到的酵母菌进行筛选使其适合果酒酿造。二、实验原理 酿酒酵母细胞透明，呈圆形或椭圆形，形体比较大，一般为712m，含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。优良纯种酵母应具备下列性能：1、除酿酒水果本身的果香外，酵母也应产生良好的果香与酒香。2、生长速度快，有较高的发酵能力，能将糖分全部发酵完。3、具有较高的抗S02能力，有较好的凝集力和较快的沉降速度。4、培养基成分简单，来源广泛，价格低廉，
3、对温度，pH，离子强度，溶氧等环境因素不敏感。5、能在低温或果酒适宜温度下发酵，以保持果香和新鲜清爽的口味。由此可见，酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大。要获得优良的酿酒酵母，必须对其进行分离选育。果酒酵母的筛选应从相应的果品及其种植环境中采样分离，如成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉或果汁和果园的土壤等相关场所。根据实践经验，在果汁和自然发酵的果酒醪液中检出率较高，因为它们的基质环境与酿酒环境很相似。为使我们需要的酵母易于检出，应对采集的样品进行富集培养，通过设置较高的酒精浓度、添加SO2、调整pH等手段抑制不需要的微生物的生长，使希望检出的微生物得到增殖。酵母检出后，应对其的发酵性能进行
4、考察，包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等，这些可通过作生理生化实验和三角瓶小型发酵实验分析和测定。三、实验仪器与材料富集培养基：乳酸马铃薯葡萄糖培养液：马铃薯200g，葡萄糖20g，乳酸20g，蒸馏水1000ml（先将马铃薯去皮、切片，称200g，并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml，制成20%的马铃薯汁，在20%的马铃薯汁中加入乳酸，煮沸融化，加入葡萄糖，补足水分并在121摄氏度条件下，高温灭菌30分钟）酿酒酵母培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，制法同上。器具：15个培养皿、12
5、支试管、4个100ml锥形瓶、3个250ml烧杯、30个试管、30个杜氏管、1个试管架、7个三角瓶，无菌滴管，接种环，酒精灯，玻璃涂棒，冰箱，高温灭菌锅，水浴锅，显微镜，血球计数板，恒温培养箱、恒温摇床。四、实验内容及步骤1、酵母的分离与纯化1.1接种：取成熟的苹果的小块果皮直接接入250ml锥形瓶含有150ml的乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，需要三组，置于28摄氏度恒温摇床中，转速为120，震荡培养48h；将苹果果皮研磨直接接入马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，需要三组，置于29摄氏度恒温培养箱中，培养48h；1.2培养：用无菌吸管吸取上述培养后培养液1ml，置于9ml的无菌水中，稀释为10-1、10-
6、2、10-3、10-4、10-5；1.3分离、纯化：马铃薯葡萄糖培养基溶化后制成平板，用1ml的无菌吸管，分别吸取10-3、10-4、10-5置于培养基表面，用无菌的玻璃涂棒迅速涂抹均匀，培养基做好标记，放于恒温培养箱培养大约两天，培养基倒置，菌落长出后，观察其菌落并用显微镜查菌体数。一般一个单独的菌落可视为一个细胞发育而来，是纯培养，如果结构复杂未得到纯培养，可进行再次分离培养知道纯化为止，步骤如下：A.将融化了的马铃薯葡萄糖琼脂培养基倒入无菌培养皿中，每皿大约15ml，冷凝成平面，记上标记；B.用平板划线法接种（一）右手持接种环，经火焰灭菌，待凉后，挑取菌体培养物少许。（二）左手斜持琼脂平
7、板，于火焰近处将菌涂于琼脂平板上端，来回划线，涂成薄膜（约占平板总表面积的十分之一），划线时接种环与平板表面成3040角，轻轻接触，以腕力在平板表面行轻快地滑移动作，接种环不应划破培养基表面。（三）烧灼接种环，杀灭环上残留细菌，待冷（是否冷却，可先在培养基边缘处试触，若琼脂溶化，表示未凉，稍等再试），从薄膜处取菌作连续平行划线，约占平板表面五分之一左右，再次烧灼接种环，等三次平行划线以同样方法作第四次，第五次划线，将平板表面划完。（四）划线完毕，盖上皿盖，底面向上，用标签注明菌名和组名，置恒温箱中培养，长出菌落即可。2、酵母的筛选与保藏2.1酵母菌种的复筛发酵力实验：取100ml三角瓶，各加入
8、80ml果汁，置于80摄氏度的水浴杀菌5min，冷却到30摄氏度后，按每升接种30ml的比例分别接入酵母种子液，在20摄氏度下发酵。发酵过程中每24小时测定1次三角瓶质量，确定菌株发酵力的强弱。2.2酵母菌的耐受性试验1.用配好的PDA液体培养基，将培养基分别倒入试管与三角瓶中，试管每支10ml，共300ml，三角瓶每瓶50ml、共350ml。再将三角瓶和试管在121高温下灭菌30min。杜氏管倒置放入试管中，保证杜氏管中没有气泡。2.采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（4%、6%、8%、10%、12%）、二氧化硫（40、60、80、100、120mg/l）的耐性。按下表在试管中加入果汁
9、。然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115 20min灭菌。灭菌完后，待试管温度为常温后按下表加入酒精，加完后摇匀。最后在每个编号试管中接入对数期酵母1107个，28静止培养。观察产气情况，选出耐酒度比较好的菌种。将标签贴于各试管上，标10、12、14、16、18，按下表每管加入果汁量：试管编号010121416182095%酒精/mL01.051.261.41.681.902.15果汁/mL108.958.748.608.328.107.85培养液含酒精%（v/v）0101214161820按亚硫酸含量为6% 计， 计算出60、100、120、180、240 mg/L浓度所需的量，
10、分别加入到果汁中制成SO 2 不同浓度系列的液体培养基。按下表加入果汁，然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115 20min灭菌。灭菌完后，待试管温度常温后按上表加亚硫酸（科密欧试剂SO2含量6%），加完后摇匀。最后在每发酵管中接入对数期酵母1107个，28静止培养。观察产气情况，选出耐SO 2比较好的菌种。将标签贴于各试管上，标1、2、3、4、5，按下表每管加入果汁量：试管编号012345亚硫酸/uL01017203040果汁/mL101010101010培养液含SO2mg/L060100120180240将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同浓度二氧化硫的果汁培养基中，在相同条件
11、下培养，观察杜氏管中气泡产生情况。五、实验结果：发酵力实验：菌种对照12345菌198.0g97.8g97.8g97.7g97.7g97.7g菌298.5g98.3g98.2g98.0g98.0g97.9g菌3103.3g103.2g103.1g103.0g103.0g102.9g耐受性实验：菌株2：酒精量（%）4681012杜氏小管产气情况+二氧化硫浓度（mg/L)406080100120杜氏小管产气情况+菌3：酒精量（%）4681012杜氏小管产气情况+二氧化硫浓度（mg/L)406080100120杜氏小管产气情况+实验结果分析：发酵力实验当中，菌种一的失重量为0.3g，菌种二的失重量为
12、0.6g，菌种三的失重量为0.4g，因此，菌种二的发酵力较好。耐受性实验当中，菌种一没有气泡产生，菌种二耐酒精及耐二氧化硫的程度比菌种三要稳定。菌种保藏：本实验采用试管斜面保藏。 果酒酿造：果酒酿造的工艺流程 鲜果分选破碎、除梗果浆分离取汁澄清清汁 发酵倒桶贮酒过滤冷处理调配过滤成品 发酵前的处理前处理包括水果的选别、破碎、压榨、果汁的澄清，果汁的改良等。1碎、除梗： 破碎要求每粒种子破裂，但不能将种子和果梗破碎，否则种子内的油酯、糖苷类物质及果梗内的一些物质会增加酒的苦味。破碎后的果浆立即将果浆与果梗分离，防止果梗中的青草味和苦涩物质溶出。二氧化硫处理： 二氧化硫在果酒中的作用有杀菌、澄清、
13、抗氧化、增酸、使色素和单宁物质溶出、还原作用、使酒的风味变好等。使用二氧化硫有气体二氧化硫及亚硫酸盐，前者可用管道直接通入，后者则需溶于水后加入。发酵基质中二氧化硫浓度为60-100mg/L。（以葡萄酒为例：二氧化硫添加量的计算：葡萄果实70%60/0.061000。）此外，尚需考虑下述因素：原料含糖高时，二氧化硫结合机会增加，用量略增；原料含酸量高时，活性二氧化硫含量高，用量略减；温度高，易被结合且易挥发，用量略减；微生物含量和活性越高、越杂，用量越高；霉变严重，用量增加 。果汁的调整： 取汁测定果汁中糖度和酸度，根据发酵需要调整糖度和酸度。糖的调整： 酿造酒精含量为10%-12%的酒，果汁
14、的糖度需 17-20Bx。如果糖度达不到要求则需加糖，实际加工中常用蔗糖或浓缩汁。酸的调整： 酸可抑制细菌繁殖，使发酵顺利进行；使酒颜色鲜明；使酒味清爽，并具有柔软感；与醇生成酯，增加酒的芳香；增加酒的贮藏性和稳定性。干酒易在0.6%-0.8%，甜酒0.8%-1%一般pH大于3.6或可滴定酸低于0.65%时应该对果汁加酸。3）酒精发酵发酵分主（前）发酵和后发酵，主发酵时，将果汁到入容器内，装入量为容器容积的4/5，然后加入 3%-5%的酵母，搅拌均匀，温度控制在20-28 ，发酵时间随酵母的活性和发酵温度而变化，一般约为3-12天。残糖降为0.4%以下时主发酵结束。然后应进行后发酵，即将酒容器
15、密闭并移至酒窑，在12-28 下放置 1个月左右。发酵结束后要进行澄清，澄清的方法和果汁相同。发酵性能测定测定一个发酵周期内酒精度及含糖量变化，绘制发酵曲线，并对自制果酒进行感官评定，分析测定理化指标（糖度、酒度、酸度）。还原糖、总糖的测定：直接滴定法。总酸的测定：中和滴定法。酒度的测定：蒸馏法。实验结果：4月1日：菲林试剂比色法侧总糖和还原糖。V3=5.4mlX=Fx1/V1X1/V3X1000(F=0.05925) 得x=219.225g4月2日：菲林试剂比色法侧总糖和还原糖。V3=4.4mlX=Fx1/V1X1/V3X1000(F=0.05925) 得x=268.995g4月3日：菲林试剂比色法侧总糖和还原糖。V3=5mlX=Fx1/V1X1/V3X1000(F=0.05925) 得x=237g4月4日：菲林试剂比色法侧总糖和还原糖。V3=6.4mlX=Fx1/V1X1/V3X1000(F=0.05925) 得x=184.86g4月7日：菲林试剂比色法侧总糖和还原糖。V3=9.6mlX=Fx1/V1X1/V3X1000(F=0.05925) 得x=123.24g4月8日：菲林试剂比色法侧总糖和还原糖。V3=13.7mlX=Fx1/V1X1/V3X1000(F=0.05925) 得x=86.505g酒精度：12%
