1、外泌体miRNA研究进展及诊断价值2020外泌体miRNA研究进展及诊断价值恶性肿瘤是一个全球性的重大公共健康问题, 2018年全球约有1 819万肿瘤新增病例以及960万肿瘤死亡病例1。在我国, 恶性肿瘤对社会的影响也不容小觑, 肺癌、胃癌、食管癌、肝癌是我国最常见的恶性肿瘤2。大多数恶性肿瘤早期一般无特异性表现, 并且多数恶性肿瘤患者被确诊时已处于晚期, 失去最佳治疗时机。故早期诊断对于提高恶性肿瘤患者的生存率、减少治疗费用至关重要3。病理活检诊断是恶性肿瘤的金标准, 但因其有创性, 患者需承担较大的风险, 如出血、刺激肿瘤进展、转移等。现有的体液生物标志物, 如癌胚抗原和甲胎蛋白等肿瘤标
2、志物在临床已被广泛应用, 但对肿瘤的诊断敏感性和特异性不高, 而体液中循环肿瘤细胞和游离细胞DNA虽然可以较好地反映肿瘤的发生、发展, 但是其在体液中丰度较低, 不是微创恶性肿瘤诊断的良好生物标志物4。因此, 找到具有特异性强和敏感性高的恶性肿瘤生物标志物作为非侵入性诊断指标至关重要, 而近年来, 外泌体微小RNA（microRNA, miRNA）引起了越来越多的关注。外泌体是细胞分泌并进入体液或细胞外环境的小囊泡。这些囊泡可以从供体传递到受体细胞中, 在细胞间的通讯中发挥关键作用。外泌体的内容物有不同的组分, 例如DNA、RNA、脂质和蛋白质, 其可以一定程度上反映细胞的代谢、癌变、凋亡等。
3、miRNA是外泌体内容物中的一种, 参与恶性肿瘤发生、发展的不同过程, 如癌细胞增殖、血管生成和肿瘤的转移5。由于外泌体miRNA的特性, 是恶性肿瘤诊断中极具潜力的非侵入性生物标志物之一。本文对外泌体miRNA及其在恶性肿瘤中的作用, 外泌体miRNA在恶性肿瘤诊断中的优势与劣势作一综述。1 外泌体miRNA及其提取方法1.1 miRNA与外泌体miRNA外泌体在1983年被Pan等首先发现并命名6, 其膜是由脂质双层结构组成, 直径为30150 nm。外泌体可由多种细胞分泌, 包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、树突状细胞、肿瘤细胞、内皮细胞和间充质干细胞等, 并且在人体内大多体液中都可以发现外泌
4、体的存在, 如尿液、血浆、血清、唾液、脑脊液、腹腔积液和细胞培养上清液等7。外泌体也是细胞之间传递信息的手段之一。在正常生理情况下, 供体细胞可以将遗传物质通过外泌体的“ 运输” 功能转移到靶细胞, 并对靶细胞进行精确调节, 而在病理情况下, 非正常细胞也可以将其包含的病毒、miRNA和癌基因等物质转移至正常状态的细胞中, 从而导致正常细胞被感染、病变或者癌变。由于miRNA在基因表达中重要的调节作用, 所以外泌体miRNA也被广泛研究, 2007年VALADI等8首先发现了外泌体中存在miRNA, 并且可以转移到受体细胞中, 发挥相关的作用。到目前为止, 在外泌体中已发现2 838种miRN
5、A, 并且这些外泌体miRNA在不同疾病和生理条件中表达的水平不同。外泌体miRNA在恶性肿瘤的进程中也发挥重要调节作用, 更重要的是外泌体中的miRNA可以稳定存在, 免受体液中RNA酶的降解, 在4 条件下外泌体miRNA可以稳定保存48 h9, 这同样有利于实验前的标本质量控制, 因此其具有作为体液诊断生物标志物的潜力。1.2 外泌体miRNA的提取虽然外泌体miRNA具有较高的稳定性, 但是其提取方法是对miRNA最终质量的影响因素之一, 不同的提取方法利用外泌体不同的特征进行分离, 例如形状、密度、大小和表面蛋白标记, 因此不同方法对最终提取的外泌体miRNA的种类与含量有着较大差别
6、。超速离心法是实验中常用的一种分离方法, 并且可以通过与其他过滤步骤组合或使用蔗糖密度梯度进一步去除其他杂质来改进, 但其步骤较复杂、耗时较长, 所以并不适合应用于临床实验室。类似的密度梯度离心法可以产生高纯度的外泌体, 但是目前的操作步骤也不适用于检验科的应用, 需要进一步对方法进行改进。商业试剂盒标准化的流程, 较高的分离纯度以及较少的时间更适合临床实验室的应用10。2 外泌体miRNA对恶性肿瘤的影响恶性肿瘤的发生、发展通常与恶性肿瘤细胞本身的增殖、侵袭、转移能力有关, 也和肿瘤生长的环境有很大的联系, 恶性肿瘤细胞所分泌的外泌体miRNA可以调节其他恶性肿瘤细胞以及生长的环境, 最后促
7、进恶性肿瘤的发展。2.1 外泌体miRNA对肿瘤细胞的影响恶性肿瘤患者与正常人群外泌体所携带的miRNA有很大的区别, 并且这些miRNA差异在恶性肿瘤的进程中可以起到重要调节作用, 癌细胞可以通过外泌体释放具有肿瘤抑制作用的miR-23, 这提示肿瘤细胞可以通过这种自我调节, 降低细胞内肿瘤抑制相关的miRNA的浓度以稳定自身状态, 促进自身增殖, 维持肿瘤的持续生长。在恶性肿瘤细胞中的敲低Rab27基因抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭, miR-23的外泌体输出减少, 细胞内miR-23进一步升高12, 因此恶性肿瘤的发生会伴随着外泌体miRNA的释放, 以便在细胞内部创造较好的增殖环境。外泌体m
8、iRNA的分泌除了为自身创造较好环境外, 也会影响其他肿瘤细胞, 促进恶性肿瘤细胞相关功能。鼻咽癌患者体内高表达的外泌体包括miR-24、miR-891、miR-106、miR-20、miR-1908和miR-302, 其可以通过调节丝裂原活化蛋白酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）以及转化生长因子- 受体（transforming growth factor-beta receptor , TGF R ）/ 细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase, ERK）信号通路来调控受体细胞, 进而达
9、到促进恶性肿瘤细胞增殖的作用13, 14。外泌体miRNA也可以在恶性肿瘤的侵袭和转移中发挥作用。miR-21是研究较为广泛的外泌体miRNA之一, 在肝细胞癌中有较高的特异性和诊断价值, 其可通过靶向调控程序性细胞死亡4蛋白（programmed cell death 4, PDCD4）并激活其下游c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）信号通路, 显著增强受体癌细胞的迁移和侵袭能力15, 值得注意的是外泌体miR-10可以靶向抑制Kr ppel样因子4（Kr ppel-like factor 4, KLF4）和同源框蛋白D10（homeobox D1
10、0, HOXD10）mRNA的表达, 最终也可以促进恶性肿瘤细胞的侵袭能力16。在对抗恶性肿瘤化疗药物中, 恶性肿瘤细胞可以通过外泌体进行调控, 从多西紫杉醇抗性乳腺癌中分离的外泌体细胞中含有几种上调的miRNA可降低乳腺癌细胞的化疗敏感性, 但这种特性同时也可以成为监测恶性肿瘤患者特定化疗药物耐药性的手段, 并调节耐药性, 外泌体miR-122可以被运输到肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）细胞对其进行负调控, 提高HCC细胞化疗药物的敏感性, 这方面的应用值得更多的研究, 有较大的临床意义17。2.2 外泌体miRNA对血管和免疫细胞的影响外泌体miRNA
11、还可以通过影响肿瘤微环境为增殖、转移创造较好的环境。血管生成作为恶性肿瘤的主要标志, 是恶性肿瘤进展的重要因素。恶性肿瘤来源的外泌体miRNA, 有助于血管形成。肺癌细胞释放的外泌体miR-21可用通过STAT3依赖性机制诱导血管内皮生长因子的高表达, 促进附近支气管细胞生成血管18。值得注意的是, 在缺氧条件下, 恶性肿瘤细胞将外泌体miR-494释放到其周围内皮细胞中, 通过激活Akt/eNOS途径, 并抑制磷酸酶张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten, PTEN）而促进血管生成19。恶性肿瘤的发生
12、、发展也和其免疫逃逸作用密不可分, 外泌体miRNA可以通过调控免疫细胞, 抑制其正常功能, 促进恶性肿瘤侵袭和进展。首先外泌体miRNA可以转移至T细胞, 导致下调MAPK和JAK / STAT信号通路, 并进一步通过抑制T细胞增殖和辅助性T细胞（T helper cell, Th）1、Th17分化影响T细胞功能。其次外泌体miRNA可以通过与免疫细胞的Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）家族中的TLR7和人TLR8受体结合, 触发TLR介导炎症反应, 最终增加促使细胞增殖和转移潜能的细胞因子。值得注意的是在恶性肿瘤状态下间质细胞也同样可以释放外泌体miRNA,
13、促进恶性肿瘤的进展, 星形胶质细胞可以释放外泌体miR-19, 促进细胞的增殖, 减少细胞的凋亡20。3 外泌体miRNA对恶性肿瘤的诊断价值肿瘤来源细胞miRNA在体液中所表达的种类与含量和正常人群存在差异。体液中外泌体miRNA在肿瘤源性细胞中也有特异性表达。通过这种异常表达, 可以用于早期恶性肿瘤的诊断。在肺癌、前列腺癌、肾细胞癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中都有相关诊断性研究, 并且均表现出较好的准确性, 见表1。值得注意的是, 外泌体miRNA较体液miRNA有更多的优势, 恶性肿瘤患者外泌体miR-21更为丰富, 显著高于全血清中的含量, 并且在进行样本收集时, 外泌体对miRNA的保护
14、可以使得外泌体miRNA稳定存在, 减少miRNA的降解, 有利于样本的实验前质量控制。更为重要的是, 由于外泌体miRNA在恶性肿瘤中的特定作用, 其含有体液循环不具有的特异性miRNA, 这些原因使得外泌体miRNA较体液miRNA诊断更有优势。在胰腺癌中相应的研究也证明外泌体miRNA（miRNA-191、miRNA-21和miRNA-451）在建立肿瘤诊断方面优于血清循环miRNA21, 可以进一步提高其诊断价值。有研究对不同恶性肿瘤类型中外泌体miRNA的诊断价值进行Meta分析, 结果显示外泌体miRNA诊断肺癌的准确性（0.85）高于循环miRNA（0.83）35; 诊断前列腺癌
15、的曲线下面积（area under curve, AUC）为0.90, 高于循环miRNA（0.79）36; 诊断肾癌的AUC为0.93, 高于循环miRNA（0.81）37; 诊断胰腺癌的AUC为0.93, 高于循环miRNA（0.91）38, 这说明外泌体miRNA在多种恶性肿瘤中的诊断价值高于血清循环miRNA。因此, 我们认为外泌体miRNA比循环miRNA具有更高的早期诊断价值。miRNA在恶性肿瘤组织中特异表达, miRNA表达谱在循环中也可检测到, 可以通过肿瘤细胞的分泌出现在体液外泌体miRNA中, 达到区分正常组织、良性肿瘤与恶性肿瘤的作用。因此外泌体miRNA可以起到对恶性
16、肿瘤活检的补偿或者替代作用。另外, 外泌体中含有的组织特异性膜蛋白标记物, 也有助于检测肿瘤来源。前列腺癌患者在尿中会特异性显示癌衍生的外泌体分子标记前列腺癌抗原基因-3（prostate cancer antigen 3, PCA3）或跨膜丝氨酸蛋白酶2（transmembrane protease serine 2, TMPRSS2）, 其可以与外泌体miRNA互相补充以增加诊断特异性。外泌体miRNA不仅可以诊断恶性肿瘤的发生, 还可以深入了解肿瘤的分类或肿瘤的亚型。乳腺癌作为一种具有高度异质性的疾病, 有多种不同亚型, 对于其不同的亚型, 相应的治疗策略也有所不同, 外泌体miR-37
17、3在雌激素受体阴性和黄体酮受体阴性乳腺癌患者的血清水平升高, 为选择方法提供了依据39。此外, 已有研究发现外泌体miRNA可表明肿瘤分期和转移。血浆来源外泌体miR-21显著增加与口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）患者晚期肿瘤阶段与恶性肿瘤转移有关40, 而miR-21不仅可以作为OSCC的标志物, 也可能是其他恶性肿瘤转移的生物标志物, 包括肺癌、卵巢癌等。而在胰腺癌中外泌体miR-17可以作为临床病理特征和预后的标志物41。4 优点及不足恶性肿瘤的早期诊断是提高恶性肿瘤患者存活率的关键步骤, 而外泌体miRNA对于肿瘤的精确诊断提供了一
18、个新的方向。恶性肿瘤细胞的外泌体miRNA的表达谱与肿瘤细胞中miRNA的表达谱几乎相同, 因此在诊断中具有高敏感性和特异性。通过确定源自肿瘤细胞的外泌体miRNA的表达谱, 可以在没有任何肿瘤活组织检查的情况下检查恶性肿瘤组织中的细胞miRNA表达谱。由于许多生物体液中均存在外泌体, 其容易获取, 并且由于外泌体膜中的脂质双层, miRNA在外泌体中被保护免于降解, 在采集的标本中可以稳定存在, 因此有较好的生物标志物潜力。外泌体miRNA还可以提供关于肿瘤等级或分期、肿瘤转移、治疗等的广泛信息, 有重要的临床意义。目前, 外泌体miRNA作为诊断工具来说还有一些不足。对于恶性肿瘤患者的标本
19、选择有争议, 如前列腺癌患者中尿液通常是收集外泌体的较好标本; 而对于血液标本, 选择血清还是血浆样本有较大争议。在相关研究中, 选择血清标本作为研究对象的较多, 血清标本相比于血浆样本可以提取到浓度更高的外泌体及外泌体miRNA, 但是血浆样本的外泌体miRNA诊断准确性高, 而且核酸在含乙二胺四乙酸血浆中的稳定性更佳, 因此样本类型的选择是值得关注的问题。对于不同的恶性肿瘤, 选择合适的外泌体miRNA, 或者一定的组合对于诊断至关重要。对于前列腺癌, miRNA-19较miRNA-25、miRNA-125、miRNA-205来说有更高的诊断价值; 单独的miR-200a、miR-200b
20、、miR200c并没有这3种组合起来对于卵巢癌的诊断价值高28; 而对于肝细胞癌, miRNA-122与miRNA-148再结合其特异性的甲胎蛋白可以使AUC达到0.94742, 满足临床诊断的要求。对于不同地区和种族来说, 特定恶性肿瘤的外泌体miRNA也不完全相同, 因此这些目的外泌体miRNA及其组合需要大量的研究投入, 以达到更好的诊断结果。尽管已经有了许多分离技术, 但外泌体的纯度和质量在不同方法中有所不同, 并且对于外泌体分离和检测仍然没有标准方案, 这也是需要进一步解决的问题。但我们可以预见, 随着更多研究的深入, 新方法、新方案的出现, 外泌体miRNA会在恶性肿瘤的诊断领域有着更广泛的应用。
