1、斑马鱼胚胎发育的分期斑马鱼胚胎发育的分期CHARLES B. KIMMEL, WILLIAM W. BALLARD, SETH R. KIMMEL等 原著俄勒冈大学神经生物学学院；达特茅斯学院生物系黄万旭 译浙江大学生命科学学院摘要：我们对斑马鱼（zebranfish, Danio rerio）胚胎发育的分期作了一系列的阐述。我们定义了胚胎发育的七段时期（period）合子（zygote）、卵裂（cleavage）、囊胚（blastula）、原肠（gastrula）、分节（segmentation）、咽囊（pharyngula），以及孵化期（hatching period）。这一划分强调了发生
2、于受精后头3天的主要发育过程中的变化情况，同时我们也回顾了发生于每一时期的诸如形态发生及其他主要事件。时期的下一划分单位是分期（stage）。各分期都有名称，而非标号，反映了分期序列的灵活性和持续演变过程，因为我们从这一物种中还能得到更多。各分期的命名是基于用解剖立体显微镜（dissecting stereomicroscope）观察活体胚胎所容易观察到的形态学特征为依据的，同时也充分利用了活体胚胎的透明性，这一性质使我们可以用组合显微镜（compound microscope）和Nomarski干涉相差照明（Nomarski interference contrast illuminatio
3、n）观察到即使很深层的结构。显微照相（photomicro-graphs）和组合显微描图（composite camera lucida line drawings）则以图片刻画了每一分期。此外还有一些图像则显示了发育过程中一些可用作分期辅助标志的显著特征。关键词：斑马鱼，形态发生，胚胎发生，合子，卵裂，囊胚，原肠，分节，咽囊，孵化目 录概 述1全文组织结构1步 骤3温度与标准发育时间8合子期（0-0.75h）9卵裂期（0.75-2.25h）9囊胚期（2.25-5.25h）12原肠期 (5.25-10h)16体节期（10-24h）21咽囊期（24-48h）33孵化期（48-72h）42早幼期4
4、8谢 辞4851概 述分期为发育研究提供了准确度。这是因为不同的胚胎即使在同一群体中一起生长，其发育亦有不同程度的差异，我们已看到在斑马鱼发育过程中出现的不同步性。体外同时受精产生的胚胎，孵育于温度合适的稀疏环境（28.5，5-10个胚胎/ml），最早期即出现不同步性，并随时间延续愈加显著。通过对比显示，不同群体中的差异比同一群体中的更大。基因差异能部分说明而不能完全解决这一问题，因为即使来自同一斑马鱼克隆系的胚胎其发育亦有不同步性。就不同胚胎而言，通过形态学标准分期可部分解决这一问题。例如，头部的原始三叉神经感受神经元（primary trigeminal sensory neurons）和
5、躯干的原始运动神经元（primary motoneurons）都是在体节连续沿体轴出现这段时期内开始轴突发生的。通过体节数目分期比通过受精后逝去的时间分期能更准确地预测这些神经元在发育过程中的位置。参照分期序列来记录实验能提供很好的方式确保实验的再现性，并允许随后加入新的观察结果和数据。一系列基于形态学的划分同时也有利于交流，“18-体节胚胎”比“受精后18小时胚胎”这一称谓含有更丰富的意义，尤其在交叉物种比对中。以往的斑马鱼发育分期尽管不如目前的完善，也相当准确地反映了头一天的胚胎发育，并提供了多组有用的图片（Hisaokaand Battle, 1958; Hisaoka and Firl
6、it, 1960）。Warga 和 Kimmel （1990）简要地描述了囊胚期和原肠期。本系列分期的先前版本见于已出版和发行的斑马鱼手册（The Zebrafish Book，Westerfield,1994）一书。新版做了细微的修正和补充，更新版本可以电子版形式在http:/zfish. uoregon.edu获得。表1. 早期发育的各时期时期h描述合子0新受精的卵子完成首个合子细胞周期卵裂0.75细胞周期2至7快速同步发生囊胚2.25快速间时同步（metasynchronous）细胞周期（8，9）在原肠中期转变中变为延长的异步（asynchronous）周期；随后外包（epiboly）开
7、始原肠5.25内卷（involution）、聚合(convergence)和延伸（extension）等形态学运动形成上、下胚层和胚轴；持续到外包运动结束分节10体节、原始咽弓和神经原节（neuromeres）发育；原始器官发生；开始运动；尾部出现咽囊24种系期（phylotypic-stage）胚胎；体轴由先前绕卵黄囊的弯曲状态开始伸直；循环系统、色素沉着和鳍开始发育孵化48原始器官系统完成快速形态发生；软骨在头和鳍中发育；陆续开始孵化早幼72鳔膨胀；觅食及积极的躲避行为全文组织结构我们命名了每一分期，而不是像其他序列那样使用数字编码，因为命名的分期更为灵活且易于记忆和识别。分期的定义不是一
8、个瞬间的时刻点，而只是一个用以近似定位连续发育过程中一小段时间的手段。有了分期命名，我们就可以很容易地加入所知细节，或是为了某一特定的研究在序列中插入一个新的分期，而无需求助于诸如小数、负数、正数这类令人生厌的工具。例如：我们现在描述了一个5-，随后又描述了一个14-，但一项特定的研究可能要用到其间的8个分期（6-体节，7-体节等等），此时我们可以立刻明白其含义（而不必再行描述）。我们强调的是，这里不作描述并不意味将其排斥于分期之外。表2. 胚胎发育的分期a分期hHB描述合子期1-细胞01，2胞质流向动物极，形成胚盘卵裂期2-细胞0.753部分卵裂4-细胞1422排列的卵裂球8-细胞1.255
9、24排列的卵裂球16-细胞1.5644排列的卵裂球32-细胞1.757规则的2层卵裂球，有时48排列64-细胞28规则的3层卵裂球囊胚期128-细胞2.2595层卵裂球；卵裂面不规则256-细胞2.57层卵裂球512-细胞2.759层卵裂球；NO：YSL形成1k-细胞31011层卵裂球；NO：单排YSL核；卵裂细胞周期轻度不同步高囊胚3.3311层卵裂球；胚盘开始变平；NO：2排YSL核；分裂不同步椭形3.6611胚盘变平产生椭球形；NO：多排YSL核球形412球形；胚盘与卵黄之间为水平边界穹顶4.3313仍为球形；当外包开始时，卵黄细胞向动物极顶起30%-外包4.6614胚层如倒置杯状不均一
10、增厚；边缘达动植物极距离30%原肠期50%-外包5.25胚层厚度仍不均一胚环5.66胚环在动物极可见；50%-外包胚盾615胚盾在动物极可见；50%-外包75%-外包816背侧明显增厚；可见上下胚层和排泄（evacuation）区90%-外包9脑原基增厚；脊索原基从节板分离尾芽1017尾芽显著；脊索原基从神经突（neural keel）分离；早期小膨出（polster）；神经突前侧出现中间矢状沟；100%-外包体节期1-体节10.33第一体节沟5-体节11.6618小膨出显著；视囊，Kuperffer囊14-体节1619EL=0.9mm；眼基板；脑神经元，V形躯干体节；NO：前肾导管20-体节
11、1920EL=1.4mm；0.5YE/YB1；YB/HD=2;早期触碰反射和简单的应激运动；视网膜色素沉着；背侧条带达12体节；弱循环；主动脉至尾端一半；主静脉编织；浅胸鳍芽；直尾；NO：尾端细胞退化；第1大动脉弓血液循环原基-2536EL=2.7mm；HTA=75；OVL=1；PF(H/W)=3/4；早期运动；尾部色素沉着，背部条纹加深；强循环；单一大动脉弓对；主静脉达尾部3/4； NO：PF顶端上胚层缘高胸鳍42EL=2.9mm；HTA=55；1/2OVL1；YE/YB=1.5;YB/HD1.3;PF(H/W)=1；去绒膜胚胎游动后背上位静息；YE仍为锥形；PF顶端上胚层缘显著；早期侧带；
12、完整的背侧带；黄素细胞仅见头部；虹膜色素细胞仅见视网膜；心包显著；NO：心腔；血管段；颚弓和舌弓；前肠发育；嗅觉纤毛；耳囊壁增厚孵化期长胸鳍48EL=3.1mm；HTA=45；OVL=1/2；PF(H/W)=2；背上位静息；YE开始变细，PF突出；背腹侧条纹汇于尾部；侧带约6个黑素细胞；视网膜上虹膜色素细胞丰富；头部显著黄色；NO：循环见于2-4大动脉弓及血管段；嗅觉纤毛摆动；半规管（semicircular canal）；神经丘（neuromast）胸鳍60EL=3.3mm；HTA=35；运动迅速难以分辨；YR变细融入YB；侧带约10个黑素细胞；PF变平成鳍形，有明显的循环；视网膜虹膜色素细
13、胞环加深；虹膜色素细胞出现于背侧；NO：PF软骨和角质鳍条（actinotrichia）；肠道；耳囊分2腔；早期颌软骨；循环于5-6大动脉弓；口仍小，开于腹侧眼中线突口72EL=3.5mm；HTA=25；宽口突出于眼前方；虹膜色素细胞出现于卵黄带；虹膜色素细胞覆盖眼部一半；背部黄色与头部色调同；NO：腮裂和腮丝芽基；腮弓1-5软骨；鳃盖覆住1-2腮弓；匙骨（cleithrum）a EL：胚体长度；PF：胸鳍；HB：Hisaoka 和 Battle (1958)斑马鱼分期大致序列（一直到HB分期20大致准确）；HD：背侧观头部直径；NO：Nomarski optics；H/W：高/宽；YB：卵黄
14、球；YE：卵黄延伸部；YSL：卵黄合胞体层；HTA：头-肢角；OVL：耳囊长度为从更广的视角观察发育过程，我们将数个分期归为一组，形成更长的时间段称为时期（表1），并在文中总结了发生在这些时期内的主要事件。术语表中定义了一些特定的术语，文中黑体字强调的术语在分期中是重要的。表2对各个分期作了简要的描述，而图1则展示了相应的草图。我们可以利用这些资料大致定位我们所感兴趣的一个分期，然后尽可能在文中和其他图中找到更多细节。步 骤分期我们可以通过使用立体显微镜观察活体胚胎来大致确定发育分期，通常用透射光（而非反射或入射光）以及高放大倍数（约50）。在体节期尾部伸长，如果胚胎仍处于绒膜（chorion
15、）内，尾部最终将环绕驱干和头部，以致不易观察。此时，我们必须将胚胎移出绒膜，可以使用5号镊子（forceps）手工移去，也可用蛋白溶解酶（proteolytic enzyme）处理。咽囊晚期，一旦受到触碰，胚胎（如已去除绒膜）会反射性游走，这种情况下，可用0.003%三卡因（tricaine）以麻醉之。反复麻醉和冲洗会严重阻滞随后的发育，虽然看起来似乎轻微。Nomarski光学系统装有Nomarski微分干涉相差光学系统和倍率15至40的物镜的组合显微镜能揭示活体标本更多的细节，利于精确分期。例如，Nomarski光学系统可在囊胚期和体节期实现最精确的细胞和体节计数。此外，“原基”期（”pri
16、m” stages）指后侧线原基（primordium of the posterior lateral line）这一结构的位置，我们必须利用Nomarski光学系统以准确确定大部分咽囊期的一些分期。将胚胎麻醉、去除绒膜，并置于桥接盖玻片之间以利于观察和随后的恢复。 图 1. 斑马鱼胚胎发育各分期显微扫描图。早期动物极位于顶端，后来前缘成为顶端，例外的是原肠胚的胚环和胚盾期在其侧面观的图片下显示了相应的动物极（AP）观图片。卵裂期和囊胚期图片为正面观。胚盾期后为胚胎左侧观，但在胚盾出现前并不能确切地分辨哪一面是左侧。 这里忽略色素沉着。 箭头指示了以下分期判定的一些关键特征：1k-细胞期：Y
17、SL细胞核；穹顶期：隆起的卵黄合胞体；胚环期：胚环；胚盾期：胚盾； 75%外包期：Brachet裂缝；90%外包期：胚层外围包裹卵黄；尾芽期：小膨出；3-：第3体节；6-：眼原基（上方箭头）、Kuperffer囊（下方箭头）；10-：耳基板；21-：晶状体原基；原基-6期：后侧线原基（背侧观）、孵化腺（卵黄球上）；原基-16期：心脏；高胸鳍期：胸鳍芽。比例尺=250m 对活体胚胎进行分期总是比将其致死和固定后再分期要好。例如在伸直和孵化期间的分期需要对头部大小和卵黄质量进行对比，而固定期间会造成不同程度的收缩而破坏了正常的关系。然而，如果保存良好，我们可以利用其他标准相对可靠地对固定或完全包埋
18、的胚胎进行分期，但切割后则不易分期。成像所附图片均为活体胚胎，后期为麻醉处理。原始图片被制作为彩色幻灯片（柯达 Ektachrome 160T DX），而黑白插图由中间底片复制而成。彩色幻灯片可付费向作者索取。显示整个胚胎的低倍图像由Zeiss STEMI立体显微镜获得：将胚胎置于凹槽载片的标准介质中，而不需要盖玻片，介质中含有1.5-3%甲基纤维素（methyl cellulose）以利于预期定位。显示部分胚胎的高倍图像由Nomarski光学系统（通常配合Zeiss 40浸水物镜）摄得，使用Zeiss UEM组合显微镜。将胚胎包埋于盖玻片之间，有时加1%琼脂以固定。 温度与标准发育时间我们将
19、分期信息转换为“标准发育时间”，用字母h表示，定义为在28.5这一适宜温度孵育下受精后的小时数。孵育在其它温度下会改变发育速度，而这在特定研究中可能会有用。例如，使两个胚胎在某一时间达到不同的分期以作异时移植。对孵育于不同温度下的胚胎进行对比须谨慎进行，因为不能保证当温度变化时胚胎所有特性均随发育速度作同步变化。然而，若是将胚胎保存在25-33范围内，其发育似乎正常，超出这一范围温度作长时间孵育将出现异常。图2显示了在极值点的发育速率，图右侧的说明提供了一个简单的公式可用以估算出这一范围内的任一温度下胚胎发育所能达到的某一分期。图 2 . 孵育于25和33的胚胎孵育速度。A：尾芽期，B：突口期
20、。纵轴为28.5标准温度下孵育的分期。可以想象，28.5下的发育曲线为通过原点的直线，斜率1.0。注意到25和33下的发育曲线均为直线，且斜率在两图中几乎相同。因此发育速度随孵育温度而变化，可用以下公式估算任一温度下达到某分期所需发育时间：HT =h/(0.055T-0.57). HT为T温度下的发育时间，h是在28.5下达到某分期所需时间（见表1）。分期缩写：c: cell, d: dome, s: shield, b: bud; s: somite, p: prim, hp: high-pec, lp: long-pec, pf: pec-fin, pm: protruding-mouth
21、. 方法：对自然产卵形成的胚胎进行观察，分3组，每组20-30个胚胎，孵育于150ml大烧杯。用多项指标确定分期，并确保取出观察的胚胎与保留在烧瓶中的无发育差异。因为吹打、去绒膜、麻醉等处理会显著阻滞发育，如此处理的胚胎比长胸鳍期的对照组晚2-6小时。合子期（0-0.75h）新受精的卵子直至其第一次卵裂发生，称合子期（图3），约受精后40分钟。受精时形成的合子直径约0.7mm。合子期只含有一个分期，但其间也发生很多变化，可以很容易划分这一时期（见Hisaoka and Battle,1958）。合子期的分期1-细胞期（0 h）.绒膜膨胀并脱离新受精的卵子（图3A）。受精同时也活化胞质运动，约1
22、0分钟内很容易看到。非卵黄胞质开始向动物极流动，促使胚盘和卵黄颗粒丰富的植物极胞质分离（图3B）。这一分离在卵裂早期仍在继续。 图 3 . 合子期。A：受精后数分钟，绒膜膨胀。B：受精后约10分钟，动物极朝上的去绒膜合子。非卵黄胞质开始分离进入动物极。比例尺=250m卵裂期（0.75-2.25h）首次卵裂形成的两个细胞，或称卵裂球在间隔15分钟后分开（图4，5）。胞质分裂为部分分裂，只是在胚盘底部不完全切开，卵裂球仍通过胞质桥结构相连。这一时期的6次卵裂通常按规则的方向方向发生，因而我们可以通过卵裂球的排列知道其数目，而不必一一计数。这一时期和下一时期的早期都可用Nomarski光镜划分每细胞
23、周期以实现精确分期。胚盘中所有细胞都同时或近似同时地完成细胞周期。约在细胞周期的前半部分，即细胞间期，细胞核存在且可见，核形态也发生系统性变化（见下，图10）。每个早间期细胞核都是球形的，晚间期为类球体，其后随细胞进入有丝分裂，核逐渐变为椭球体，直至有丝分裂前期消失。椭球体的长轴指示了随后卵裂的取向。有丝分裂期的染色体很难看到。近有丝分裂晚期，在胞质分裂之前，卵裂球形状变得更圆。卵裂期的分期2-细胞期（3/4 h）.结束第一个合子细胞周期的首次卵裂形成的卵裂沟是垂直的，一直到32-细胞期都是如此。卵裂沟在近动物极形成，迅速向植物极伸长，只经过胚盘区域而不经过卵黄区域（图4A）。在近于胚盘底部，
24、卵裂沟变为水平方向，以Wilson（1889）最早描述的黑鲈（sea bass）那种方式切割胚盘，但仍只是部分与底下的卵黄区域分开。形成的两个卵裂球体积相同，似乎不易相互区分。随后的几次分裂严格按第一次分裂的方向进行，然而最终的身体对称轴（即背腹轴和前后轴）似乎并不能完全由卵裂方向决定（Kimmel and Warga, 1987; Abdelilah等, 1994; Helde 等, 1994），而有些报道则认为可以（Strehlow and Gilbert, 1993; Strehlow等, 1994）。4-细胞期（1 h）.两个卵裂球不完全裂开（图4B），裂平面以合适角度穿过动物极和第一
25、次卵裂面。因而第三细胞周期开始于22排列的4个卵裂球。从动物极看（见图6）胚盘呈椭球体，而第二次卵裂面是沿长轴方向的。图 4 . 卵裂期胚胎。除B外均为正面观，B显示的是胚胎在动-植物极的扭曲，约偏离正面45。 A :2-细胞期（0.75 h）；B：4-细胞期（1 h）；C：8-细胞期（1.25 h）；D：16-细胞期(1.5 h)；E：32-细胞期（1.75 h）；F：64-细胞期（2 h）。比例尺=250m图 6. 动物极观，前5次卵裂平面示意图。外圈为卵黄，A内部椭圆为未分裂的胚盘。B-F为连续的卵裂，奇数次卵裂沿短轴切割胚盘，偶数次卵裂沿长轴切割胚盘。引自Kimmel 等 (1991)
26、，经Wiley & Sons子公司Wiley-Liss John Inc惠允。图 5 . 受精后（在28.5），卵裂球数目随时间变化的理想曲线，此段时间卵裂发生较为同步，在第10细胞周期的囊胚中期转变之前。8-细胞期（1.25 h）.卵裂发生于第3细胞周期结束，仍为不完全卵裂。两个独立的卵裂面与第1次卵裂面平行，将胚盘切割为24排列的卵裂球。由于去绒膜胚胎通常侧躺于培养皿，其4-细胞面（而非2-细胞面）正对观察者。此“正面”观（Kimmel and Law, 1985a）沿奇数卵裂面（卵裂沟1和3可见，图7）。一直到囊胚晚期去绒膜胚胎总倾向于以此方向平展开，图1第一部分（到高囊胚期）、图4（4
27、B除外）和图7均为此“正面”观所得。16-细胞期（1.5 h）.第4组卵裂同样沿两个面进行，均与第2次卵裂面平行，产生44排列的细胞，须小心与8-细胞期鉴别，因为其正面观很相似（图4C,D）。第一次出现部分细胞完全与其他细胞分离，这些细胞是位于最中心处的4个卵裂球。此四分体在图6E中完全被其他细胞包绕。全分裂发生于近16-细胞期末，因为此次卵裂沟先从胚盘中心底部切开，再向外围延伸。实际上，作底部切开的卵裂沟并未到达外围，包围此四细胞的12个细胞（称外围卵裂球）仍与卵黄细胞通过胞质桥相连（Kimmel and Law, 1985a）。此分期之后直到囊胚中期，每次卵裂均能完全或大部分分离非外围卵裂
28、细胞，仍不能完全分离外围卵裂细胞。图 7. 卵裂期正面观显微扫描示意图，显示从4-细胞期一直到64-细胞期卵裂球的世系关系。各卵裂球根据期世系标号，同时也指出其位置。每一标号代表胚胎中的两个细胞，其中一个在图中可见，而另一个须将胚胎沿动-植物极轴旋转180才可看到（比如，此处在4-细胞期只显示2个细胞）。在4-细胞期，细胞L处于第1次卵裂面左侧，细胞R处于右侧（因此，这里的标号L和R并非指未来胚体的左右侧；见正文）。细胞L分裂产生L1（更靠近动物极）和L2。L1分裂产生L11（更靠近动物极）和L12，如此等等。对于64-细胞期，深层细胞没有绘出。引自Kimmel and Law (1985a)
29、，经由Academic Press惠允。32-细胞期（1.75 h）.第5细胞周期结束时的卵裂通常发生于四个平行面，而不是位于第1和3卵裂面之间两个平面。然而此时，斜向卵裂沟很明显。通常32细胞呈48排列，但除规则排列之外，不规则排列也很常见。侧面观，在外围和动物极之间常可见双层细胞。这是因为胚盘平面弯曲，外围细胞更近于植物极，其中的部分细胞排到了靠近动物极的非外围细胞之前。64-细胞期（2 h）.第6次细胞周期结束时的卵裂是水平的，所以从动物极看细胞排列和32-细胞期很相似，只是正进入第7次细胞周期的卵裂球体积较小。侧面观，细胞堆叠明显变高（图1，4F，7）。第一次出现部分细胞完全覆盖其他细
30、胞。被覆盖的细胞（或称深层细胞）都是由32-细胞期的4个中心细胞中每个分裂产生的两个子细胞中的一个构成；而另一个则仍处于表面，形成胚盘的最上层此时称包被层（the enveloping layer , EVL）。与此同时，每个外围细胞的水平卵裂也产生两个EVL细胞，所以64-细胞期正面观似有三层EVL细胞（图7）。囊胚期（2.25-5.25h）囊胚期指从128-细胞期或第8次合子细胞分裂开始形成球形胚盘直到第14次卵裂开始原肠期为止这一段时期。此期有很多重要事件发生：胚胎进入囊胚中期转变（midblastula transition, MBT）、卵黄合胞体层（the yolk syncytial layer, YSL）形成、外包（epiboly）开始。外包将一直持续到原肠期。此期用“实囊胚”（ “stereoblastula”）称之可能更准确，因为这一术语意味着胚胎还没有形成囊胚腔（blastocoele），而事实正是如此（图8），仅在胚盘深层细胞之间存在不规则的间隙。卵裂取向不确定，比卵裂期亦更不规则。此后卵裂产生的子细胞从
