1、Westernblot操作步骤Western-blot-操作步骤Western blot 操作步骤实验原理：Western blot，也称Western blotting、蛋白印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放
2、射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。内参:WB过程监测以及目的蛋白定量的标准；最重要和最不可或缺的对照就是内参照。1.内参可检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，如果一个实验连内参照都出不了阳性结果的话（在内参抗体有效的情况下），那么这个体系就是存在问题的；2、起半定量的标准的作用，内参一般选择管家基因编码表达的蛋白，在很多组织和细胞中都是稳定表达的，因此可以作为检测靶蛋白表达量的标准；内参名称分子量大小适用范围beta-actin43kDa胞浆和全细胞注：离心机提前预冷至4。二、蛋白含量的测定第一步：在96孔板第一列1-8分别为浓度为
3、0，1，2，4，6，8，9，10倍的蛋白标准液+水=10或20ml，再加上5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。第二步：在96孔板后面几列依次加入稀释的蛋白样品或原液10-20ml以及5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。注：原液浓度太高时进行稀释，用裂解液稀释。三、电泳 第一步：清洗玻璃板 将玻璃板在蒸馏水下冲洗干净，去除杂质，再用去离子水清洗一遍，自然晾干。 第二步：配胶（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。（2）配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。待胶面升到玻璃板3/4位置时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝固更快。注：加水液封时须缓慢，否则胶会被冲变形。（3
4、）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。注：插梳子时要使梳子保持水平，两边对齐垂直插入。（4）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）第三步：上样（1）测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋白加入4：1 5Loading Buffer于离心管，100水中煮5min使蛋白变性。放置冰上3min，离心
5、15min，13000rpm，4。（2）加足够的1电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要没过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。）第四步：电泳浓缩胶80V电压跑20分钟，至蛋白marker分离即可加压，也可多跑几分钟；分离胶120V电压跑至底端。第五步：停止电泳纯水冲洗玻璃板，取胶，清洗切去浓缩胶，在Marker下方切角做标记，将胶泡在清水中。四、转膜（跑胶时准备转膜用品，最主要赶气泡）第一步：剪PVDF膜，并提前切角标记方向，甲醇中泡1-3min。第二步：将膜、海绵
6、、滤纸一起泡入1转膜液中，放4保存。第三步：将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。)在垫子上垫2层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。将胶盖于滤纸上，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜用镊子盖于胶上完全对齐，并除气泡。在膜上盖2层滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，合起夹子。整个操作在4的1转膜液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。第四步：将夹子放入转膜槽中，黑对黑，白对红。电转移时会产热，过热有可能造成蛋白质的降解，同时大量产热，会使凝胶膨胀，有可能在胶和膜之间产生空隙，
7、引起转膜不均匀，所以在转膜槽中放入冰盒，在冰水混合物中进行转膜。注：转膜条件是电流300mA或电压70V，2h；另一个约束条件就是电压必须控制在60-70V，调节电流。第五步：转完后将膜放入装水的小盒中冲洗，倒水后，加5%的封闭液，摇床封闭1h。五抗体孵育，免疫反应 第一步：回收封闭液，加入一抗，摇床30min-1h，4过夜，再孵育30min-1h。第二步：一抗回收，用PBST洗，洗5次，每次5min。第三步：加二抗，孵育2h。第四步：二抗回收，用PBST洗，洗5次，每次5min。第五步：纯水冲洗5-7次，倒掉纯水，加化学发光，膜在化学发光中浸泡2-3min，成像。实验药品试剂1.裂解液：母液
8、（动物组织蛋白提取Buffer）：蛋白酶抑制剂：Pmsf（配）=100:1:1母液常温放置；蛋白酶抑制剂和Pmsf需-20保存；裂解液需-4保存。2.考马斯亮蓝染液，使用前用无菌水稀释。3.转膜液的配制（1）1L试剂剂量Tris3.028gGlaline（甘氨酸）14.4gSDS1g先定容800ml，调制PH=8.3，然后+200ml甲醇，混匀。4.蛋白电泳Buffer（5）1L试剂剂量Tris15gGlaline（甘氨酸）72gSDS5g直接定容至1L，无需灭菌和调pH；使用前稀释至1。5.磷酸盐缓冲液（PBS，10）500ml试剂剂量NaCl40gKCl1gNa2HPO42H2O7.2gK
9、H2PO41.2g调制pH=7.4-7.56.PBST配制1L的PBS+5ml20%Tween207.封闭液（5%）脱脂奶粉5g，溶于PBST，定容至1L。8.一抗溶于封闭液；二抗溶于PBST。9.按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶、上层胶)成分配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积（mL）5%胶2346810蒸馏水1.42.12.74.15.56.830%Acr-Bis(29:1)0.330.50.671.01.31.71M Tris，pH8.80.250.380.50.751.01.2510%SDS0.020.030.040.060.080.110%过
10、硫酸铵0.020.030.040.060.080.1TEMED0.0020.0030.0040.0060.0080.0110.根据目的蛋白的分子量大小选择合适的分离胶（下层胶）浓度SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围6%胶50-150kD8%胶30-90kD10%胶20-80kD12%胶12-60kD15%胶10-40kD成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）6%分离胶51015203050蒸馏水2.04.06.08.012.020.030%Acr-Bis(29:1)1.02.03.04.06.010.01M Tris，pH8.81.93.85.77.611.419.
11、010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.0240.04成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）8%分离胶51015203050蒸馏水1.73.35.06.710.016.730%Acr-Bis(29:1)1.32.74.05.38.013.31M Tris，pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0030.0060.0090
12、.0120.0180.03成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）10%分离胶51015203050蒸馏水1.32.74.05.38.013.330%Acr-Bis(29:1)1.73.35.06.710.016.71M Tris，pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）12%分离胶51015203050蒸馏水1.02.03.04
13、.06.010.030%Acr-Bis(29:1)2.04.06.08.012.020.01M Tris，pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）15%分离胶51015203050蒸馏水0.51.01.52.03.05.030%Acr-Bis(29:1)2.55.07.510.015.025.01M Tris，pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02
