1、微波核磁共振法 水分固形物脂肪 快速测定仪 AOAC标准操作规程范文水分和脂肪测定的标准方法：PVM1：2004（乳品）微波、核磁共振技术快速水分/固形物、脂肪测定仪分析法PVM 1:2004论证人：GARY CARTWRIGHT美国北卡罗来纳州立大学，食品科学学院，地址：7624/4，1 Schaub Hall, Ra leigh, NC 27695-7624联系电话：919-513-2488研究人员：BOBBIE H. MCMANUS，1 TIMOTHY P. LEFFLER，andCINDY R. MOSER1专利所属单位：CEM 公司地址：3100 Smith Farm Rd, Mat
2、thews, NC 28105,联系电话: 704-821-7015研发实验室：CEM Corp., 3100 Smith Farm Rd, Matthews, NC 28112论证实验室：North Carolina State Uni versity, De partment of Food Science, Raleigh, NC 27695方法摘要：本方法利用微波干燥法和核磁共振分析法（NMR）检测乳制品水分/固形物与脂肪含量。方法利用微波干燥法测定乳制品水分/固形物含量，干燥后样品用于核磁共振法检测脂肪含量。研发和论证实验室同时利用CEM SMART水分测定系统和SMART Trac
3、脂肪测定系统分析乳制品水分，脂肪含量。样品包含牛奶，奶油，冰淇淋，酸奶油，酸奶，软奶酪，马苏里拉奶酪，瑞士奶酪，格瓦拉奶酪。以上都是食谱中常见奶制品类食材。方法检测结果与AOAC中已经存在的水分固形物，脂肪含量测定方法的结果做对比。1结果汇总：1.1 论证范围 本说明针对乳制品牛奶，奶油，冰淇淋，酸奶，奶酪的水分/固形物、脂肪含量进行检测。1.2 数据来源 乳制品质量控制协会（DQCI服务中心）用AOAC Method 990.20中牛奶和奶油固形物分析法测试结果 DQCI服务公司提供乳制品粗脂肪分析数据,根据AOAC Method 989.05中关于牛奶奶油的方法测定。 CEM公司用AOAC
4、 Method 905.02方法测定酸奶、酸奶油样本,每个样本重复5次。用AOAC Method933.05方法测定奶酪样本。用AOAC Method952.06方法测定冰淇淋样本每个样本5次。CEM用AOAC Method 926.08细则中AOAC Method 990.20条款中奶酪样本水分含量分析法检测酸奶样本固形物所得数据。此外，用AOAC Method 941.08规定来检测冰淇淋固形物。标准方法每个酸奶，奶酪，冰淇淋样本重复测定5次。 研发实验室和论证实验室分别测试11种产品，每个样本都要用SMART （CEM生产的微波干燥系统）和SMART Trac（CEM生产的NMR系统）重
5、复测定水分/固形物和脂肪含量各10次。2 安全提示 提示安装心脏起搏器或其他磁干扰仪器的人员与SMART Trac仪器磁元件保持至少11英寸（0.3米）的距离。2 本方法利用微波干燥法和快速NMR测定法来测定水分/固形物和脂肪含量，特别是乳制品。本方法适用于大部分乳制品，测定范围宽泛。样本类型 样本量（g）样本涂布方法奶酪2.0-2.5呈圆形涂布于样品纸的中心奶油2.0-2.5涂布于样品纸中间呈狭长状，然后用棒呈之字形划线涂布软奶酪1.5-2.0通过推片涂布法将样品从样品纸一端均匀推至另一端冰淇淋1.5-2.0涂布于衬垫中间呈狭长状牛奶3.0-4.0涂布于衬垫中间呈狭长状酸奶1.5-2.0通过
6、推片涂布法将样品从衬垫一端均匀推至另一端酸奶油2.0-2.5通过推片涂布法将样品从衬垫一端均匀推至另一端图一 不同类型样品的涂样方法 4参考文献1）Official Methods of Analysis (2000) 17th Ed., AOAC INTERNA TIONAL, Gaithersburg, MD2）Youden, W.J., & Steiner, E.H. (1975) Statistical Manual of the AOAC, AOAC, Arlington, VA5.缩写与专业术语5.1 NMR核磁共振5.2 RF随机频率5.3 NCSU北卡罗来州立大学5.4 NIR
7、近红外5.5 LR-NMR低场核磁共振检测5.6 DQCI奶制品质量控制协会6 方法原理在上世纪中叶，人们开始探索NMR技术。通过观察静态磁场下，脉冲频率使原子核吸收和释放随机频率能量的现象。核同位素发生NMR效应的频率依赖于磁场的强度。而这一现象是由原子核偶极磁矩和外加磁场共同影响的（这就是核磁共振名字的由来，NMR并不涉及电离辐射过程）。虽然许多元素的原子核都可以发生核磁共振信号，但是人们广泛应用核进行NMR实验，我们通常称之为“质磁共振”。核磁共振技术用于成像分析已经有几十年的历史了，衍生出MRI核磁造影技术，MRI用于临床诊断已经超过20年了。SMART Trac系统利用NMR技术，L
8、R-NMR测定方法用于工业质量控制也有超过20年的历史了。大部分的LR-NMR测定法都是用的质磁共振。质磁共振技术的主要区别于核磁共振的地方在于，它是通过区别不同状态的氢核的含量来检测样品成分的。在核磁共振谱中，我们通过不同分子或相同分子不同部位的核在磁场作用下发生能量变化时微小的信号差异来区别不同的物质，这是由于分子中电子分布不一样的结构特点决定的，这导致了不同成分各自分子核NMR频率微小的不同（T2弛豫时间，也就是横向弛豫时间），这一现象导致样品中不同成分NMR信号不同。这种现象被称之为化学位移效应。由于LR-NMR磁场的低场强的特点，我们不能检测出含有核的样品的化学位移。我们用不同成分的
9、信号衰减率代替化学位移检测NMR信号。横向弛豫值指数衰减程度可以约等于参数T2。微波干燥过的食物，可被检测的主要成分包括脂肪，蛋白，碳水化合物。不同成分的质子横向弛豫时间T2是有显著差异的。例如，食物中的蛋白和碳水化合物在干燥食物中都是固体样成分，T2都很短（差异大多在10 s），两种成分的信号衰减都比较迅速。脂肪的T2值比较长（差异大多在10 ms），信号衰减比较慢。此外，样品微波干燥后仍然有微量的水分残余也被算在非脂肪的固形物含量中（蛋白和碳水化合物），虽然干燥食物中的脂肪能与其他成分区分开。等待固形物信号的持续衰变，除了水外，主要就是样品中的脂肪了。 用上述方法检测干燥样品NMR信号的强
10、度与脂肪中质子的数量成正比，直接与样品中脂肪含量成正比。 基于以上方法原理催生的低场NMR技术被广泛应用于各种生产行业的质控，某些方法已经被国际标准组织论证。例如，美国标准物质方法协会（ASTM）的D3701和D4808关于石油产品中水分含量的检验标准，还有，国际标准化组织（ISO）10565中关于种子油分和水分含量测定标准。7 标准依据无适用标准8 实验材料8.1 石英纤维衬垫8.2 Trac膜9 仪器设备9.1微波水分/固形物分析仪灵敏度可测得0.2mg的水分；水分含量范围在0.01%-99.99%；可测液体，固体，半固体；分辨率在0.01%包括 自动电子天平 （可读数到0.1mg）；温度
11、反馈微波干燥系统；电脑控制微处理器（CEM）等等。9.2NMR-RF脉冲发生器标示脉冲功率 250W; 脉冲间隔 100ns增量变化；转向角度可选 0, 90, 180, 270标示90脉冲时间，4 ms (18 mm 探头)。永磁磁铁，磁场强度为0.47T（20MHz）同位素浓度10ppm。信号检测：双通道正交法检测 可编程低通量滤波器 ，每对可输出4MHz。（CEM）等等。10 样品制备10.1 乳制品/牛奶AOAC 标准方法 925.2110.2 乳制品/奶酪AOAC 标准方法 955.3011 实验步骤11.1 AOAC 水分/固形物含量测定 乳制品样品水分/固形物含量测定依据AOAC
12、标准方法990.20牛奶，奶油，酸奶油，酸奶制备法。奶酪样品测定依据AOAC标准方法926.08 水分含量分析法。奶油样品固形物测定依据AOAC标准方法941.08。11.2 AOAC 粗脂肪测定法乳制品样品粗脂肪分析根据AOAC标准方法 989.05 方法关于牛奶和奶油的测定方法。酸奶油和酸奶样品的测定则根据AOAC标准方法 905.02 方法。奶酪样品用AOAC标准方法933.05，冰淇淋分析法用AOAC 952.06方法。11.3 CEM SMART System （水分/固形物）/SMART Trac（Fat） 注意事项：参考标准操作规程，按标准测试系统性能。每天使用前都应该进行校准系
13、统，确保SMART Trac检测结果的漂移。11.3.1校准方法打开 SMART 系统 ，“CEM 主菜单项”中，选择“Load Method”；然后选择适当的程序完成检测，例如，“Milk”。 注意事项：不同类型的样品混合物和脂肪会在NMR系统中呈现不同的结果。为了得到准确的脂肪测定结果，须测定两个以上样品作为参考。应根据AOAC标准方法在检测范围内，选择分布于检测范围较低脂肪含量的一个样品 ，较高脂肪含量内的一个样品 。参考值将被输入SMART Trac系统，之后每测定一个样品，都将在校准基础上测定得出此类样品校准后的NMR信号值。参考数据测试完成后，SMART Trac系统将建立一个同类
14、样品脂肪检测的线性图。11.3.2选择 “Ready”键开始检测。在SMART水分/固形物分析系统微波室内的天平上放置两张石英纤维样品衬垫，之后在选择菜单上选择“Tare”键。仪器自动调零。11.3.3 将干燥后的所有样品转移在经调零的两衬垫中的一个衬垫中央。（如图一所示涂布样品）。11.3.4 将经过调零的另一张衬垫覆盖在样品上，呈“三明治”状。之后将处理好的样品和两张衬垫，再次放回到天平上。11.3.5 选择“Start”键开始干燥样品。此时，温度反馈系统将快速测定样品温度，从而控制仪器在干燥过程中调整微波输出功率。当样品称至恒重时，屏幕上将会显示水分/固形物含量的百分率含量（0.01%）
15、。注意事项：样品测定完成后会发出五声短促的提示音。11.3.6 转移样品衬垫并按照图二、图三所示，卷袱衬垫，放置到“Trac film”样品池内。11.3.7 将样品卷好，用装填工具装填在塑料样品管内，装好后置入NMR样品池内开始测试。（样品池处于一个由重约89kg的脉冲线圈产生的稳定磁场内。测试信号代表样品内脂肪中活泼质子的能量。水分和脂肪含量都是经过计算得出的）。11.3.8 选择“Ready”继续脂肪的分析，之后，选择“Start”开始分析脂肪含量。结果显示的是脂肪百分含量（0.01%）。12 测试结果测试结果如数据表Table 1到11所示。CEM 和 DQCI用AOAC水分/固形物和
16、脂肪含量测定标准方法分析了11种产品。NCSU和CEM，参与本次实验，用的是SMART系统和SMART Trac系统测定11种产品的水分/固形物和脂肪含量。数据经过分析，统计结果如数据表Table12至19显示。每种产品统计数据包括：平均值、标准偏差和变异系数，主要为了分析实验室内重复性，实验室间重现性。数据总结了SMART系统和SMART Trac系统检测结果与AOAC方法测定水分/固形物和脂肪含量相关性良好。特别是关于牛奶和奶油的统计数据，这类产品属于乳制品原料。如此一来，加工产品和发酵产品测试结果便会有个良好的预期情况了。13 测试结果重现性如果样本初始称重不准，对水分/固形物和脂肪测定
17、有较明显的影响。所以，不同样品称重时，要放在如图一所示的位置上。样品干燥温度对水分/固形物和脂肪测定有较明显的影响对脂肪含量测定影响较小。如果干燥温度不合适，样本干燥程度不够彻底。样本表面温度对脂肪测定有一定影响。在开始NMR测试前需要将样品冷却至40摄氏度。14 过程控制确保处理后样品在与外部空气和水分隔绝的环境中。样品应在一定重量和温度范围内，在NMR分析前需冷却至40摄氏度。15 总结综上所述，两个参照标准方法测试的实验室所用的水分/固形物和脂肪测定方法与AOAC方法比较，快速安全性良好。15.1研发目的CEM SMART Trac系统为人们提供了一种经过改进后测定过程更迅速,准确度、可
18、靠性更高的乳制品固形物和脂肪测定方法。NCSU根据巴氏乳脂含量测定法（AOAC 标准方法989.04）检测原料牛奶和炼乳的乳脂肪含量，这种方法通过滴定法来计算乳脂肪含量。冰淇淋和奶布丁也通过巴氏法测定。CEM SMART Trac系统与巴氏法对比，提升生产实验室分析效率，将处理脂肪的时间从25min大大缩短至4min。巴氏法需要在滴定过程中通过视觉判断反应进程，所以会有较大的人员间操作误差，但SMART Trac系统却尽量避免了以上误差。 避免巴氏乳脂测定法中的试剂消耗能够大量减少有害废液处理带来的不便，诸如，有害化学物质，污染器皿，和离心过程中存在的安全问题。对于一个学术研究综合实验室 ，S
19、MART Trac系统能准确测定多种分析指标，包括，牛奶、混合物、奶酪、奶油，甚至是肉类等相关产品的测定工作，同时它也能满足不同客户需求，减少因样品变化带来的问题。附件 A：重复性实验 实验1：样品重量对微波干燥法测定固形物和NMR脂肪测定的影响。 牛奶样品实例1（如Table A.1.），样品重量在小于推荐上样量3-4g范围。结果显示，样品涂布面积对固形物和脂肪含量测定产生一定影响。两相同重量样品由于涂布面积的变化，在干燥过程中，仍然维持干燥温度105摄氏度并不适合。如此一来，固形物含量的测定结果比AOAC的平均含量11.79%低了0.09%到0.14%。这说明，干燥过程中，水分并没有被充分
20、去除，所以，多余的氢质子存留在样品中，这导致脂肪含量测定值假性升高。NMR测定脂肪含量时，当样品被放到磁场前，其中所有水分必须被清除干净。如果水分中的氢质子，没有彻底清除，这些质子就会被当作脂肪成分被计算在内。与AOAC标准方法测定脂肪含量平均为3.02%比较,结果升高了0.1%-0.14%.实验2:微波法干燥和NMR法干燥温度对固形物/脂肪测定的影响。 牛奶样品实例2（如Table A.2.），干燥温度从105摄氏度降低到80摄氏度。结果显示，两样品比较，干燥温度对固形物测定有明显影响（升高0.09%），而对脂肪含量测定有微小的影响。实验3：干燥温度对微波干燥法和NMR方法测定水分含量和脂肪
21、含量时的影响。牛奶样品实例3（如Table A.3.），两样品比较，干燥温度由105摄氏度升高到120摄氏度。结果显示升高干燥温度在固形物和脂肪含量测定中影响甚微。但是，脂肪含量较高的样品容易发生褐变甚至是燃烧。实验4：样品重量对微波干燥、NMR法测定固形物和脂肪含量的影响。 在样品实例4 测定炼乳（Table A.4.），样品重量被降低到低于参考值2-2.5g。结果显示，样品涂布面积可以影响固形物和脂肪含量测定。由于样品涂布面积，干燥温度在干燥过程中维持100摄氏度是不恰当的。如此一来，固形物测定结果比AOAC标准方法测定结果平均值45.57%升高0.08%。所有水分并没有在干燥过程中被彻底
22、除去，随之，残余水分的氢质子在结果中显示出来，两结果比较，脂肪测定结果升高了。NMR技术被用于脂肪测定时，在样品被置入磁场之前，所有水分必须被彻底的清除出样品。如果水中质子清除不彻底，这些质子将被作为脂肪计算在内。本次脂肪测定结果，比AOAC标准测定法结果平均值39.93%上升了0.29%。 实验5：样品重量对微波干燥法、NMR法测定固形物脂肪含量的影响。样品实例5 测定炼乳（Table A.5.），样品重量被增加到多于参考值2-2.5g。结果显示样品涂布面积影响固形物和脂肪含量。因为样本会有些褐变，褐变效应引起检测检测结果普遍改变，脂肪含量在样品2，3中略微降低了。实验6：样品温度对NMR法测定脂肪含量的影响样品实例6 测定炼乳（Table A.6.），所有测定脂肪含量的样品都已测定重量，磁铁是40摄氏度恒温的。样品从微波干燥腔内取出，100摄氏度，未经冷却，直接放入NMR测定仪。结果显示，样品温度对脂肪含量测定有负面影响，本次脂肪测定结果，比AOAC标准测定法结果平均值39.93%普遍降低了。
