1、HE染色与免疫组织化学染色实验报告HE染色与免疫组织化学染色实验报告1实验目的及意义1.1了解石蜡切片的制作过程1.2 掌握HE染色与免疫组织化学染色的基本原理以及染色方法1.3 熟悉HE染色与免疫组织化学染色后的读片知识2 实验方法及步骤2.1 石蜡切片制作及HE染色步骤2.1.1取材与固定：从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过05厘米)投入预先配好的固定液中(10福尔马林)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。2.1.2脱水透明： 一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡
2、的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。2.1.3浸蜡包埋： 将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。 2.1.4切片前的准备工作：先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，四周留约2mm的石蜡块，块两边必须切成平行的直线。将玻片擦洗干净后均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油，放置冰箱备用。2.1.5切片与贴片： 将预冷的蜡块固定于切片机上，调节切片厚度为6微米，切成薄片。切下的薄片往往
3、皱折，放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45恒温箱中烘干。2.1.6 脱蜡至水二甲苯20分钟，二甲苯20分钟，无水乙醇3分钟，95酒精3分钟，80酒精3分钟，70酒精3分钟，自来水洗5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。2.1.7染色： 苏木素液7分钟，自来水洗5分钟，1盐酸溶液分化30秒，自来水洗5分钟，1氨水返蓝10秒，自来水洗20分钟，95酒精3分钟，1伊红酒精溶液2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。2.1.8脱水和透明：95酒精2分钟，无水酒精2分钟，无水酒精2分钟，二甲苯5分钟，二甲苯5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。2.1.9封固：将已
4、透明的切片滴上中性树胶，盖上盖玻片封固，放入37烘箱。2.2 SABC 染色步骤2.2.1脱蜡至水：二甲苯20分钟，二甲苯15分钟，100酒精2分钟，95酒精2分钟，80酒精2分钟，70酒精2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。2.2.2流水冲洗5分钟（水流要小）2.2.3用蒸馏水配置新鲜的3%双氧水（30%双氧水1：9配制，配100ml），室温封闭15分钟，注意避光。2.2.4蒸馏水洗5分钟，重复2次。2.2.5热抗原修复，将切片浸入0.01M枸盐酸盐缓冲液中，置微波炉内高火5分钟，低火20分钟，完后自然冷却。2.2.6取出切片放入染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。2.2.7取出
5、切片放入湿盒中，滴加5%BSA封闭液（覆盖满组织为宜），室温20分钟。2.2.8甩去多余液体（擦去周围的流痕），滴加一抗（覆盖满组织为宜）注:阴性对照滴加PBS,放入4冰箱过夜。2.2.9放入染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。2.2.10取出放入湿盒中滴加二抗（覆盖满组织为宜），室温30分钟。2.2.11取出置染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。放回湿盒中加SABC（覆盖满组织为宜），室温30分钟。2.2.12取出置染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。2.2.13 DAB显色，取一试管加1ml单蒸水，B、C、A试剂按顺序各一滴加入试管中混匀，滴加于切片上，观察是否终止显色。2.2.14终止显色用单
6、蒸水洗5分钟，重复2次。2.2.15苏木素衬染1分钟，流水冲洗5分钟。 2.2.16脱水透明，70酒精3分钟，80酒精2分钟，90酒精2分钟，95酒精2分钟，95酒精2分钟，100酒精2分钟，100酒精2分钟，100酒精2分钟二甲苯8分钟，二甲苯5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。 2.2.17中性树胶封片，放入37烘箱。3 实验结果3.1 HE 染色结果BAAIB： 狂犬病毒包涵体（内基氏（Negri）小体）图1 狂犬病毒感染后脑组织病变 HE染色 A: 小脑浦肯野细胞内包涵体x400; B: 脑神经元内多处包涵体x400 狂犬病的病理变化在显微镜下主要表现为神经元退变,淋巴细
7、胞和单核细胞浸润，胶质细胞增殖以及特征包涵体形成。狂犬病毒包涵体又称为内基体，直径约310nm，边缘整齐，内有12个状似细胞核的小点,主要出现在大脑海马区及小脑，其他部位也可见，在病变神经元胞浆内成圆形或卵圆形，苏木素一伊红染色脑组织切片中呈嗜酸性反应，病变神经元可含包涵体。大脑海马区神经元和小脑浦肯野细胞胞浆内检出狂犬病病毒包涵体，伴脑组织淤血、水肿。神经元变性 CP： 豆状囊尾蚴虫卵的壳图2 肝脏与肾脏的病变 HE染色 A: 豆状囊尾蚴在肝脏形成包囊x200; B: 脑神经元内多处包涵体x400C：肾小管结构模糊，破坏x200; D: 肾小管上皮从基底膜脱落x400 囊尾蚴感染后肝脏的病理
8、变化可分为一般性变化和特征性变化两种。一般性病理变化主要表现为肝细胞变性与间质性肝炎。颗粒变性：表现为肝细胞肿大，肝细胞中有蛋白性颗粒，肝窦隙变小。水泡变性：肝脏细胞肿大，细胞质有些溶解，较为透亮，但细胞核的位置多无改变，肝窦隙变小。脂肪变性：有程度不等的脂肪滴。脂肪变性和颗粒变性常见于同一肝脏。间质病变：表现为程度不等的间质性肝炎，在汇管区或小叶间有结缔组织增生和灶状淋巴细胞浸润，小叶间静脉扩张。小叶间胆管都有程度不等的增生，其数量增加。胆管上皮增生，单层变成两层甚至复层，胆管黏膜上皮变厚，胆管周围结缔组织明显增生，呈慢性胆管炎与胆管周围炎。特征性病理变化是肝组织形成肉芽肿。可能是幼虫移行对
9、肝细胞造成损伤后在局部发生的慢性炎症反应。幼虫移行造成肝细胞坏死和少量出血，接着局部上皮样细胞增生，其间有异物巨细胞以及多少不等的中性粒细胞浸润。这些中性粒细胞大多在结节外侧分布，在肉芽肿外围是结缔组织构成的包囊，包囊内分布着许多空壳样结构以及均质红染的椭圆形的虫卵。 肾脏的病变主要集中在大量的肾小管上皮从基底膜上脱落，肾小球囊腔变大，肾小球萎缩变小，血管球数目减少，肾小囊囊壁增厚。由于没有见到明显的炎性细胞的浸润，主要变现肾小管的病变，所以推断可能是肾病。而引起的原因也可能是多方面的，如临床的升汞急性中毒便会引起相应的病变。CBA图3 肺脏形成的霉菌结节 HE染色A: 肺泡结构大面积的消失x
10、80; B: 霉菌结节的炎性反应带x200 C：肺脏的霉菌结节x400肺脏的病理变化：肺细支气管及其周围小叶内都可看到很多肉芽肿。肉芽肿的中心含有细胞崩解物一嗜酸性坏死块占据，其周围为淋巴球、组织球等单核细胞。再往外，还可看到多核巨细胞及其上皮细胞。结节则可波及两个或两个以上的肺小叶，使其固有结构完全遭到破坏。较小的结节是由上皮样细胞、巨细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、数量不等的假性嗜伊红细胞和排列疏松的网状结构构成，巨细胞的位置不定，有的在结节中心，有的偏向边沿，数量和核的多少也不等。大的结节内细胞成分与小结节相同，但在排列上有一定的层次性，中心多为干酪样坏死区，外围是核巨细胞构成的细胞带，最外层
11、是淋巴样细胞、成纤维细胞所形成的包膜。同样结节中也有数量不等的假性嗜伊红细胞和不规则排列的纤维素。结界中有时可见不同程度的出血。但没有发现很明显的淡染的菌丝体，可能是由于组织过厚，细胞成分过多，颜色过深，将菌丝体遮盖了，故难于发现。3.2 SABC 染色结果图4 Ki67蛋白在乳腺上皮的表达（SABC染色） A: 乳腺组织Ki67阴性（核内）x400;B: 乳腺组织Ki67阴性（核内）x100 C: 乳腺组织Ki67阳性（核内）x400; D: 乳腺组织Ki67阴性（核内）x200Ki67抗原是1983年由Gerdes等发现在增殖细胞中表达的一种核抗原，也是目前较为肯定的核增殖标志物。Ki67
12、是一个标记细胞增殖状况的常用指标，尤其经常用于反映恶性肿瘤细胞的增殖状况。Ki67在正常乳腺组织有表达，但在从正常乳腺或是纤维腺瘤及增生上皮来的样本显示，ki67表达的水平极低。Ki67高表达与乳腺癌恶性程度成正相关，Ki67在细胞核内的定位形式复杂又有特异性，并随细胞周期改变。Ki67作为一种与细胞周期相关的增殖细胞核蛋白，只与增生细胞核反应，无组织特异性，是一个界定细胞凋亡和增殖的有价值的标记物。Ki67能准确地反映肿瘤细胞的增殖活性，并与多种肿瘤的发展、转移及预后有关，除细胞周期的G0期外，在每个有丝分裂期都可检测到Ki67，尤以M期为最高，可直接、敏感地反映肿瘤细胞的增殖活性，并能较全
13、面地反映增殖细胞的数量。其高阳性表达可反映肿瘤细胞的增殖和侵袭能力强，恶性程度高。在浸润性乳腺癌中发现Ki67与肿瘤细胞增殖及侵袭转移密切相关。部分学者认为Ki67表达与乳腺癌肿瘤临床分期有关，即分期越晚，Ki67阳性率越高。Ki67与肿瘤恶性程度呈正比与肿瘤的生长、侵袭及转移能力密切相关，是乳腺癌诊断和预后判断的一项重要指标。Ki67表达阳性的乳腺癌肿瘤细胞的恶性程度大，细胞增殖活跃,肿瘤生长速度快侵袭性大，转移的机会高，预后差。Ki67高表达是乳腺癌预后不良的指标。4 小结4.1石蜡切片制作的体会石蜡切片是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，
14、也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。下面就按照实验步骤，谈一下我的一些体会。4.1.1取材应根据要求选取材料来源及部位。4.1.2固定用适当的化学药液（固定液）浸渍切成小块组织材料，并选择合适固定液量以及固定时间 。4.1.3.脱水透明，固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。脱水时间长短应根据组织厚度，组织较薄或小，脱水时间不宜过长，否则组织会出现过硬或过脆的现象；组织厚度大时相对要求时间长些。透明时要注意： 要保证最后一级纯酒精的浓度，使组织彻底脱水，否则在二甲苯内
15、就不能得到完全透明。 切片从纯酒精取出后进入二甲苯时，在空气中停留的时间不宜过长，特别是在阴天，空气湿度较大时，因纯酒精吸水性较强，致使切片进入二甲苯时其表面出现雾状而使切片透明不良。4.1.4浸蜡要掌握时间，过短石蜡没有完全渗入组织中，会出现组织过软，切片困难。过长会造成组织硬脆，切片也难。组织包埋时要掌握好标本切面，选择较完整平坦面为切面，切面朝下。小标本包埋速度应快，否则易造成组织块与周围石蜡的脱裂，包埋好的蜡块放置4冰箱中过夜，便于切片。4.1.5切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，切片刀要求锋利且无缺口，切片自行卷起多由切片刀不锋利所致。刀有缺口时，易造成断裂、破碎和不完
16、整。切片时组织块固定不牢时，切片上常形成横纹及切片厚薄不均。因此刀放置的要有合适的夹角。为保证切片的完整性，对于组织结构致密的组织如淋巴结等应适当薄切以防细胞成分叠加，影响观察效果。遇到硬化过度的肝、脾、脑等组织时应轻轻切削，以防组织由于震动产生空洞现象。4.1.6贴片与烤片，用蛋白甘油作为粘附剂，在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，防止蛋白甘油吸附过多，在染色时出现脱片现象。4.2应用HE染色的体会苏木精伊红染色法简称HE染色法，它是最常用的普通染色方法。苏木精（hematoxylin）是阳离子染料，将细胞核内的嗜碱性物质染成蓝紫色。伊红（eosin）是阴离子染料，将细胞质和胶原纤维等染成粉红
17、色。虽然HE染色是一种十分常见的染色方法，但对于不同的组织，其脱水，染色，透明等步骤的具体时间有所不同，很多环节还有待进一步摸索。 下面就按照实验步骤，谈一下我的一些体会。4.2.1染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。4.2.2苏木精染色后，分色是至关重要的，应该在显微镜下进行。一般以细胞核染色比较清晰，细胞质等基本无色为宜。如发现过染，可以延长分色时间，若染色太浅，则应重新进行染色后再分色
18、，总之必需分色至细胞核清晰而背景基本无色才能往下进行。4.2.3切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。4.2.4在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。4.2.5切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。4.2.6最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。4.3应用SABC法进行免疫组化染色的体会SABC（Strept Actividin-Biotin Complex）
19、法是一种显示组织和细胞中抗原分布的简便而敏感的免疫组化染色方法。由于该方法中的链霉亲和素的等电点接近中性（pH=6.0-6.5），对组织和细胞的吸附性特别低，因而具有较低的背景。它的步骤与其他免疫组化染色基本相似，有良好的可操作性。尽管SABC法操作简便，敏感性强，但是，在操作中仍然要遵循一定的原则，才能得到可信度高的结果。下面就按照实验步骤，谈一下我的一些体会。4.3.1试验前要先做好标记，以防滴加试剂时出现混乱。4.3.2切片常规脱蜡至水：二甲苯虽然可以反复使用，但次数不宜多。乙醇的浓度是从高到低，与脱水时相反。4.3.3灭活内源性酶：使用30%双氧水和蒸馏水按1:9的溶剂比混合较为理想。
20、4.3.4抗原修复：由于Ki67蛋白在细胞核内表达，可进行热修复抗原。4.3.5正常犊牛血清封闭：封闭时应该注意室温与时间的相对关系。室温低，时间就要长一些，反之亦然。另外，保持反应池湿润是重要的一环，否则，前功尽弃。后面的步骤也是如此。4.3.6一抗的浓度：这需要自行探索，虽然试剂公司给出了参考浓度，但仍然要探索出恰当的浓度，任何取巧的念头都是得不偿失的。孵育时间与温度：抗原抗体充分反应是得到可靠结果的关键。因此，控制温度与时间也是一个严肃的问题。由于室温控制较为困难，可放在4冰箱过夜（18h）4.3.7滴加BSA、一抗、二抗、SABC等要以覆盖满组织为宜。4.3.8所有的反应均应在湿盒中进
21、行，PBS洗切片时要将组织完全浸润在液体中。4.3.9DAB显色镜下控时：DAB浓度应该比推荐的要低一些，这样可以便于控制反应时间以及在合适的时候中止反应。同时注意，使用后残余的DAB应妥善处理，而不是随便倒入下水道，因为它可能有致癌性。4.3.10脱水透明：脱水乙醇的浓度由低到高，有一个较准确判断脱水成功与否的办法是：观察透明后盛二甲苯容器的壁，若发现白色雾状现象，则说明脱水不成功，应再次脱水。透明时间不要太长，1分钟左右就可以了。4.3.11封片：封片时，中性树脂量宜少，同时注意不要产生气泡。4.4在整个实验过程中，要注意的方面4.4.1要设立对照，以及做好记录，以便于在问题产生时查找原因。4.4.2注意时间与温度的相对关系，留心试验过程，优化试验结果。4.4.3要提前准备：例如各种浓度的乙醇要提前准备好，孵育设备提前开机等，都要考虑周到，否则会影响实验的进程，甚至影响实验的结果。4.4.4准备一份操作流程图，按部就班做实验，同时也有利于查找失败的原因.
