1、植物基因工程复习大纲答案 园艺植物遗传工程原理与技术复习大纲第一章 基因工程基本原理1、基因工程的概念在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。2、断裂基因：真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。3、mRNA的加工去掉内含子不编码的内含子序列被切掉，使得编码序列连续并使mRNA成为蛋白质合成的正确模板，这个过程mRNA的剪接。加帽真核生物mRNA 的5端被
2、帽子结构修饰，加帽过程即加止已修饰的核苷酸7-甲基鸟苷。聚腺苷酸化许多真核生物的mRNA前体在3末端被附加的约20-250个腺苷酸的序列即聚腺苷酸尾（polyA tail）所修饰，这种修饰叫做聚腺苷酸化。4、启动子的成分帽子位点、 TATA盒、CAAT盒、GC盒帽子位点(cap site)，即转录起始点，其碱基大多为A（指编码链），两侧各有若干个嘧啶核苷酸。TATA盒(TATA Box)，又称Goldberg-Hogness Box，是位于转录起点上游的一段保守序列。它的顺序为TATAAATA，位置在-34-36之间。绝大多数的真核基因都有TATA盒，TATA盒对真核基因的转录起始不是必需的，
3、缺失仍可进行转录，但转录的起始就会不在原来的位置上，而且转录可以在若干个不同的位置上开始，产生多种转录物；同时，TATA盒中的任一碱基的突变，都引起转录的剧烈下降。因此，TATA盒决定了转录起点的正确选择，并影响转录起始的效率。在有些基因中不存在TATA盒，这样的基因中可能存在某种替代机制CAAT盒（CAAT Box）， 在某些真核基因中存在，其一致序列为GGTCAATCT。一般位于-75附近，虽然名为CAAT盒，但前面GG的重要性并不亚于CAAT部分。CAAT盒的突变会导致转录效率的急剧下降，它对某些基因的转录是必需的，对某些基因（如胸苷激酶基因）的转录则是不必要的。GC盒（GC Box），
4、有一些RNA聚合酶II转录的基因在远离起点的更上游处有一段CCGCCC序列，称为GC Box，它与转录的调节有关。 5、启动子的类型按作用方式及功能不同，可将启动子分成组成型、诱导型和组织特异型等三种类型1)组成型启动子（constitutive promoter）表达具有持续性 RNA和蛋白质表达量相对恒定 不表现时空特异性 不受外界因素诱导 大多数组成型启动子转录起始位点上游几百个核苷酸处，存在有六聚体基元（hexamer motifs）序列TGACTG。2)组织特异型启动子（tissue-specific promoter）又称为器官特异性启动子（organ-specific promo
5、ter）。发育调节（developmental regulation）常见的有如花药绒毡层特异启动子TA29等。 3)诱导型启动子（inducible promoter）是指在特定的物理或化学信号的刺激下，该类启动子可以大幅度地提高基因的转录水平，因此，又称诱导型调节序列或诱导型增强子（inducible enhancer）。该类启动子的共同特点：启动子的活化受到物理或化学信号的诱导；其分子结构都具有增强子、沉默子或类似功能的序列结构；感受特异性诱导的序列有明显的专一性；一部分该类型启动子同时具有组织特性表达的特点；该类启动子常以诱导信号命名，可分为光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、
6、创伤诱导表达基因启动子、化学物质诱导表达基因启动子、化学物质诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等。6、真核基因的结构5上游区5上游区是指基因转录起始点5端上游包括启动子在内的一段很长的区域，其中包含着与基因转录起始与表达调控有关的许多元件。5非翻译区基因的转录起始位点到翻译起始密码子之间的一段序列被称为5非翻译区。 5上游区：Joshi曾比较了79个高等植物基因启动区的DNA序列，推衍出在基因转录起始点附近的一致序列（consensus sequence）是CTCATCA。其中的一个A是转录起始的核苷酸，一般都将此核苷酸编号为+1位。转录本中的核苷酸位置均以
7、正数表示，而A的5上游区非转录核苷酸则以负数表示，A的两边通常是嘧啶核苷酸。 TCACTATATATAG，简称为TATA box，这些序列对RNA聚合酶II准确地使基因起始转录是必需的。TATA box上游-75bp附近常有一致序列GC（T/C）CAATCT，简称CAAT box，这些序列有增强基因转录的作用。在有些植物基因中，没有明显的TATA box；在另一些植物中，AGGA box替代了CAAT box。从转录起始位点到CAAT box附近这一区段通常被称为启动子或基础启动子。 在5端远上游区域中，还存在对基因的表达有增强或阻遏作用的序列、决定基因在特定时空表达的序列以及对激素或外界胁迫
8、有应答作用的序列，由于这些序列对基因表达起调控作用，因此统称为调控元件，又由于它们与基因位于同一条DNA链上，故又称顺式作用元件（cis-acting element）。有些研究论文中提到的启动子有时也包括了这些元件在内的很长一段区域。 5非翻译区：基因的转录起始位点到翻译起始密码子之间的一段序列被称为5非翻译区。该区的5端是前体mRNA加帽（7-甲基鸟嘌呤核苷）的位点。有些基因的5非翻译区中还有一些茎环结构，这些茎环结构与翻译起始密码子中的旁邻序列对翻译的效率都有影响。一般在5帽结构后有一段富含嘧啶的区域；此外有些植物基因的5非翻译区中还鉴定出有内含子存在。如在Ubiquitin基因、Sh基
9、因、Actin基因、Adhl基因与Wx基因中的5非翻译区中均有内含子存在，且这些内含子都有增强基因表达的作用3编码区：起始密码子 Kozak比较了47种植物基因与植物病毒基因中翻译起始位点附近的23个核苷酸，除了一个基因例外，其余的都是从5端的第一个AUG作为翻译起始密码子的。例外的是菜豆的凝集素基因，它的转录本5端有4个AUG，但彼此的读码框不同。可能是由于前面3个AUG的旁邻序列不适宜核糖体的识别而不被使用，第4个AUG是真正的翻译起始密码子。内含子 ）植物基因的编码区中也常有数目不等的内含子，而且有些编码区中的内含子也有增强基因表达的作用。 ）有些真核基因中的一个外显子正好对应于此基因所
10、编码蛋白质中的一个结构域，因此有人推测在基因演化过程中，一个内含子可能会带着相邻的外显子在基因间飘移，从而构成不同结构域组成的不同蛋白质分子。 3非翻译区：3非翻译区是指转录本中终止密码子后面的一段序列，这段序列中也有一些调控元件，它们对mRNA的稳定性和翻译的效率均起重要的调节作用。6、DNA双螺旋两条链中一条是模板链（template strand），另一条是非模板链（nontemplate strand）。生成的RNA是用DNA的模板链为模板，合成的RNA分子是非模板链的拷贝。基因的碱基次序通常是指非模板链的碱基次序。 非模板链也被称为有义（+）链（sense(+) strand）或编码
11、链（coding strand）。合成的RNA分子被称为转录产物（transcript），接着可能用于翻译产生蛋白质或用作rRNA或tRNA。有义链=非模板链=正链=编码链反义链=模板链=负链=非编码链7、内含子的特点：GT /AG规则内含子的5末端的头两个碱基是GT，3末端的最后两个碱基是AG阅读框：ATG （起始密码子）UAG UAA UGA（终止密码子）第二章 基本技术1、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶的浓度与分离的DNA的大小的关系成反比电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定
12、或提纯的技术。 迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。影响凝胶电泳迁移率的因素 （一）、样品的物理性质 1分子大小 2分子的空间构型：超螺旋构型 环状线状 3带电量 （二）、支持物介质（种类和浓度）含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同, 凝胶浓度 浓度越小，孔径越大（三）电场强度 电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快（四）电泳缓冲液（种类、pH、离子强度） 1、pH值：决定带电颗粒的解离程度，缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。2、离子强度：离子强度小，溶液的导电性小，带电颗粒泳动慢 ；3、种类 ：TBE（Tris、硼酸、EDTA
13、）：缓冲能力强。首选TBE。DNA电泳带模糊的原因：1）DNA降解，应 避免核酸酶污染；2）电泳缓冲液陈旧 电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液； 3）所用电泳条件不合适 电泳时电压不应超过20V/cm，温度30；巨大DNA链电泳，温度应15；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力 ；4) DNA上样量过多 减少凝胶中DNA上样量； 5) DNA样含盐过高 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐； 6) 有蛋白污染 电泳前酚抽提去除蛋白； 7) DNA变性 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。 2、Southern Bl
14、otting 原理：具有一定同源性的两条核酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱基互补退火形成稳定的双链分子 作用和技术路线：Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下列步骤:(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。(4) 让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。(1) Southern杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸
15、纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。(2) Northern杂交：RNA片段经电泳（变性电泳）后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。3、Northern Blotting 原理、作用和技术路线4、Western Blotting 原理和作用：Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。技术路线：经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋
16、白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。5、大肠杆菌的遗传转化对受体大肠杆菌的要求：限制缺失菌株，修饰缺失（失去了甲基化酶）；感受态感受态：即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。感受态细胞制备及转化中的影响因素：、细胞的生长状态和密度：密度过高或不足均会使转化率下降。、质粒DNA的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超
17、螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。、试剂的质量：所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4。、防止杂菌和杂DNA的污染、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。 第三章 DNA分子的切割和连接1、限制性内切酶的种类： 型、型、型、型和Mcr（修饰的胞嘧啶限制）型。型是用得最普遍的一种，其次是Mcr型的识别位点和切割位点都具有特异性，因此，用得最多。型酶的作用需要镁(magnesium) 离子作辅助因子。1、 粘性末端当一种限制性内切酶在一个特异性的碱基序列处切
18、断DNA时，就 可在切口处留下几个未配对的核苷酸片段，即5突出。这些片断可以通过重叠的5末端形成的氢键相连，或者通过分子内反应环化。因此称这些片段具有粘性，叫做粘性末端。 钝末端当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。同尾酶靶序列相同的酶叫同裂酶（isochizomer）， 同裂酶产生的末端有些相同，有些不相同。同裂酶产生相同末端的酶叫同尾酶(isocaudamers)。2、 怎样测定胞嘧啶发生了胞嘧啶的甲基化利用Hpa不能切割CC*GG但Msp可以切割CC*GG的特性。3、 dam(DNA腺嘌呤甲基化酶)和dcm（DNA胞嘧啶甲基化酶）
19、的作用保护DNA不被限制性核酸内切酶消化。为了避免这样的问题，在基因克隆中是使用失去了甲基化酶（dam-和dcm-）的大肠杆菌制备质粒DNA的。4、 DNA分子连接的策略 双接头（double-linker）是指用化学方法合成的一段由8-12个核苷酸组成、具有一个或数个限制性酶识别位点的、两端均为平末端的双链寡核苷酸短片段。在双线cDNA两端（hairpin loop先用S1核酸酶去掉后再加上接头）都加上一个具不同内切酶识别序列的接头。衔接头（Adaptor）衔接物是人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘性末端，另一头为平末端的双链核苷酸断片段。先用产生平末端的内切酶切开，再把衔接头加上去。同聚
20、物加尾(Homopolymer tailing)在核酸分子末端加上一段同聚体多核苷酸 第四章 大肠杆菌中所用的克隆载体一、 质粒的基本特性1、 质粒的概念 是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。2、 基本特性1、质粒的基本性质（1）质粒的复制 所有的质粒上都至少有一个复制子，复制子是一个遗传单位，包括DNA复制起点及其相关的调控元件。不同的质粒有不同的酶系列，在宿主中进行不同程度的复制。 （2）质粒的类型 根据质粒上的特殊用途的基因，质粒大致分为五类：A、生殖性质粒简称F质粒B、抗性质粒（Resistance plasmid）简称R质粒C、Col质粒：此类质粒编码有控制大肠杆
21、菌素合成的基因，即所谓产生大肠杆菌素因子。D、降解质粒(degradative plasmids)。这种质粒编码一种特殊蛋白,可使宿主菌代谢特殊的分子,如甲苯或水杨酸。E、 致病质粒(virulence plasmids)：如Ti（tumor induce）质粒，赋予宿主细菌细胞以病原菌侵染性（具有致病力），带有致病基因和与激素合成有关的基因。根据质粒DNA中是否含有接合转移基因，可以分成两大类群:即接合型质粒和非接合型质粒。（3）质粒的不相容性或不亲和性（4）移动性 ：A、接合（conjugation）：细胞质粒通过性纤毛从一个细胞转移至另一个细胞的过程。B、 迁移作用：共存的接合型质粒引发
22、的非接合型的质粒的转移过程，称质粒的迁移作用。（5） 重组性：有rec+存在时，发生重组至染色体上。 环状双线DNA 超螺旋DNA松散共价闭合环状开放环状DNA 隐蔽质粒形态尚未描述、不能使寄主产生表型症状的质粒叫隐蔽质粒。 质粒DNA中是否含有接合转移基因，可以分成两大类群:即接合型质粒和非接合型质粒。结合型质粒亦称自我转移的质粒，这类质粒除含有自我复制基因外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因非结合质粒亦称不能自我转移的质粒，此类质粒能够自我复制，但不含转移基因组，因此这类质粒不能从一个细胞自我转移到另一个细胞 松弛型质粒一个细胞含多个拷贝 紧密型质粒一个细胞含少数拷贝 不亲和性在
23、没有选择压力的情况下，不同的质粒不能同时存在于一个寄主细胞的现象。 穿梭质粒载体人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。二、 质粒的纯化碱裂解法：细胞裂解 染色体凝聚 蛋白质沉淀三、 理想载体的条件（1）具有在宿主细胞中独立地进行自我复制和表达的能力，在受体细胞中扩增较多的拷贝。（2）有两个以上容易检测的遗传标记，以赋予宿主细胞以不同的表型，便于识别和筛选 。（3）具多个限制性内切酶的单一切点（单一切点越多，越易选择合适的酶，保证目的基因的完整性，单一切点最好位于选择标记基因内，便于筛选重组体）。（4）载体DNA的分子量应较小，可插入较大的外
24、源DNA片段，而不影响其自身的复制。 （5）容易从宿主细胞中分离纯化。四、 载体的改良和构建增加选择标记和单一内切酶位点（多克隆位点）pBR322和pUC载体的一些基本特性pBR322的优点 双抗菌素抗性选择标记： 插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞在Amp或Tet其中之一中死亡。 分子小，克隆能力大 高拷贝数：氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy 安全：失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。pBR322的缺点：保留了转移蛋白（mob）的作用位点。能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，
25、如果再有F质粒的参与，就有可能转移pUC系列载体的优点 更小的分子量：如pUC18为2682bp 选择方便：Xgal显色、抗菌素双重直接选择 克隆便利：具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。 测序方便：pUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同，便于把外源DNA转移到M13载体上测序。五、 低拷贝质粒载体特点是分子量小，拷贝数低。当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。转化子：转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子 重组子：含有插入片段的转化子六、 失控质粒(runaway plasm
26、id)温度敏感型复制控制质粒温度低（低于37 oC），拷贝数很少；温度增加（40 oC）时，拷贝数会很快增加到1000个以上。第五章 大肠杆菌的噬菌体（phage）和柯斯质粒（Cosmid）溶菌周期：溶原周期：一、 噬菌体1、基本特性特点：长度为48.5kb ；双链线性DNA；在两端有cos位点（粘性末端形成的双链区域），可以环化。2、噬菌体载体 野生型的DNA不能作载体，因为对大多数内切酶来说，有过多的限制位点。人工构建的噬菌体载体有两种类型： 插入型载体1）免疫功能失活型：2）-半乳糖苷酶失活型载体 替换型载体容量不能大于总DNA的5%，保留的DNA不能少于75%。二、 Cosmid ve
27、ctor概念是一类由人工构建的含有 DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。 特点：高容量的克隆能力：克隆能力为32-47kb。兼具噬菌体和质粒载体的优点。方便的选择：有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。三、 噬菌粒（phasmid or phagemid）载体概念-含有噬菌体的附着（attachment）位点的质粒叫噬菌粒。利用噬菌体的附着位点特性，可将该质粒插入到噬菌体中，从而可以无限期地保存。四、 用单链DNA载体克隆用双脱氧核苷酸进行DNA测序；用寡核苷酸指导突变和某些探针的制备需要用单链DNA载体。ZAP载体的主要特性：1、在多克隆位点内可插入10kb外源DNA2、通
28、过半乳糖苷酶基因的插入失活，可在X-gal平板上根据颜色进行重组体的筛选。3、 克隆的DNA可以自动地从噬菌体上切割下来并装到小质粒上。五、 P1噬菌体的衍生载体这是一类大容量载体，可容纳95kb外源DNA。这类载体都含有P1的包装位点，这是将载体包装到噬菌体颗粒所必需的。它还含有两个loxP位点，它是噬菌体重组酶的识别位点。第六章 克隆策略、基因文库和cDNA克隆一、 克隆策略步骤 1、外源DAN片段的获得2、将外源DNA片段连接到载体上3、将重组体导入到寄主细胞中并能复制4、 重组体的筛选二、基因组文库 一般先用较多核苷酸识别位点内切敏切割产生较大的片段，然后用较少核苷酸识别位点的内切敏切
29、割产生较小的片段。噬菌体载体可用柯斯质粒载体代替，因为柯斯质粒的离体包装的效率高，容量也比的大。但也有两个不足：第一，筛选文库时，cosmid重组体靠菌落杂交筛选，而噬菌体重组体靠噬菌斑杂交筛选，前者的效果不如后者。噬菌斑的背景影响比菌落杂较的背景影响小。第二，cosmid的保存寿命比噬菌体的短利用扩增的文库必须慎重，因为有可能失真。染色体步查分离序列尚不知道，但遗传位置知道的基因的方法。其步骤如下：1、首先应该找到一个克隆片段的起点，而且尽可能靠近要找的目的基因。2、建一个随机的基因组文库。3、根据遗传图谱选一个与待找的基因最靠近的克隆片段做探针，进行杂交筛选。4、用重叠探针继续进行一步一步
30、地筛选。在步移过程中，可能会存在重复DNA序列的干扰，重复序列可能分散在不同的地方，因此，起点可能在不同的地方，有可能离目的基因很远。三、分析大片段DNA序列和长距离染色体步移1、在稀有位点切割DNA（大片段DNA的获得） 多核苷酸识别位点的酶如八核苷酸识别位点的内切酶。 稀有限制性内切酶 将甲基化酶与限制酶的特异性结合起来，如Dpn的识别序列为Gm-A-T-C，产生钝末端。2、脉冲电场凝胶电泳和倒转电场电泳 用于分离大片段（可大2000kb）3、染色体跳查战略首先把大片段DNA环化，然后克隆包括封闭环在内的DNA片段，这样便把本来相隔很远的位点拉得较近了。2、 cDNA克隆克隆cDNA的优点在于： 排除了内含子 可以研究基因表达的时间和空间的特异性第七章 重组体的筛选一、 遗传学方法1、筛选载体 根据抗药性和半乳糖苷酶基因的插入失活等2、筛选插入序列二、免疫化学法三、DAN蛋白质杂交筛选DNA结合蛋白用硝酸纤维素膜吸附表达的融合蛋白，然后用同位素标记的DNA与之杂交，进行筛选。四、核酸杂交法1、探针的来源 cDNA克隆 保守序列 化学合成寡核苷酸（14-20个核苷酸） 简并引物2、差示筛选 用途： 分离组织特异性基因 发育阶段特异性基因 诱导表达的基因3、扣除cDNA克隆和差示筛选 扣除cDNA克隆和差示筛选的本质是先去掉普遍存在的DNA，然后选出目
