1、园艺植物生物技术理论课教案Biotechnology of Horticultural Plant园艺植物生物技术（理论课教案）河南科技学院园艺林学学院2016河南科技学院教案（首页） 授课时间 20XX年3-7月 教案编写时间20XX年7月课程名称园艺植物生物技术课程编号1306102040总学时 64讲课： 40 学时实验： 24 学时实习： 0学时学 分 数4课型必修课（） 选修课（ ）理论课（） 实验课（ ）任课教师李桂荣、杜晓华、姜立娜职称教授（博士）、副教授（博士）、副教授（博士）授课对象2014（班）级 园艺 专业 1、2班基本教材或主要参考书园艺植物生物技术，巩振辉主编 科学出
2、版社 2009H.S.乔拉 植物生物技术导论(影印本) 科学出版社 2004H.S.乔拉 植物生物技术导论(许亦农 麻密 译) 化学工业出版社 2005园艺植物生物技术，邓秀新、胡春根主编。高等教育出版社 2005教学目的与要求本课程的任务是使学生了解现代生物技术的发展概况和趋势，掌握园艺植物的组织培养基本技术、脱毒快繁技术、细胞培养和体细胞杂交技术、基因分离及遗传转化的基本原理和技术，以及DNA标记技术，为将来从事园艺植物生物技术相关研究及其产业应用奠定良好的理论和技术基础。教学重点、难点重点：生物技术的概念/应用现状、组织培养技术、病毒病脱除与无病毒繁殖难点：原生质体操作技术、基因分离克隆
3、、转基因技术教学进程第 次课12-45-78-101112-1314-171819-20授课章节（40学时）Theory part（40 hs）1) Introduction2) Tissue culture of horticulture plant3) 园艺植物脱毒与离体快繁技术4)园艺植物细胞工程5)园艺植物染色体工程6)植物基因工程的基础知识与技术7)园艺植物基因的分离、克隆与遗传转化8)转基因技术在园艺植物育种上的应用9) 园艺植物的分子标记学 时266624824备 注本课程采用多媒体课件教学4次实验课，分别为园艺植物组织培养技术（10学时）、园艺植物染色体工程（4学时）、DNA鉴
4、定及分子标记技术（10学时）。河南科技学院教案（课时备课） 第 1 次课 2 学时章节第一章 绪论主要参考资料（1）巩振辉主编，园艺植物生物技术，科学出版社，2009（2）H.S.乔拉，植物生物技术导论(影印本)，科学出版社，2004（3）H.S.乔拉，植物生物技术导论(许亦农 麻密 译)，化学工业出版社，2005（4）邓秀新、胡春根主编，园艺植物生物技术，高等教育出版社，2005教学目的和要求（1）掌握园艺植物生物技术的概念、内容、园艺植物生物技术的应用（2）熟悉园艺植物生物技术的发展历程（3）了解园艺植物生物技术的发展历程重 点难 点（1）重点：生物技术的内涵（2）难点：生物技术的实际操作
5、教学内容一、生物技术的概念1.以现代生物学理论为基础，以基因工程为核心的一系列技术的总称。2.狭义的植物生物技术：在离体条件下，对植物（细胞）进行遗传改良或使其增殖的各种技术的总称，包括细胞水平、分子水平两个大的层面。“Biotechnology” means any technological application that uses biological systems, living organisms, or derivatives thereof, to make, or modify products or processes for specific use.二、生物技术类型1
6、.传统生物技术2.现代生物技术三、生物技术的主要内容1.园艺植物组织培养2.园艺植物细胞工程3.园艺植物染色体工程4.园艺植物基因工程5.园艺植物分子标记四、园艺植物生物技术的发展简史（一）组织和细胞培养是园艺植物生物技术的平台 1838-1839年，Schleiden和Schuwann提出植物和动物均由细胞构成，细胞进行分裂而增多，并组建成生物体的“细胞学说”；同时指出，若提供的条件同在活体内一样，每个细胞应该能独立生存和发展。1898年德国植物生理学家Haberlandt试图通过实验证明该学说，于1902年发表了植物细胞培养方面的第一篇论文，提出了植物细胞全能性（Totipotency）的
7、概念。这一概念是指植物的每一个细胞在一定条件下，具有发育成一棵完整植株的能力。这一概念直到1971年烟草单细胞培养成功才得到完全证明并成为理论。1943年，White出版了植物组织培养手册。1958年，Steward从烟草髓细胞培养出完整植株，向证明细胞全能性迈进了一大步。该结果促进了多细胞组织和器官的培养研究与应用。1960年Morel培养兰花茎尖获得再生植株，并证明脱除了病毒。该结果催生了兰花工业的发展。直到今天，世界兰花种苗基本上通过组织培养生产。同年，Cocking通过酶解法从植物组织中分离得到去除了细胞壁的原生质体，使组织培养技术又向前迈进了一步。1962年，Murashige和Sk
8、oog发表了促进烟草快速生长的培养基配方，即今天十分流行的MS培养基。1964年，Guha和Maheshwari成功地从蔓陀萝花药培养得到再生植株，开创了花药培养获得单倍体的先河。1971年，Takebe等报道了烟草原生质体培养成为完整植株，至此，植物细胞全能性得到完全证明。次年，Carlson获得烟草两个种间的原生质体融合再生的体细胞杂种植株。植株组织培养的发展得益于两个方面的进展。一是对植物激素(plant hormone)的认识，以及人工合成激素（生长调节剂，plant growth regulator，PGR）的生产和应用，促进了植物组织培养技术的发展。1934年Went发现了植物生长
9、素；1956年Miller发现细胞激动素。正是这些发现带动了植物组织培养技术的发展。今天，组织培养研究多数情况下是在摸索激素配比，也说明了植物激素研究对组织培养的重要性。二是植物营养学科的发展。人们认识了植物生长必须的营养物质，利用该学科的成就，不断改进培养基配方，使得组织培养技术得到迅速普及。植物组织培养技术的发展和成熟，有了一个离体无菌的技术平台，人们才有可能进行今天的转基因研究，才会有今天依赖离体培养的诸多技术的产生，如快繁技术，离体保存、茎尖微芽嫁接脱除病毒技术等。可以说，组织培养技术是植物生物技术的基本平台，一个作物组织培养技术的成熟程度可以影响其基因工程的进展。（二）基因工程技术是
10、未来园艺植物生物技术的核心基因工程技术的发展以20世纪70年代DNA重组技术的建立为标志。人们把1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型，作为分子生物学和基因工程技术的里程碑。与组织培养技术的发展历程类似，基因工程技术的发展得益于生物化学、遗传学、细胞学等多个学科的发展。1983年，世界上首批转基因烟草和马铃薯问世；1986年，首批转基因植物进入田间实验；1993年，转基因番茄在美国面市。尽管转基因番茄没有在美国得到大面积推广应用，但转抗除草剂的大豆、转抗虫基因的玉米在美国等国家大面积推广，产品已销往世界许多国家。五、园艺植物生物技术的展望1. 脱毒与快繁技术广泛用于园艺作
11、物种（苗）的生产2. 花药培养以及小孢子培养是获得单倍体以及纯合二倍体材料的最佳途径3. 胚抢救技术克服了果树早熟品种选育的技术难题4. 细胞融合技术创造出200多例柑橘体细胞杂种5.分子标记广泛应用于育种和资源研究6.基因克隆与遗传转化方兴未艾作业布置1.生物技术包括哪些内容？2.简述植物生物技术发展简史3.论述园艺植物生物技术的应用及发展趋势课后自我总结分析绪论应讲得宏观一些，主要激发同学们对该课程和专业的学习兴趣。河南科技学院教案（课时备课） 第 2-4 次课 6学时章节第二章 园艺植物组织培养的理论基础与基本技术主要参考资料（1）巩振辉、申书兴主编，植物组织培养，化学工业出版社，200
12、7（2）雷特迪亚、克里斯蒂森，生物技术导论，科学出版社，2002（3）李浚明、朱登云编译，植物组织培养教程(第3版)，中国农业大学出版社，2010（4）邓秀新、胡春根主编，园艺植物生物技术，高等教育出版社，2005（5）郭仰东主编，植物细胞组织培养实验教程，中国农业大学出版社，2009（6）胡桂兵主编，园艺植物生物技术实验指导，中国农业出版社，2010教学目的和要求（1）掌握植物组织培养的原理与技术（2）了解植物组织培养技术在园艺生产与品种改良中的应用现状与前景重 点难 点（1）重点：掌握植物组织培养操作技术（2）难点：组织培养技术的无菌操作教学内容第一节概述一、园艺植物组织培养的概念和类型（
13、一）基本概念1.植物组织培养2.外植体3.培养基4.脱分化5.再分化6.愈伤组织7.不定芽8.胚状体（二）园艺植物组织培养类型1.培养材料2.培养基3.培养方式二、园艺植物组织培养的理论基础Basis for cell culture1.细胞是生物有机体的基本结构单位，特别是植物细胞又是在生理上发育上具有潜在全能性的单位。2.细胞分化和形态建成（1）合子胚的发育，经历生长和分化过程，生长为完整结构的有机体；（2）体细胞生长（类似），开始是进行生长。从一个分化的有专一功能的细胞，要表现它的全能性，首先要经过去分化（脱分化）的过程，改变细胞原来的结构、功能，而回复到无结构的分生组织状态，即愈伤组织
14、状态。愈伤组织分生细胞团再分化，进行形态建成，而产生完整植株。（体细胞胚胎发生）胚状体可从以下几种培养物中产生：直接从器官上发生；从愈伤组织上发生；从游离的单细胞发生；从小孢子发生。3.最常见的再分化是根的形成：3 种方式先形成根的，往往抑制芽的形成；先形成芽的，较易产生根；同时产生芽和根。三、园艺植物组织培养的意义1.加速无性或有性世代的繁殖，缩短育种周期或获得新的基因。2.服远缘杂交不亲和的障碍，促进幼胚发育。3.获得三倍体。4.快速繁殖苗木具有质量好、体积小、便于携带、运输和交流。5.获得无病毒苗木。6.离体保存（包括超低温）种质资源四、园艺植物组织培养理论与技术发展简史1.探索阶段19
15、02年，植物生理学家（德），根据细胞理论，提出：高等植物的器官和组织可以不断分割、直至单个细胞的植物细胞全能性（totipotency）的理论。即植物的体细胞在适当条件下，具有不断分裂和繁殖，发展成完全植株的潜在能力。2. 奠基阶段3. 迅速发展阶段第二节 园艺植物组织培养所需的仪器及设备一、实验室设置（一）基本实验室准备室准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。接种室接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。培养室培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微
16、生物感染，培养室应保持干燥和清洁。（二）辅助实验室细胞学实验室其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。摄影室及暗室其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。生化分析室在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。二、培养容器与用具玻璃容器塑料容器金属用具塑料用具第三节 组织培养基一、培养基的种类和成分（一）培养基的种类1培养基是组织培养最重要的基质。2培养基的名称多数以发表人的名字命名，再加上年号。3国际上常用的五种培养基：MS：Murashig
17、e 和Skoog (1962)ER：Eriksson（1965）B5：Gamborg等（1968）SH：Shenk和Hildebrandt（1972）HE：Heller（1953）MS（Murashige和Skoog 1962）M6（朱至清1975）：用于禾本科植物花药组织培养Miller（1963）：一般组织培养H（Bowgin和Nitsch）：一般组织培养T（一般组织培养）White（1963）：一般组织培养B5（Gamborg et al 1968）一般组织培养C17（王培等1986）：小麦花药培养W14（欧阳俊闻等1988）：小麦花药培养KM8P（Kao et al 1975）：原生质
18、体培养Lloyd and Mccoun（Lloyd 1980）：木本植物培养RM（Reinent et al 1967）：兰花4各培养基特点MS：用于烟草细胞，硝酸盐、钾和铵的含量比其它培养基高。ER：与MS相似，磷酸盐的含量比MS高一倍，微量元素含量低得多。B5：为培养大豆的细胞组织设计，铵的含量低。SH：与B5相似，无机盐的含量稍高。HE：无机盐浓度稍低，水稻愈伤组织培养上使用。(二) 培养基成分主要为五大类：（一）水（二）无机盐 大量元素 微量元素（三）有机化合物1碳水化合物2植物激素3. 维生素：维生素C、B1、B6、烟酸、叶酸、一般0.10.5 mg/L。4肌醇：一般用量100 mg
19、/L5氨基酸（四）天然复合物1椰乳 coconut milk2香蕉3水解酪蛋白（1）主要成分为氨基酸，浓度100200 mg/L。（2）受酶和酸的作用易分解。4马铃薯（1）去皮和芽，煮30分钟，过滤，一般150200 mg/L。（2）对pH缓冲作用大。5其它（1）酵母提取液、麦芽提取物、苹果汁、番茄汁、黄瓜果实、未熟玉米的胚乳。（2）遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。（五）培养材料的支持物1琼脂（agar)（1）凝固剂，一般0.61%.（2）为防止有害物质毒害，可加110 g/L的活性炭。2其它：玻璃纤维、滤纸桥等。（六）抗生物质防止内生菌，可加抗生物质。二、培养基的制备（一）母液配
20、制和保存（二）配制过程（三）pH值的调节（四）培养基分注：趁热分注（五）灭菌和洗涤三、生长调节物质的应用（一）生长素1吲哚乙酸（IAA）：有天然，也可合成，活力低。遇高温高压、遇酶、受光易分解，对器官形成副作用小。2萘乙酸（NAA）：可人工大量生产，高温高压下稳定，功能比IAA高3.7倍。32,4-D：可促进愈伤组织形成。不同器官对生长素的反应根：对生长素最敏感，低浓度下105103PPM，可促进生长；浓度高时，抑制生长。芽：浓度略高时，促进芽的生长。愈伤组织：高浓度的生长素可诱导产生，而且对愈伤组织的再分化也有诱导作用。其它：可促进细胞伸长、分裂、分化；还可促进新成代谢。（二）赤霉素（GA3
21、）1GA3对整个植株的作用比离体器官或组织作用显著，这与生长素不同。2GA3有刺激器官生长的作用，但抑制器官的发生。3GA3可刺激植物体内生长素的生物合成。（三）细胞分裂素1.对细胞分裂与分化，以及细胞的增大有促进。2.可解除顶端优势，促进侧芽生长。3.可减少叶绿素分解、延缓叶片衰老。4.对根的生长起拟制作用。生长调节物质的使用溶剂1水中直接溶解困难。IAA、NAA、IBA、2,4-D、GA3可先用少量95%酒精溶解，再加水；KT、BA等则可用0.11 N的HCl溶解，再加水。2也可配制母液，低温贮存使用，用量极微，一般用mg/L表示。使用量1一般生长为0.0510 mg/l。细胞分裂素0.0
22、520 mg/l 。2生长素和细胞分裂素的比例决定着发育的细胞类型，愈伤组织再分化是长根或长芽。生长素/细胞分裂素低促进芽形成生长素/细胞分裂素高促进根形成第四节 组织培养技术一、Steps of MicropropagationStage 0 Selection & preparation of the mother plantsterilization of the plant tissue takes placeStage I - Initiation of cultureexplant placed into growth mediaStage II - Multiplicatione
23、xplant transferred to shoot media; shoots can be constantly dividedStage III - Rootingexplant transferred to root mediaStage IV - Transfer to soilexplant returned to soil; hardened off二、外植体灭菌1.过程2.材料与前处理3.灭菌消毒 药剂种类与消毒处理时间三、组织培养过程中的变异现象（一）现象Somaclonal Variation: variability in plants regenerated from
24、 tissue culture that is either induced or uncovered by a tissue culture process. Most somaclonal variation is negative, but if enough plants are examined, positive changes can usually be recovered.The source for most breeding material begins with mutations, whether the mutation occurs in a modern cu
25、ltivar, a landrace, a plant accession, a wild related species, or in an unrelated organismTotal sources of variation: Mutation, Hybridization, PolyploidySomaclonal variation is a general phenomenon of all plant regeneration systems that involve a callus phaseThere are two general types of Somaclonal
26、 Variation:Heritable, genetic changes (alter the DNA)Stable, but non-heritable changes (alter gene expression, AKA epigenetic)Since utilizing somaclonal variation is a form of mutation breeding, we need to consider mutation breeding in more detail Inducing MutationsPhysical Mutagens (irradiation)Neu
27、trons, Alpha raysDensely ionizing (“Cannon balls”), mostly chromosome aberrationsGamma, Beta, X-raysSparsely ionizing (“Bullets”), chromosome aberrations & point mutationsUV radiationNon-ionizing, cause point mutations (if any), low penetratingChemical Mutagens (carcinogens)Many different chemicalsM
28、ost are highly toxic, usually result in point mutations（二）组织培养过程变异的利弊与利用AdvantagesScreen very high populations (cell based)Can apply selection to single cellsDisadvantagesMany mutations are non-heritableRequires dominant mutation (or double recessive mutation); most mutations are recessiveCan avoid
29、this constraint by not applying selection pressure in culture, but you loose the advantage of high through-put screening have to grow out all regenerated plants, produce seed, and evaluate the M2Alternative: perform on haploid cell linesDisease Resistant Success using Somaclonal Variation作业布置1.概念：组织
30、培养、外植体、愈伤组织、胚状体、细胞全能性、离体保存等。2.简述组织培养室的基本设施，画图描述。3.简述培养基配制的基本流程、应注意哪些方面。4.简述组织培养技术主要有哪些应用。课后自我总结分析该章是本课程的重点，是同学们毕业后可以应用的最基础技术；除技术外，同学们对基本建立起一个组培实验室也很有兴趣。河南科技学院教案（课时备课） 第 5-7 次课 6 学时课目、课题（章节）第三章 园艺植物脱毒与离体快繁技术主要参考资料（1）巩振辉、申书兴主编，植物组织培养，化学工业出版社，2007（2）雷特迪亚、克里斯蒂森，生物技术导论，科学出版社，2002（3）李浚明、朱登云编译，植物组织培养教程(第3版)，中国农业大学出版社，2010（4）邓秀新、胡春根主编，园艺植物生物技术，高等教育出版社，2005（5）郭仰东主编，植物细胞组织培养实验教程，中国农业大学出版社，2009教学目的和要求（1）了解园艺生
