1、MCPIP 1蛋白质结构功能的研究进展MCPIP 1蛋白质结构、功能的研究进展摘要ZC3H12A是免疫系统中的一个重要基因，其编码的蛋白质ZC3H12A/MCPIP 1在免疫相关疾病，尤其是自身免疫病和炎症反应中发挥重要的抑制效应。ZC3H12A的表达能够被多种炎症相关细胞因子所诱导。近来的研究报道，MCPIP 1具有转录因子、RNA酶、去泛素化酶等作用，其在调控基因转录、mRNA降解、多聚泛素链的去除、细胞凋亡、细胞自噬、炎症抑制、细胞分化、血管生成等方面都有重要作用。基因敲除小鼠患有严重的高免疫球蛋白血症、淋巴结肿大、浆细胞和记忆细胞的积聚及自身抗体的大量产生等免疫功能紊乱疾病。本文较为系
2、统地阐述了ZC3H12A基因的克隆、MCPIP 1蛋白的结构及功能，从时间的维度观其主要研究历程，以及对免疫系统的重要影响。大体上浅析了MCPIP 1从其发现至今的探索情况。【关键词】 ZC3H12A Zc3h12a MCPIP 1 RNA酶 凋亡 去泛素化酶1 简介ZC3H12A/MCPIP是一种锌指蛋白。它的全名是具有CCCH锌指结构域的蛋白质12A（Zinc finger CCCH domain-containing protein 12A），简称ZC3H12A1，又称MCP-1诱导蛋白（MCP1-induced protein，MCPIP 1）2。MPCIP的编码基因是ZC3H12A，
3、它属于ZC3H12基因家族，该家族中共有4个成员，分别编号为ZC3H12A、ZC3H12B、ZC3H12C、ZC3H12D1。此家族保守性很强，在很多物种（包括果蝇、秀丽线虫、小鼠和大鼠等）中都有发现其同源序列1。MCPIP 1最初被发现于经MCP-1处理的人外周血单核细胞中2，而后又在经IL-1刺激的人单核细胞来源的巨噬细胞中被发现3。在TNF、MCP-1、IL-1或LPS等细胞因子的作用下，该基因的转录水平被显著激活1, 2, 3, 4, 5, 6。同时，具有CCCH锌指结构的蛋白质在巨噬细胞相关的器官（如胸腺、脾脏、肺、小肠和脂肪组织等）中表达水平很高6。对于Zc3h12a基因敲除小鼠的
4、表型分析表明4, 7，该基因的缺陷与自身免疫疾病的发生相关，在炎症相关的生理和病理过程中具有重要意义。 克隆发现该基因的发现单核细胞趋化蛋白质1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)，它能够招募并激活单核/巨噬细胞，是使单核/巨噬细胞迁移的主要趋化因子。MCP-1与靶细胞膜上的CCR2结合，启动了一系列的信号通路，导致单核/巨噬细胞向MCP1高浓度处趋化性迁移8，9。用MCP-1刺激人外周血单核细胞后，提取细胞内的总mRNA。将测序结果与基因注释数据库中的数据进行序列比对后发现了一些未被注释的基因。其中表达差异最显著的一个基因是目前未知功能的基因，
5、在EST数据库中查找到了与之相对应的序列，同时在GeneBank数据库中查找到了对应的人cDNA克隆。（GeneBank序列号AW206332）研究者将它命名为人MCP1诱导蛋白（MCP-induced protein， MCPIP 1）2。对蛋白质序列分析发现，MCPIP 1有599个氨基酸，分子质量约为65.8kD，有两个脯氨酸富集区，一个核定位序列，和一个CCCH锌指结构域2。而后发现其序列中还存在一个PIN结构域4和一个泛素结合结构域7。由于该蛋白质具有CCCH锌指结构域，因而被命名为具有CCCH锌指结构域的蛋白质12a（ZC3H12A）1。序列比对发现，人MCPIP 1与小鼠中的同源
6、蛋白质的氨基酸组成有82%的相似度，cDNA的核苷酸序列组成有80%的相似度2。该基因家族的发现将MCPIP1蛋白质序列输入GeneBank数据库，在人中查找到另外3个与之相似度很高的序列。研究者将它们归属于同一家族，分别命名为MCPIP1、MCPIP2、MCPIP3、MCPIP4，其相对应的基因分别被命名为ZC3H12A (位于染色体 1p34.3)、ZC3H12B(位于染色体Xq12)、ZC3H12C(位于染色体1q22.3)，以及ZC3H12D(位于染色体6q25.1)。这一家族的成员间的共同特点为，它们都含有一个CCCH型锌指结构。同时，在小鼠中也发现了这四个基因的同源基因1。基因与蛋
7、白质概况基因定位通过对基因组序列比对分析，ZC3H12A位于人染色体1p35.3-p33上，Zc3h12a位于小鼠4号染色体上。基因结构ZC3H12A的大小约为9860 bp，有6个外显子。第一个外显子是非编码序列，转录从第二个外显子开始。启动子位于该基因上游-7660bp，具有一个Elk-1结合位点和一个SRF结合位点10。增强子位于第二个内含子中，具有4个NF-kB结合位点5。该基因上有61个已被描述的SNP。在这些SNP中，11个是非同义的SNP，其中1个位于启动子中，2个位于第二个内含子上的增强子中。在这11个非同义SNP中，有2个是标签SNP。蛋白质结构ZC3H12A编码的蛋白质MC
8、PIP 1有599个氨基酸，其分子质量为65.8 kd。对MCPIP 1的序列分析表明，该蛋白质中含有CCCH锌指结构域（能够介导蛋白质与核酸的作用）、核定位序列、脯氨酸富集区（介导蛋白质与蛋白质的相互作用）、PIN结构域（具有RNA酶活性）、以及泛素结合结构域等。这些特征性序列模体为MCPIP 1功能的研究指明了方向。通过同源性分析，研究者在小鼠基因组中发现了与MCPIP 1同源的基因序列。在核苷酸水平上它们的相似度有80%,在蛋白质水平上它们的相似度有82%。通过序列比对分析发现，MCPIP家族在进化上有很高的保守性，在很多动物中（包括果蝇、秀丽线虫、小鼠、大鼠）都存在与该家族成员高度同源
9、的cDNA序列1。CCCH锌指结构域CCCH结构是锌指的一种类型，主要的作用是结合RNA6, 11, 12，调控mRNA的加工。哺乳动物有1%的基因编码锌指蛋白13。目前所知，共有至少14种锌指，CCHH型和CCCC型锌指较为常见，CCCH型锌指较少见，只占锌指蛋白的约0.8% 11, 12, 14。CCCH锌指结构由17到25个氨基酸组成。CCCH蛋白的特点是包含1到6个CCCH型（C-X415-C-X46-C-X3-H）锌指结构域，同时也富含甘氨酸和苯丙氨酸。CCCH锌指结构域十分保守，在植物、无脊椎动物、脊椎动物中都有发现。15锌指蛋白通常是DNA结合蛋白。锌指也能调节该蛋白与RNA、蛋
10、白质、脂质的作用。CCCH锌指蛋白中的大多数能与RNA结合，调控mRNA的加工，包括mRNA成熟、出核、修饰、降解11, 12。该类型的蛋白质在巨噬细胞相关的器官内表达量很高，如胸腺、脾脏、肺、小肠和脂肪组织等6。目前研究较充分的CCCH型锌指蛋白是TTP（tristetraprolin）家族，包含4个成员，分别是TTP (Zfp36)、Zfp36l1、Zfp36l2以及Zfp36l3。该家族成员都包含两个串联的CCCH型锌指结构域，能够与mRNA的3端非转录区（3-untranslated region，3-UTR）的AU富集区（AU-rich element，ARE）结合，从而导致该mRN
11、A的poly（A）尾的降解，进而使整个mRNA降解16, 17, 18。MCPIP 1的CCCH锌指结构是C(X)5C(X)5C(X)3H 型锌指结构，与TTP中的两个锌指结构有些许不同，TTP中的锌指结构是C(X)8C(X)5C(X)3H型1。在多个数据库中搜索，发现了58个小鼠CCCH锌指基因和55个人CCCH锌指基因。在这58个小鼠基因中，有26个是已研究过的基因，其中20个与RNA代谢相关，如前体mRNA的剪切、mRNA转移出核、细胞定位、稳定性（降解）等6。用系统进化软件分析发现，无论从蛋白质氨基酸序列全长还是仅从CCCH结构域序列来看，Zc3h12家族都与Zfp36家族划于一类6。
12、这很大程度上说明此二者在结构、功能上可能具有很多共同点。脯氨酸富集区Zc3h12a有2个脯氨酸富集区，分别位于第100126位氨基酸（脯氨酸占37%）和第458536位氨基酸（脯氨酸占28%）2。脯氨酸富集区通常调节蛋白质与蛋白质的相互作用，说明ZC3H12A可能通过此结构域，与其他蛋白质有相互作用。PIN结构域PIN结构域（PIN-like domain）位于ZC3H12A蛋白氨基酸序列的第130280位。多数具有该结构域的蛋白质都有RNA酶活性。在该结构域中有4个经典的保守的酸性氨基酸，分别是D141、E185、D226、D244，它们形成一个带负电的袋子状的空间结构，能够与Mg2+结合，
13、从而发挥降解mRNA的作用4。该RNA酶结构域在Zc3h12家族4个成员间是保守的，并且在多种物种中都找到了其同源序列4。DUB结构域MCPIP1的去泛素化酶（deubiquitinating enzyme，DUB）结构域位于N端，与去泛素化功能相关7。人类基因中有100个DUB19，这些DUB被分为5个家族：泛素羧基末端水解酶家族（ubiquitin C-terminal hydrolases，UCHs）、泛素特异性蛋白酶家族（ubiquitin-specific proteases，USPs）、卵巢肿瘤蛋白酶（otubain proteases，OTU）、MJD蛋白酶（Machado-Jo
14、seph disease proteases）和具有JAB1/PAB1/MPN结构域的金属蛋白酶（JAB1/PAB1/MPN domaincontaining metalloenzymes）。每个家族都含有一种特殊的但保守的DUB结构域20。序列比对发现MCPIP1序列中不存在上述已知的任何一种DUB结构域。然而序列比对发现，该蛋白质N端具有一个泛素相关结构域（ubiquitin association domain，UBA）。该结构域在多种物种的MCPIP1蛋白质序列中保守7。实验发现，该结构域具有结合泛素的作用7。同时，通过序列分析发现，该蛋白质的N端具有一段在多种物种中都十分保守的区域（
15、N-terminal conserved region，NCR）。该区域中含有1个半胱氨酸盒（Cys box）和1个天冬氨酸盒（Asp box）7，这两段保守序列在很多DUB中都存在。通过体外捷短实验发现，NCR具有去泛素化酶的活性，该段区域与一种DUB结构域UCH具有27%的序列相似度。MCPIP1的去泛素化酶活性与很多其它的去泛素化酶都有相似的特点。如含有两个保守的序列模体半胱氨酸盒（Cys box）和天冬氨酸盒（Asp box）；作为半胱氨酸蛋白酶，MCPIP1的去泛素化酶活性会被一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂NEM完全抑制；其去泛素化酶活性并不依赖于Mg2+和ATP，但是Zn2+和Mn2+却
16、会对该酶活性产生抑制作用。 序列分析发现，MCPIP1中的去泛素化酶结构域与RNA酶结构域都位于NCR区域。Asp box中的D141、Cys box中的C157和锌指结构域中的C306是DUB活性的关键位点。D141也是RNA酶活性的关键位点。D141、C157、C306和D278/D279的突变会影响MCPIP1对NF-B信号通路的抑制活性。C157的突变也会导致MCPIP1对JNK信号通路活性及LPS诱导的炎症细胞因子产物的抑制效应的丧失。这些结果都说明，MCPIP1对炎症信号通路的抑制效应与DUB活性息息相关7。蛋白质的亚细胞定位对MCP-1转基因小鼠的表型分析发现，MCPIP 1主要
17、定位于心肌细胞的细胞核中2，而随后对小鼠巨噬细胞中MCPIP 1表达情况的研究表明MCPIP1定位于细胞质1, 4，而后对HepG2细胞的研究表明MCPIP1定位于细胞骨架及以颗粒的形式位于细胞质中3。基因的组织特异性表达情况Northern Blot分析表明，ZC3H12A基因的mRNA在白细胞中含量最高，其次是在心脏组织和胎盘，在脾脏、肾脏、肝脏和肺中稍低。在脑、胸腺、肌肉组织、小肠和结肠中基本上没有其转录本的存在。据MCPIP1的mRNA在白细胞中的高含量推测其在免疫系统中具有重要作用3。基因敲除小鼠表型Zc3h12a敲除小鼠表现为生长迟缓，且大多数在12周内自发死亡。敲除小鼠患有严重的
18、脾肿大和淋巴结肿大。肺部浆细胞浸润、胆管和胰腺的副上皮化（paraepithelium）。浆细胞在淋巴结和脾脏中大量聚积。在淋巴结内，肉芽肿的形成导致巨噬细胞融合形成巨细胞。Zc3h12a敲除小鼠患有严重的贫血，以及白细胞和血小板的升高。并患有高免疫球蛋白血症，肺间质组织中有浆细胞浸润，并产生大量的IgG和IgA。在小鼠中发现抗核抗体和抗双链DNA抗体。70%的CD19+B细胞是IgM-IgD-，而不是免疫球蛋白+，说明大多数的B细胞在脾脏内发生类型转换。CD138+CD19dull的浆细胞在脾脏中很多。另外在脾脏CD3+T细胞中CD69的表达上调，在外周，CD44highCD62L-T细胞积
19、聚。然而，CD4+Foxp3-调节性T细胞的比例没有变化。用抗CD3的抗体刺激脾脏T细胞后，IFN的产量增加，但IL-17没变。在脾脏中，Ter119+的有核红细胞的量很高，可能是由于贫血的缘故。然而，脾脏中B和T细胞的比例、CD4+和CD8+细胞的比例没有变化。通过将基因敲除小鼠的骨髓转入经辐照的正常小鼠中，发现受体小鼠表现出延迟但显著的淋巴结肿大、浆细胞和记忆细胞的积聚。这说明是造血细胞导致小鼠免疫功能紊乱的发生。以上这些表型说明，Zc3h12a在防止以能分泌免疫球蛋白的浆细胞数量的增加及肉芽肿形成为标志的重症自身免疫性疾病的发展中发挥重要作用。用TLR的配体，MALP-2（TLR2）、p
20、oly(I:C)（TLR3）、LPS（TLR4）、R-848（TLR7）和CpG-DNA（TLR9），刺激基因敲除小鼠的巨噬细胞后，IL-6和IL-12p40的表达水平升高，但是TNF水平没有变化。经LPS刺激后，巨噬细胞表达的IL-6的 mRNA显著增加，但TNF、Cxcl1、NF-B的mRNA水平没有变化。IL-6、IFN-、Calcr和Sprr2d的mRNA在敲除小鼠巨噬细胞中的表达显著升高。用LPS刺激后，Zc3h12a敲除小鼠和正常小鼠的巨噬细胞相比，NF-B或（activator protein 1，AP-1）没有显著变化，说明MCPIP1没有参与调节TLR初始信号通路。基因敲除小
21、鼠血浆中的TNF和MCP-1含量显著增加。无论是在正常培养条件下还是在LPS诱导条件下，骨髓来源的巨噬细胞分泌的促炎细胞因子的水平都有很大程度的提高，如TNF、IL-1、IL-6和MCP-1。LPS刺激后的骨髓来源的巨噬细胞产生的炎症细胞因子的mRNA也有很大程度的提高，包括TNF、IL-1和IL-6。在小肠、肺和胸腺中的炎症细胞因子的表达都有很大程度的提高，包括TNF、IL-1、IL-6和iNOS （inducible nitric oxide synthase，可诱导的一氧化氮合成酶）。敲除小鼠自发地患有致死性的炎症综合症。其巨噬细胞和脾脏细胞中炎症相关基因的表达有显著提高，JNK和IB激
22、酶的活性升高，TNF受体相关因子的多聚泛素化升高。基因敲除小鼠的炎症相关细胞因子的表达增强。骨髓来源的巨噬细胞对LPS的刺激更为敏感。这些结果都说明12a基因是炎症反应和免疫自稳态的重要调控因子4, 7。基因功能作为转录因子，能够激活凋亡相关基因的转录MCPIP 1是具有CCCH锌指结构的转录因子，能够激活凋亡相关基因的表达，从而导致细胞凋亡。通过TUNEL分析发现，过表达ZC3H12A的HEK-293细胞中，caspase-3被激活，随后细胞发生凋亡。而用Z-VAD-fmk 作用于该细胞后，发现细胞凋亡情况得到缓解。同时，在体外通过荧光素酶报告基因实验发现，MCPIP 1锌指结构域的突变和脯
23、氨酸富集区的突变，会影响荧光素酶报告基因的转录。同时，这些结构域的突变也会导致细胞凋亡的减少。这说明MCPIP 1中，转录因子功能相关的结构域，与诱导凋亡相关的结构域相同。也就是说，MCPIP 1诱导转录的基因即为凋亡相关的基因2。这说明作为转录因子，MCPIP 1能够激活细胞凋亡相关基因的转录，从而诱发细胞凋亡。通过对MCPI-1转基因小鼠的表型分析，发现MCPIP 1在心肌细胞中高度表达，且主要集中于细胞核中。在人中，对做过心脏移植手术患者的心脏组织的研究发现，与未患有缺血性心脏病的患者相比，患有缺血性心脏病的患者，其心肌细胞中MCPIP 1的mRNA含量很高。同时在小鼠模型中和人中都发现
24、，患有缺血性心脏病的个体，MCPIP 1在心肌组织中都高度表达。由于MCPIP 1会激活一系列凋亡相关基因的转录，导致细胞凋亡，从而推测其在缺血性心脏病的发展中具有重要意义2。氧化胁迫（oxidative stress）会诱发内质网胁迫（ER stress），21进而导致细胞自噬22，而后细胞发生死亡23。对于心肌成肌细胞（cardiomyoblast）的研究表明，MCP-1的刺激会诱导MCPIP 1的表达，而产生氧化胁迫，从而导致内质网胁迫，进而引发细胞自噬，最终致使心肌成肌细胞死亡。而ZC3H12A基因knockdown后该效应减弱。MCPIP1能够激活可诱导的一氧化氮合成酶（induci
25、ble NO synthase，iNOS）的表达，使NADPH氧化酶亚单位phox47从细胞质迁移到细胞膜，诱导反应活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，诱导ER胁迫标志物热激蛋白40（heat-shock protein 40，HSP40）、PDI（protein disulde-isomerase）、GRP78（guanine-nucleotide-releasing protein 78）以及IRE1（inositol-requiring enzyme 1）的表达。MCPIP1也能引发细胞自噬，通过诱导自噬标志物beclin-1、剪切LC3（microt
26、ubule-associated protein 1 light chain 3）以及诱发自噬溶酶体的形成。同时，研究发现，在MCPIP1诱发细胞死亡的过程中，caspase 2/12、JNK（c-JunN-terminal kinase）、p38、p53和PUMA（p53 up-regulated modulator of apoptosis）都被激活。这些结果说明，MCPIP1诱导了ROS /RNS （reactive nitrogen species，反应活性氮）的产生，从而导致ER胁迫，进而通过caspase 2/12和IRE1-JNK/p38-p53-PUMA信号转导通路引发细胞自噬
27、和凋亡24。作为转录因子，能够抑制炎症相关基因启动子的活性脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，LPS可作用于TLR4并激活MyD88，后者可聚集并结合IRAK1和IRAK2，作用于肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6），进而激活MAPK和NF-B信号转导通路。活化的MAPK和NF-B信号转导通路是LPS所导致的细胞反应与炎症细胞因子（如TNF-，IL-6和IL-8等）产生的重要分子机制17。在经LPS刺激的小鼠巨噬细胞系Raw264.7和人急性单核细胞白血病细胞系（the human acute monocytic leukemia cell
28、 line）THP-1来源的巨噬细胞中，MCPIP1的mRNA和蛋白质水平都有显著升高。过表达MCPIP1后，LPS刺激后的巨噬细胞分泌的炎症细胞因子及氮氧化物的水平却显著下降。而用siRNA干扰掉Zc3h12a基因后，这些炎症细胞因子和氮氧化物的水平相比于正常情况有显著增加。这说明MCPIP1会抑制LPS诱导的炎症细胞因子（如TNF、IL-1、IL-6、MCP-1）以及iNOS的表达1。LPS能够通过某些细胞信号转导途径激活肿瘤坏死因子（TNF）及iNOS启动子的活性。而实验发现MCPIP 1能强烈地抑制LPS诱导的TNF及iNOS启动子的活性。TNF和iNOS启动子可以被NF-B信号途径所
29、激活。而过表达MCPIP1显著抑制了p65诱导的TNF启动子、iNOS启动子的活性。LPS能够激活NF-B信号途径。而过表达MCPIP1强烈地抑制了LPS诱导的NF-B小启动子的活性。这些说明MCPIP1可能是NF-B信号转导通路的一个负向调节因子1。作为转录因子，能够诱导细胞分化研究报道，在NT2神经母细胞（neuroprogenitor cells）中，MCPIP 1的激活了神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acid protein，GFAP）的表达，并导致细胞形态学的变化，进而致使细胞分化为神经胶质细胞25。在脂肪细胞形成的过程中，C/EBP转录因子家族（C/EBP
30、，C/EBP，C/EBP）以及PPAR诱导一系列基因的转录，从而使细胞分化为脂肪细胞。PPAR是脂肪细胞形成的重要转录因子26，因为所有其他转录因子必须在PPAR的存在下，才会诱导脂肪细胞的形成27。然而，对PPAR-/- 的小鼠胚胎成纤维细胞的研究发现，强制表达MCPIP 1后，细胞会在没有PPAR的情况下，产生大量C/EBP转录因子家族成员，并分化为脂肪细胞。同时，对3T3-L1细胞的研究发现，强制表达MCPIP 1后，C/EBP转录因子家族、PPAR的表达增强28。这两项研究说明，MCPIP 1通过诱导基因的转录，进而调控某些细胞的分化。作为转录因子，能够诱导血管生成研究发现，MCPIP
31、 1的过表达会增强人胚胎血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的凋亡、增殖、迁移和血管生成相关基因的表达，进而导致血管生成。N-钙黏附分子（cadherin）在内皮细胞间黏着斑（桥粒，adherence junction）的形成中起重要作用29，它能够通过调控黏着斑的形成和内皮细胞的行为，进而导致血管形成30。对HUVEC细胞的研究发现，过表达MCPIP 1能诱导钙黏附分子基因cdh12和cdh19的表达以及血管生成。同时染色质免疫共沉淀实验证明，在体内钙黏素（cadherin，cdh）12和cdh19能够与MCPIP 1结合。
32、相反，cdh12或cdh19 knockdown后抑制了MCPIP 1的诱导血管生成作用，同时，MCPIP 1 knockdown后也抑制了MCP-1诱导的cdh12和cdh19的表达。这说明，MCP-1能够诱导MCPIP 1的生成，而作为转录因子的MCPIP 1能够通过激活血管生成相关基因（如cdh12和cdh19）的转录，进而诱导血管生成31。作为RNA酶，能够降解mRNA实验发现，MCPIP1具有降解炎症相关细胞因子如IL-2、IL-6、IL12p40、Calcr、IL-1的mRNA的作用，即它是一个RNA酶3, 4。在该基因敲除小鼠中，自身免疫病的发生大大提高4，说明这种降解功能在阻止自身免疫功能紊乱中发挥重要作用。基因敲除小鼠的巨噬细胞中，IL-6的mRNA半衰期大大延长。相反，过表达Zc3h12a极大地增强了IL-6的mRNA的降解。同时，研究发现，用siRN
