1、发酵降解牛骨粉产酸菌株的分离与初步鉴定发酵降解牛骨粉乳酸菌株的分离与初步鉴定作 者：夏再波指导老师：娄爱华（湖南农业大学食品科技学院2004级食品科学与工程三班，长沙 410128）摘 要：本实验采用MRS培养基，从土壤中自然降解半年的牛骨中分离乳酸菌，经过多次试验，反复分离纯化得到了5株乳酸菌，并根据它们的生理特性进行了初步的鉴定。经鉴定确定了两株乳杆菌属和三株链球菌属，然后将选出的菌种做骨粉发酵生产试验，并从中选出产量丰富的T7菌做生长曲线，以观察其生长情况，从而为工业化生产奠定基础。关键词：乳酸菌; 分离; 鉴定前 言骨组织在动物体中约占体重的2030，是一种营养价值非常高的肉类加工副产
2、品，它含有大量的蛋白质、脂质、矿物质等营养成分。尽管骨粉已在畜牧养殖生产中大量使用，但是由于对骨粉认识上的不足，动物骨头的浪费严重，骨粉的营养价值也未得到充分利用。面对我国的肉类加工产量逐年上升，抛弃的动物骨头越来越多的状况，如何合理加工和充分利用动物骨头成为十分重要的课题。骨粉中含有丰富的矿物质，最主要的是羟磷灰石晶体Ca10(PO4)6(OH)2 和无定型磷酸氢钙(CaHPO4 )，在其表面还吸附了Ca2+、Mg2+、Na+、Cl-、HCO3-、F-及柠檬酸根等离子。更为重要的是，骨粉中丰富的Ca和P是人体必需的常量矿物元素，而且它们的比例(Ca：P=2：1)是体内吸收钙磷的最佳比例。另外
3、，骨髓中含有大脑不可缺少的磷脂质、磷蛋白、胆碱还有加强皮层细胞代谢和防衰老的骨胶原、类粘朊、酸性粘多糖(即软骨素)、维生素等。这些营养组分特别有利于儿童的健康成长和老年人的滋补需要，还能满足高血压、骨折、骨质疏松、糖尿病、佝偻病、贫血等患者对食品的特殊需求。利用微生物的作用可以降解骨粉中的蛋白质、粘多糖，使部分钙从结合态游离出来。该法兼有酸解、酶解、生物转化的共同作用，是一种比较新而且效果好的方法。而要想利用微生物发酵法来提高钙的利用率，首先必须分离筛选出高产酸的乳酸菌菌株，并对其进行特性研究，进而探讨乳酸菌对骨粉中结合钙转化成游离钙的情况。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种来源：在土
4、壤中自然降解半年的牛骨 1.1.2 主要原料和培养基 牛骨骨粉：1#（50目），2#（80目），3#（120目）由长沙市马王堆蔬菜批发大市场提供。富集培养基：MRS培养基 MRS液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，K2HPO42g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，MgSO47H2O 0.58 g，MnSO40.25g，蒸馏水1000mL，pH 6.26.4，121 灭菌20min。(MRS固体培养基：在液体培养基的基础上添加1.8%的琼脂，半固体MRS培养基琼脂的添加量为0.8%)鉴别培养基： PY基础培养基, 葡萄糖和葡萄糖酸盐产酸产气培养基，
5、碳水化合物发酵产酸试验培养基，淀粉水解培养基，石蕊牛奶培养基，明胶液化试验培养基，乙酰甲基甲醇试验（V-P试验）培养基，H2S试验培养基，葡聚糖产生试验培养基（1）PY基础培养基:蛋白胨 0.5g，胰酶解洛蛋白0.5g，酵母提取物 1.0g，盐溶液 4.0ml，蒸馏水100ml，盐溶液成分：无水CaCl2 0.2g，MgSO47H2O 0.48g，K2HPO4 1.0g，KH2PO4 1.0g，NaHCO3 10.0g，NaCl 2.0g。方法：将CaCl2和MgSO47H2O混合溶解于300ml蒸馏水中，再加500ml水，一边搅拌一边缓慢加入其他盐类。继续搅拌直到全部溶解，加200mL蒸馏水
6、，混合后贮备于4。（2）葡萄糖产酸产气培养基 在PY基础培养基内加入30g葡萄糖和0.5ml的吐温80，再添加6g琼脂做成软琼脂柱，同时加入浓度为1.6g/100mL的溴甲酚紫1.4mL指示剂，分装试管，高度45cm。置于112灭菌2030min后备用。（3）碳水化合物发酵产酸试验 基础培养基：（NH4）HPO4 1.0g，KCl 0.2g，MgSO4 0.2g，酵母提取物 0.2g，琼脂 56g，蒸馏水 1L，浓度为0.04/100ml的溴百里酚蓝 20ml。添加各碳水化合物的量如下表1：培养基的基质数量g(ml)/100ml灭菌后PH值高压蒸汽灭菌时间/min乳糖1.0g6.915葡萄糖1
7、.0g6.915蔗糖1.0g6.915木糖1.0g6.715山梨醇1.0g6.915麦芽糖1.0g6.915鼠李糖1.0g6.915纤维二糖1.0g6.915甘露醇1.0g6.915（4）淀粉水解 淀粉培养基：蛋白胨 10.0g，氯化钠 5.0g，牛肉膏 5.0g，可溶性淀粉 2.0g，琼脂 1520g，水 1000mL。注：先用少量水将淀粉调成糊状，再加入到溶化好的培养基中，调整PH值至7.2，装入三角瓶，于121灭菌30min。 卢哥氏碘液：碘片 1g，KI 2g，蒸馏水 300ml。先用35ml蒸馏水溶解KI，再加入碘片，使碘全部溶解后，用水稀释至300ml，贮存于暗色瓶内备用。（5）石
8、蕊牛奶培养基：用离心机将新鲜牛奶分离，去除上层奶油，取下层脱脂牛奶。每100mL脱脂牛奶加入4mL浓度为25g/L的石蕊牛奶。分装试管，牛奶高度45cm。113高压蒸汽灭菌1520min。(6)明胶液化试验 基础培养基：蛋白胨 1g，酵母提取物 1.0g，葡萄糖 0.1g，盐溶液 4.0mL（与PY基础培养基同），明胶 12g，蒸馏水100.0mL。调pH至7.0。分装至试管中，于113115高压蒸汽灭菌1520min。(7) 乙酰甲基甲醇试验（V-P试验） 培养基：PY基础培养液。 试剂试剂A：-萘酚 5g，95%乙醇 100ml。试剂B：KOH 80g，肌酸 0.6g，蒸馏水 200ml。
9、(8)产H2S培养基FeC12穿刺法：牛肉膏 7.5g，蛋白胨 10g，NaC1 5g，明胶 5g，10FeCl2(培养基灭菌后无菌加入) 5ml，蒸馏水 1000ml，pH 7.0，ll2 灭菌20min。培养基灭菌后，在明胶尚未凝固时，加入新制备的过滤除菌的FeC12，用无菌试管分装培养基，高度为45cm，立即置于冷水中冷却凝固，供穿刺接种用(本实验用FeSO4代替FeC12)。 (9)葡聚糖的产生试验 培养基：胰胨 10.0g，K2HPO4 5.0g，酵母提取物 5.0g，柠檬酸二铵 5.0g，蔗糖 50.0g，琼脂 15g，于Ph7.0，121灭菌15min。(10)精氨酸水解试验 培
10、养基：蛋白胨 5g，肉浸膏 5g，葡萄糖 0.5g，吡哆醛 5mg，L-精氨酸 10g，蒸馏水 1000ml，1.6g/100ml溴甲酚紫乙醇溶液 0.625ml，甲酚红液(0.5g甲酚红溶于26.2ml的0.01mol/L NaOH中，再稀释至250ml) 2.5ml,pH为6.06.5，分装3ml/试管，121灭菌10min。(11)溶血反应 血琼脂培养基：胰酶解酪脘 10.0g，葡萄糖 1.0g，胃酶解动物组织 10.0g，酵母提取物 2.0g，NaCl 5.0g，NaHSO3 0.1g，马血 100ml(或脱纤维羊血 50ml)，pH为(7.00.2)。1.1.3 主要试剂分析试剂：盐
11、酸，醋酸，硫酸，NH4OH,(NH4)2C2O4,甲基红指示剂，NaOH，甲醛，高锰酸钾，蔗糖。1.1.4 主要实验仪器设备不锈钢手提式蒸汽灭菌锅:YXQSG46280S型,上海博迅实业有限医疗公司设备厂 电子分析天平：E02140型，瑞士生产冰箱:SJ-225WBJ ，SHARP高温蒸汽灭菌锅:上海医疗器械厂单人单面净化工作台:SW-CJ-IBu型,苏州净化设备有限公司数显鼓风干燥箱:101A-2型，上海实验仪器厂有限公司数显水浴恒温振荡器:华普达SHA-C型，常州市华普达教学仪器有限公司电热恒温培养箱:DNP-9162型,上海精宏实验设备有限公司高速中药粉碎机:ZN-400A型,长沙市岳麓
12、区中南制药机械厂高速电动离心机:YXJ-2型，常州市华普达教学仪器有限公司pHS-3C型精密pH计：722S型分光光度计：显微镜：磁力搅拌器：1.2 实验方法1.2.1 采样将在土壤中自然降解半年的牛骨放入富集培养基中在37恒温生化培养箱中培养三天。1.2.2 富集液中菌株的分离纯化用移液管吸取1mL富集菌液放入9mL/支的无菌生理盐水中进行稀释，逐次稀释至10-9，选择10-7、10-8、10-9三个稀释度，分别取这3种稀释液0.1mL接入MRS固体培养基平板。待稀释涂布后的菌落长出后用灭菌接种环挑取10-7、10-8、10-9三个稀释度长的优势菌落，进行比较后划线接种于MRS固体斜面培养基
13、。于37恒温培养箱中培养48h，挑取单个可疑菌落，反复划线，直至获得纯的菌株。1.2.3 菌落、菌体形态观察培养2448h后，菌生长旺盛，挑取单一菌落，涂片，革兰氏染色，在光学显微镜下观察菌体大小、形状、排列方式，并记录现象。菌落观察时从菌落大小、表面形状、隆起程度、边缘性状、菌落形状、表面光泽、菌落颜色，透明度等方面记录。确认为纯培养物后，划线接入MRS固体斜面培养基中于36生长好后，置4冰箱保藏备用。1.2.4 生理生化试验在MRS固体培养基观察菌落形态，挑取菌落相同数多的菌染色，镜检，通过菌落和菌体形态确定是否做生理生化试验。确定做生理生化反应的菌需接种于PY液体培养基中培养2436h，
14、进行生理生化试验的测定。1.2.5 乳酸茵分离株属的鉴定将分离到的革兰氏染色阳性，过氧化氢酶试验阴性的球菌，做温度试验(10和40条件下生长)、耐酸性pH值为4.3、耐碱性pH值为9.6、耐盐性(质量分数为6.5的NaC1和3 的NaC1)、葡萄糖产酸产气、碳水化合物发酵产酸试验、淀粉水解试验、石蕊牛奶试验、明胶液化、乙酰甲基甲醇试验（V-P试验）、硫化氢的产生试验、葡聚糖的产生试验、精氨酸水解试验、溶血反应。1.2.5.1 温度实验将分离纯化的菌种接到PY斜面培养基上，分别置于10和40恒温培养箱中培养2d，观察其生长结果。1.2.5.2 pH特性试验将分离纯化的菌种分别接到pH 4.3和p
15、H 9.6的PY斜面培养基上，置于适温培养2d，观察其生长结果。1.2.5.3 耐盐性试验将分离纯化的菌种分别接到添加了NaC1 6.5和NaC1 3的PY斜面培养基上，置于适温培养2d，观察其生长结果。1.2.5.4 过氧化氢酶测定 将试验菌接种于PYG琼脂斜面上，适温培养1824h后，观察结果。结果观察方法：取一环生长于PYG琼脂斜面的培养物，涂于干净的载玻片上，然后在其上加一滴3%15%H2O2，若有气泡产生则为阳性反应，无气泡为阴性反应。、1.2.5.5 从葡萄糖产酸产气试验用较大量的新鲜活力强的菌种进行穿刺接种，置于适温培养。培养基中指示剂变黄表示产酸，软琼脂柱内产生气泡或出现将2%
16、琼脂层向上顶的现象，表示产气。1.2.5.6 碳水化合物发酵产酸试验依据不同的试验菌分别选择使用表1中的培养基，经接种适温培养后观察试验菌产酸的结果。本实验使用BTB-MR试剂来检测产酸结果，试剂配方：溴百里酚蓝(BTB) 0.2g，甲基红(MR) 0.1g，95%乙醇 300ml，蒸馏水 200ml。由试剂的显色差异可指示产酸程度：指示范围颜色pH值5.5以下红色pH值5.66.0淡红pH值6.06.3黄色pH值6.37.2淡绿色比色时以未加碳水化合物的PY培养基中的培养液作对照。1.2.5.7 淀粉水解试验将灭菌后的可溶性淀粉的琼脂培养基倒成平板，取新鲜菌种点种，适温培养生成明显菌落后，在
17、平板上滴加碘液，平板呈蓝黑色，生长的菌落四周不显色，表示淀粉水解阳性反应，否则为阴性结果。1.2.5.8 石蕊牛奶试验将新鲜菌种接种于已灭菌的石蕊牛奶培养基中，置适温培养，培养13d即可观察石蕊牛奶产酸和凝固反应。石蕊在中性时呈紫色，乳酸细菌发酵乳糖产酸，石蕊变红，当酸度很高时，可使牛奶凝固。1.2.5.9 明胶液化试验将乳酸菌种接种后置于适温培养，在培养时用两支未接种的试管培养基作对照。将已接种培养和未接种的对照试管置于冰箱或冷水中，待对照管凝固，记录结果，或待接种管和对照管置于低温均凝固后再取出，比较其液化情况，观察对比反复多次。如对照管凝固时，接种管液化为阳性反应，同时凝固或液化为阴性结
18、果。1.2.5.10 乙酰甲基甲醇试验（V-P试验）取1ml生长2d的培养物，在其中加入0.6ml试剂A和0.2ml试剂B，置于不加盖的试管中混合，并陆续振摇30min，显示红色为阳性反应。1.2.5.11 硫化氢的产生试验 将菌种采用穿刺的方法接种到培养基中，置于适温培养2d。如出现黑色产物，表明产生了硫化氢，为阳性反应。1.2.5.12 葡聚糖的产生试验将菌种接种于培养基斜面上，适温培养24d，如斜面培养物形成粘稠状菌苔，表明产生葡聚糖，为阳性反应，否则为阴性结果。1.2.5.13 精氨酸水解试验接种12滴培养过夜的菌液在上述培养基内，并在其上层加盖无菌的石蜡矿物油，放置在35下，培养72
19、h。接种和培养的试管培养基转变为黄色，指示葡萄糖产酸，为阴性反应；培养基内pH指示剂显示紫色，表示精氨酸经细菌酶水解，释放有碱性产物，是阳性反应。1.2.5.14 溶血反应 用接种的金属环取试验菌苔穿刺接种于含血的琼脂平板内，造成一无氧的微环境，使试验菌在其中生长和起反应，将含血平板置于适温培养。观察溶血反应的特征，确定属于-溶血、-溶血或-溶血。-溶血的特征是完全溶解红色细胞。-溶血是部分溶解红色细胞，仍保留一些完整的细胞，如用肉眼观察，在培养的生长物周围的琼脂显示带绿色。对溶血无作用或不溶血的反应称为-溶血。1.2.6 分离菌株在不同温度下的生长情况 选取30、33、36、39、42五个温
20、度进行测定。1.2.7 分离菌株生长情况、产酸能力检验和生长曲线的绘制将分离的菌株吸取0.05mL接入10mL/支的MRS液体培养基中，共30支，放入41-43的恒温生化培养箱中进行培养，每隔3h抽取3支进行OD值和pH值的测定，同时将菌液稀释后接入MRS固体培养基的平皿内，培养36h，计数。连续测定10次，绘出菌株在30h内的生长曲线。1.2.9 乳酸菌发酵骨粉方法将选取的菌种以3%的比例在无菌条件下接种于种子液内，于40.5温箱内培养24小时，然后把培养好的种子液接种于发酵液中（其发酵条件根据以下生产条件优化水平而定），于40.5温箱内培养24h，36h和48h后，依次进行离子钙含量和游离
21、氨基酸含量的测定。1.2.10测定记录与方法（1）离子钙含量的测定 先标定：准确称取在130烘干30分钟的Na2C2O4基准试剂0.15-0.20g 3份（精确至0.0001g），分别置于250ml三角瓶中，加水40ml溶解，加入10ml2mol/L硫酸溶液，加热至70-80，用待标定的KMnO4溶液滴定至微红色出现半分钟不褪色为终点，记录用KMnO4溶液ml数V。计算：cKMnO4 =式中：m草酸钠重量，g; 134草酸钠的摩尔质量，g/mol; 2/5滴定时草酸钠与高锰酸钾反应的质量比值测定：准确吸取样液5ml（含钙110mg）移入15ml离心管中，加入甲基红指示剂1滴，4%草酸铵溶液2m
22、l，14醋酸溶液0.5ml,振摇均匀，用14氢氧化铵溶液调样液至微蓝色，再用醋酸溶液调至微红色，放置1小时，使沉淀完全析出，离心15分钟，小心倾出上清液，倾斜离心管并用滤纸吸干管口溶液，向离心管中加入少量2%NH4OH，用手指弹动离心管，使沉淀松动，再加入约10ml2%NH4OH，离心20分钟，用胶帽吸管吸去上清液。往沉淀中加入2ml2mol/L硫酸，摇匀，置于7080水浴中加热可，使沉淀全部溶解，用0.02mol/L高锰酸钾标准溶液滴定至微红色30秒不褪为终点。记录高锰酸钾标准溶液消耗量。计算：钙(mg/100g)= 式中：cKMnO4 溶液浓度，mol/L； VKMnO4溶液耗用体积，ml
23、； V1用于测定的样液体积，ml； V2样液定容总体积，ml； m样品重量，g； 40.08钙的摩尔质量，g/mol（2）游离氨基酸含量的测定 移取含氨基酸约20mg的样品溶液于100ml容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0ml置于200ml烧杯中，加水60ml，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示Ph8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液ml数，供计算总酸含量。加入10.0ml甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液ml数。同时取80ml蒸馏水置于另一200ml洁净烧杯中，先用氢氧化钠标准溶液调至pH8.2（此时不计
24、碱消耗量），再加入10.0ml中性甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，作为试剂空白试验。计算结果：氨基酸态氮（）式中：V1样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点（pH9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，ml； V2空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，ml； c氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L； m测定用样品溶液相当于样品的质量，g； 0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol.2 结果与分析21 分离菌的形态特征及特性本实验采用MRS培养基，从土壤中自然降解半年的牛骨中分离乳酸菌，经过多次试验，反复分离纯化得到的菌株菌体特征和菌落特征如表1所示。表1
25、 分离菌的形态特征代号菌落菌体形态K5菌落较大，圆形，长于中间，菌落表面光滑，不透明，淡乳白色，边缘整齐光滑。圆形球菌，2个居多，4个相连或单个存在，无芽孢。K6菌落较小，竖直长于培养基中间，椭圆形，两头有点尖，菌落表面光滑，不透明，中间淡乳白色，边缘相对透明。短杆菌，2个或3个相连，无芽孢。T2菌落较小，圆形，长于培养基中间，菌落表面光滑，乳白色，不透明。短且较粗杆菌，2，3，4个连接或成堆存在，无芽孢。T5菌落小，圆形，斜长于培养基中间，菌落中间凸起，边缘整齐光滑，乳白色，不透明。椭圆形球菌，单个存在或成堆存在，无芽孢。T7菌落中等，椭圆形，长于培养基中间，中间凸起，边缘整齐光滑，乳白色，
26、不透明。细小球菌，2，4个连接或成堆存在，无芽孢。22 5株乳酸菌的鉴定试验由于乳酸菌在生产中的重要作用，鉴定这些微生物就具有重要科学意义和实践意义。用于乳酸菌鉴定的生理学和生物化学标准经常很模糊，因为大多数细菌都有非常相似的营养要求和相似的生长环境。本研究根据乳酸细菌分类鉴定及实验方法对分离出的5株菌的形态、生理生化特性等方面进行初步鉴定。表2 5株乳酸菌的主要生化特性 菌株特性K5K6T2T5T7菌体形态圆形球菌短杆菌短杆菌椭圆球菌细小球菌过氧化氢酶试验-耐盐性4%NaCl-+-+耐盐性6.5%NaCl+-+发育温度10-耐酸性pH 4.3 -+-耐碱性pH 9.6+-+发育温度45+-+
27、-+葡萄糖产酸产气+硫化氢产生 -石蕊牛奶+明胶液化-V-P试验-葡聚糖产生+-淀粉水解-+-溶血反应糖类发酵结果葡萄糖+蔗糖+鼠李糖-+纤维二糖+甘露醇-+木糖+山梨醇-+麦芽糖+乳糖+ 根据表中各菌株的表型特征和生理生化特征，参照乳酸细菌分类鉴定及实验方法，初步鉴定T2、K6为乳杆菌属，K5、T5、T7为链球菌属。 23 不同温度下5菌株生长情况试验将5菌株在30、33、36、39、42等不同温度下培养48h，同时测定其OD值和pH值。其测定结果如图1、图2所示： 图1 不同温度下各菌株的OD值 图2 不同温度下个菌株的pH值由图3、图4可知，各菌株在3639之间的OD值均达到最大值，并在
28、此温度之间pH值均达到最小值，表明各菌株在此温度之间生长能达到最大活力，故可推断各菌株的最适温度为37。24 5株乳酸菌发酵降解骨粉情况本实验根据胡子骥的毕业论文乳酸菌发酵骨粉工艺条件的研究中所得出的最佳生产条件，即蔗添加量5%,乳酸菌接种量3%,骨粉粒度120目,接种骨粉浓度20%，发酵时间48h。将5株乳酸菌分别接种到发酵液，培养48h后测定离子钙含量和游离氨基酸含量，结果如图3、图4所示：图3 不同菌株发酵骨粉所测得的氨基酸态氮的含量 图4 不同菌株发酵骨粉所测得的离子钙的含量根据图3、图4可以看出，不同菌种发酵产生的离子钙含量和氨基酸态氮含量均不高，仅T7菌株生成的含量略高些，离子钙含
29、量为11.5617 mg/100mL，氨基酸态氮含量为0.0651 %，表明分离纯化的菌株发酵能力不够强，可能由于工艺参数不是各菌株的最佳生产工艺，由于时间比较紧，本实验未做正交试验。 25 T7乳酸菌生长曲线的绘制鉴于T7发酵骨粉实验产生的离子钙含量和氨基酸含量最丰富，故进一步了解 T7菌株在MRS培养基中的生长规律，从而确定其菌落数增长的最大值，同时进行生长曲线的绘制。本实验在T7菌株培养过程中每隔3h用改良稀释平板计数法测定一次活菌数，同时测定培养液中的pH值及OD值，其结果见表3:表3 乳酸菌生长相关数值pH值OD值菌落总数(1010cfu/ml)0h3h6h9h12h15h18h21h24h27h30h7.157.075.724.964.764.624.584.484.534.454.4200.0660.2040.4310.4570.4880.4910.4600.4780.4820.41100.004732.586.846.926.876.546.405.263.411.81根据以上数据
