1、河南省自然科学基金项目丝瓜核糖体失活蛋白基因的分离克隆及表达研究申报号项目类别A学科名称分子生物学学科代码180.37河南省自然科学基金项目申请书项目名称： 丝瓜核糖体失活蛋白基因 的分离、克隆及表达研究 申 请 者： 所在单位（签章）： 主管部门： 河南省教育厅 联系电话： 电子信箱： 通讯地址： 邮政编码： 申请日期： 2004 年 8 月 20 日河南省科学技术厅制填 报 说 明 1、“申请书”用于申请河南省自然科学基金项目，由申请者负责填写。填写前请先查阅有关河南省自然科学基金项目申请办法及规定。申请书各项内容，要逐条认真填写，表达要明确、严谨，实事求是。外来语要同时用原文和中文表达，
2、第一次出现的缩写词，须注明全称。 2、封面右上角“申报号”按照河南省科学技术厅分配的编号填写；“项目类别”栏由申请者填写, 申请项目属基础研究的此栏为“A”,属应用基础研究的为“B”。“学科名称”及“学科代码”请根据申报项目所属学科，按最新国家标准“学科分类与代码表”，填至三级学科分支。 3、基础研究是指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动；应用基础研究是指有广泛应用前景，但以获取新原理、新知识、新方法为主要目的的研究；“项目名称”应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字（包括标点符号）；“申请者”是指申请项目实际主持人。 4、在读（含在职）研究生和申请单位的
3、兼职科研人员不得作为申请者提出申请，但可作为项目组成员参加研究。 5、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请（含参加）的项目数，连同在研的省级以上科学基金项目数, 不得超过两项。同一项目组研究内容相近的项目，只允许报送一个项目。 6、不具有副高以上专业技术职务或硕士以上学位的申请者，须有两名具有正高专业技术职务的同行专家推荐。简表项目概况项目名称丝瓜核糖体失活蛋白基因的分离、克隆及表达研究申报学科名称1分子生物学代码1 180.37名称2基因工程代码2 180.7110起止年限 2005 年 1 月 至 2007. 年 12 月项目主要成员姓名性别年龄学位职称（职务）现工作单位项目
4、主要研究内容和目标本课题研究采用异硫氰酸胍一步法从未成熟丝瓜籽中提取核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein RIP)的总RNA， 逆转录合成cDNA， 并根据cDNA序列设计合成PCR引物，用RT-PCR方法克隆RIP的基因(luffin-a、luffin-b和luffin-s)序列，通过和载体质粒的连接构建核糖体失活蛋白基因的表达载体并在大肠杆菌中进行表达，然后对表达产物进行鉴定。为进一步开展转基因植物，提高植株的抗虫和抗病能力的RIP基因工程和蛋白质工程的研究提供实验参考。推荐意见（说明项目的意义和取得预期结果的可能性。申请者的业务素质及研究能力、现有工
5、作条件等、项目组成员不得作推荐人）推荐人（签章） 专业技术职务 专长工作单位推荐人（签章） 专业技术职务 专长工作单位一、本研究项目的立项依据和目标1、本项目研究的意义及同类研究工作国内外研究现状与存在的问题，并列出主要参考文献： 核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein RIP)是一类广泛存在于高等植物细胞中的能专门作用于真核细胞，抑制核糖体功能的毒蛋白。它具有RNA N糖苷酶，能够对核糖体大亚基上的rRNA进行脱腺嘌呤作用，从而破坏核糖体结构和功能，抑制蛋白质的生物合成。核糖体失活蛋白分两类：型RIP（单链）和型RIP（双链）。目前大量研究表明,RIP除了
6、直接抑制蛋白质生物合成外，还具有抗生育、抑制肿瘤细胞生长、抗艾滋病病毒等诸多生物活性，同时又能作为免疫导向药物，是最有希望的专一性抗癌药物。近年，人们发现核糖体失活蛋白具有多核苷酸：腺苷糖苷酶活性，进一步解释了它作为防御蛋白的生物功能。RIP在理论研究和实际应用中都具有重要的意义。理论上RIP对核糖体的作用可以作为研究蛋白质与核酸相互作用的模型；应用上，以RIP为“弹头”的免疫毒素在肿瘤和自身免役疾病的治疗研究中已取得了很好的效果，展现出巨大的药用前景；同时RIP在动植物抗病毒等方面也有潜在的应用前景，RIP抗寄生虫和真菌病害的效果优于以前广泛使用的苏云金毒素和蛋白酶制剂。因此，分离RIP基因
7、并构建基因表达载体，用于转基因植物，以提高植株的抗虫和抗病能力将是今后研究的热点之一。现在国际上已经开展了RIP基因工程和蛋白质工程的研究，我国RIP基因工程的研究也已启动，目前，有报道大麦RIP基因已成功地在烟草中得到了表达。 核糖体失活蛋白存在于很多植物中，其中葫芦科植物中含有丰富的RIP。目前已发现来源于葫芦科及其他科的RIP同样也具有抗肿瘤、抗HIV的活性。Luffin是存在于丝瓜（Luffa cylindrica）籽中的一组单链RIP，包括 luffin-a、luffin-b和luffin-s。其中luffin-a、luffin-b是迄今报道的毒性最强的核糖体失活蛋白，很有可能成为肿
8、瘤导向药物的高效“弹头”，具有很好的开发应用前景。同时丝瓜是我区农村广泛种植的经济作物，植物资源丰富，生殖期长，结实率高，产量高，且种植条件要求不严格，进一步开发的成本较低，有很高的经济价值。我们已完成了丝瓜核糖体失活蛋白的分离提纯及特性研究，为进一步研究RIP基因的克隆和表达打下了一定的基础。 参考文献:1. 严明,杨欣秀等,丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin-b的基因克隆及表达 生物化学与生物物理学报 2001,33(2):205-2092. 林毅,绞股蓝核糖体失活蛋白的分离克隆与表达 分子植物育种 2003,1(5/6):795-7613. 林俊凯,陈明晃等,八棱丝瓜籽核糖体失活蛋白的分离
9、纯化及其生化性质 中国生物化学与分子生物学学报 2002,18(5):609-613 4. Au T K,Collins R A,Lam T L, The plant ribosome inactivating proteins.FEBS Lett. 2000,471(2-3):169-172 5. zhang R P, Xiong C Y, Yan M, In vitro inhibition of human Melanoma Cells by In munotoxin luffin B-Ng76 Acta Biochimica et Biopltysica,1998,30(6):561-
10、5646.孟延发等,苦瓜籽核糖体失活蛋白的基本性质 兰州大学学报 2000,36(4):79-877.Barbieri L,Battelli M G, Stirpe F, Ribosome-inactivating proteins from plants. Biohem Biopltys Acta, 1993,1154:237-2828. 傅明辉,田洁,苦瓜籽核糖体失活蛋白的分离纯化及抗氧化活性研究 中国生物药学杂志 2002,23(3):134-136 9. 李向东,刘望夷, 核糖体失活蛋白的结构功能与分布 细胞生物学杂志 1997,19(2): 69-75,2、本项目研究目标、内容和拟采
11、取的研究方法： 研究目标: 利用分子生物学技术,分离克隆核糖体失活蛋白基因,构建核糖体失活蛋白基因(luffin-a、luffin-b和luffin-s)的表达载体并在大肠杆菌中表达。 研究内容:1.丝瓜籽核糖体失活蛋白总RNA的提取. 2.cDNA 的合成 3. 设计合成PCR引物分子 4. 克隆核糖体失活蛋白基因序列5. 构建(luffin-a、luffin-b和luffin-s)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达6. 核糖体失活蛋白表达产物的鉴定 研究方法: 1. 总RNA的提取- 采用异硫氰酸胍法,从未成熟丝瓜籽中获得. 2. cDNA合成- 以RNA为模板逆转录合成 3. PCR引物合
12、成- 根据cDNA序列设计合成PCR引物4. RIP基因的克隆-采用RT-PCR方法 5. 表达载体构建-通过和载体质粒的连接构建核糖体失活蛋白基因的表达载体并在大肠杆菌中进行表达6. 表达产物鉴定-采用糖苷酶活性和蛋白质合成抑制活性测定法3、研究工作的预期结果或目标及提供形式。如系理论成果，应写明在理论上解决哪些问题及科学意义；如系应用性成果或基础性资料，应写明其应用前景： 虫害和真菌病是影响作物减产是主要原因, 而植物界存在着大量能杀虫和抑制真菌生长的毒蛋白,核糖体失活蛋白就是其一,利用基因工程技术,使其在经济作物中高效表达,筛选具有抗性的转基因植株,正日益成为植物抗虫害和真菌病的新途径。
13、 这不仅可以克服育种周期长,抗性种质缺乏的弊端,更避免了农药使用带来的环境污染,具有广阔的应用前景。RIP抗寄生虫和真菌病害的效果优于以前广泛使用的苏云金毒素和蛋白酶制剂，在动植物抗病毒等方面也有潜在的应用前景。因此，分离RIP基因并构建基因表达载体，用于转基因植物，以提高植株的抗虫和抗病能力必将是今后研究的热点。葫芦科植物中RIP含量丰富, 存在于丝瓜籽中的一组单链RIP，包括 luffin-a、luffin-b和luffin-s 是迄今报道的毒性最强的RIP，且丝瓜是我市农村广泛种植的经济作物，生殖期长，结实率高，产量高，且种植条件要求不严格，进一步开发的成本较低,具有很好的开发应用前景。
14、 成果提供形式：研究报告和研究论文23篇。二、研究方法和技术路线1、拟采取的理论分析、计算、实验方法和步骤及其可行性：总RNA提取 异硫氰酸胍一步法从未成熟的丝瓜籽中抽提总RNA cDNA合成以总RNA为模板逆转录合成cDNALuffin基因的扩增（ RT-PCR ） 预变性：94，5 min 扩增：94变性30s，50退火30s，72延伸45s ，30个循环 （最后循环72，10 min），PCR反应产物用2%琼脂糖电泳鉴定Luffin基因表达载体的构建 质粒抽提，酶切，电泳鉴定，DNA片段回收， 连接反应， 大肠杆菌转化 重组Luffin基因的表达表达产物的检测表达产物活性的检测2、研究工
15、作的整体安排： 2005年1月-2005年11月 1. 总RNA提取 2. cDNA合成 2006年12月-2006年12月 3. Luffin基因的扩增， 4. Luffin基因表达载体的构建 5. DNA测序 2007年1月-2007年12月 6. 重组Luffin基因的表达 （表达产物的检测、表达产物活性的检测）三、实现本项目预期目标已具备的条件1、与本项目有关的工作基础及实现本项研究已有的主要仪器设备；尚缺的仪器设备及解决途径。 课题组成员专业结构合理，既有长期从事生化和分子生物学研究的专业人才，又有实践经验丰富的微生物学研究人员；课题组负责人长期从事生物化学及分子生物学教学和科研工作
16、，熟悉和精通各种生化技术手段，课题组成员已完成省教育厅自然科学基础研究项目“丝瓜核糖体失活蛋白在种子成熟时的动态变化与特性”的研究，已发表相关研究论文4篇,有一定的前期研究基础，具有承担并完成课题的能力。 现有高速冷冻离心机，紫外分光光度计，电泳仪，凝胶成像分析系统 PCR仪，低温冰柜，微量移液器，颗粒制冰机,超净工作台,生化培养箱等，实验仪器设备精良，各种测试手段完善，基本可满足项目研究需要。2、申请者和项目组主要成员的主要学历和研究工作简历，近期发表的与本项目有关的主要论著和科研成果名称及获奖情况四、申请者正在承担的其他研究项目攀登计划、863、攻关任务和各部委、省市任务等项目的名称及编号
17、、任务来源、起止年月、负责或参加以及与本申请项目的关系情况：申请者负责的在研项目：黄伞多糖分离提纯条件的优化和性质研究五、申请者承担（负责或参加）省级以上科学基金资助项目的情况项目编号项目名称起止时间负责或参加项目进展 1999180024丝瓜核糖体失活蛋白在种子成熟过程中的动态变化与特性” 1999.8-2002.5负责已结题六、申请项目经费预算（单位：万元）申请资助经费其他经费来源总 额2005-2006年2007年总 额年年431预算支出科目金额（万元）计算根据及理由1、仪器设备费2、实验材料费2.0实验用品和实验耗材等费用3、科研业务费0.5资料费、打印费及论文发表版面费4、实验室改装
18、费0.5实验室改造及空调购置5、协作费0.5部分成分测试费6、管理费0.5七、申请者所在单位审查意见（对本项目的可行性、特色和创新之处、申请和项目组主要成员的素质与水平等签署具体意见）经审核，以上内容填写真实，课题设计科学合理，论证充分，研究思路和方法清晰可行。课题组成员结构合理，力量雄厚，主持参加过大型科研项目多项，并已开展了前期工作，具有前期研究成果，能在规定周期内完成研究内容。我院保证为该课题组的研究工作提供便利条件和必需的配套资金，并担保本项目按期完成。经学校研究同意申报。 （签 章） 年 月 日八、申请者主管单位审查意见（签署经费预算是否合理，有无其他经费来源能否保证研究计划实施所需的人力、物力、工作时间等基本条件的具体意见） （签 章） 年 月 日
