1、食品微生物检验实 习 报 告实习名称 食品微生物检验课程实习 系 别 生物与化学工程系 年级专业 09级食品质量与安全 学生姓名 指导老师 王瑶琼 邵 阳 学 院2012年 1 月 2 日人们常说，“理论要联系实际”，这次，在学校指导老师的带领下，我们又有一次机会深入到细节中去学习，并在实践中体会理论的应用。虽然说只历经了短短的两周，但是却给我们带来了很多启示。总的来说，这次食品微生物课程检验实习，我们收获颇多，受益匪浅。食品微生物检验实习是食品质量与安全专业、食品科学与工程专业的核心课程，学习过程以实验教学贯穿始终，重点培养我们的实际动手能力，是不可缺少的实践性学习环节。通过三周实习，我们掌
2、握了培养基的配制、包扎及灭菌；正确采集样品并对样品进行稀释、样品滴加、培养；菌落观察、鉴定与计数；数据处理、分析等方面内容，并通过自主设计实验方案，是我们的知识、能力、素质形成综合的培养。为我们今后从事各种与食品质量与安全专业、食品科学与工程专业相关的工作打下坚实的基础。一、实验时间与地点时间：12月15日12月31日地点：三栋教学楼104室二、 实习过程概述12.15上午举行动员大会12.16至12.18查找资料并设计实验方案。12.19上午提交实验方案并通过了，再去领实验器材，下午做预备实验，并配制LB、PDA培养基，灭菌，晚上倒平板，做无菌检查。12.20 样品中细菌和霉菌的检测进行十倍
3、稀释、接种12.21 细菌菌落的观察及计数，配制LB、孟加拉红、乳糖发酵培养基，灭菌，倒平板，十倍稀释，接种。12.22 观察乳糖发酵试验以及观察细菌菌落和计数，配制EMB培养基，接种。12.23 观察霉菌菌落和计数12.25 观察酵母菌落和数，EMB纯化培养12.26观察大肠菌群的菌落12.27-12.31数据的处理分析，完成实习报告。三、实习内容油豆腐中细菌含量的测定：一、实验材料1、电热恒温培养箱、冰箱、托盘天平、电磁炉、吸管、广口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、试管、试管架、精灯酒、研钵、剪刀、灭菌镊子、75%酒精棉球、玻璃蜡笔、登记薄2、培养基和试剂：75%乙醇、生理盐水、1molL氢氧化
4、钠溶液、LB培养基、检验方法2、检样稀释及培养（1）以无菌操作，将检样油豆腐25g剪碎、研磨以后，放于盛有225ml无菌水的三角0瓶内，并在三角瓶中放入玻璃珠，经充分振摇做成1：10的均匀稀释液。（2）用1ml无菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁缓慢注入含有9ml无菌水的无菌试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成1：100的匀液。（3）另取1ml的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。（4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移
5、1ml稀释液于无菌培养皿内，每个稀释度作三个培养皿。（5）稀释液移入培养皿后，应及时用L型玻棒在培养基表面将样品均匀涂布。（6）等琼脂凝固后，翻转培养皿，置（361）恒温箱内培养24h取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1g样品所含菌落总数。二、菌落计算方法（1）菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。（2）菌落计数的报告平板菌落数的选择选取菌落数在30100之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用三个平板，应采用三个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生
6、长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，可视为一个菌落数；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。稀释度的选择 应选择平均菌落数在30100之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度平均菌落数均大于100，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。若所有稀释度的平均菌落数均不在3
7、0100之间，其中一部分大于100或小于30时，则以最接近30或100的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。实验具体流程如下：下表为实验时记录的绿豆糕中细菌的含量数据：样品中细菌的含量稀 释 度 10-2 10-3 10-4 平板一 72 9 无 平板二 81 11 1 平板三 105 21 无 平均菌数（个/g） 3.44104 5.4104 1.3104 注：每个平板加入1ml的稀释液其中，细菌菌落全为白色。二、油豆腐中霉菌和酵母菌含量的测定1、 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 1.1 冰箱：2 5 。 1.2 恒温培养箱： 2528 。 1.3 电子天平：感
8、量 0.1 g。 1.4 无菌锥形瓶:容量 500 mL、250 mL。 1.5 无菌广口瓶：500 mL。 1.6 无菌吸管：1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)。 1.7 无菌平皿：直径 90 mm。 1.8 无菌试管: 10 mm75 mm。 2、 检验程序 3 操作步骤 3.1 样品的稀释 3.1.1 样品预处理：以无菌操作，将检样油豆腐25g剪碎、研磨以后，放于盛有225ml无菌水的三角瓶内，并在三角瓶中放入玻璃珠，经充分振摇做成1：10的均匀稀释液。3.1.2 取1 mL 1:10稀释液注入含有9 mL无菌水的试管中, 另换一支1 mL无菌吸管
9、反复吹吸,此液为1:100 稀释液。 3.1.3 按 3.1.2操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1次 1 mL 无菌吸管。 3.1.4 根据对样品污染状况的估计，选择3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行 10 倍递增稀释的同时， 每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀液于 3 个无菌平皿内。 同时分别取 1 mL样品稀释液加入 1 个无菌平皿作空白对照。 3.1.5 及时将 15 mL20 mL 冷却至 46 的PDA或孟加拉红培养基(可放置于461恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。4 结果与报告 4.1 计算两个平板菌落数的
10、平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。 4.1.2 若所有平板上菌落数均大于 150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 4.1.3 若所有平板上菌落数均小于 10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 4.1.4 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于 1计数。 4.2 报告 4.2.1 菌落数在 100 以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。 4.2.2 菌落数大于或等于 100 时，前 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数字
11、，后面用0 代替位数来表示结果；也可用 10 的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。 4.2.3 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。A.1 PDA培养基A.1.1 成分 马铃薯(去皮切块) 150 g 葡萄糖 10.0 g 琼脂 10.0 g 氯霉素 0.05 g 蒸馏水 1000 mL A.1.2 制法 将马铃薯去皮切块， 加 1000mL 蒸馏水， 煮沸 20 min。 用纱布过滤， 补加蒸馏水至 1000 mL。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装后，121.1 灭菌 20 min。倾注平板前
12、，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中，并加入抗生素抑制细菌的生长。油豆腐中酵母菌检验的流程：油豆腐中霉菌的检验流程：下表为实验时记录的绿豆糕中霉菌酵母菌的含量数据：样品中酵母菌的含量稀 释 度 10-1 10-2 10-3 平板一 58 13 2 平板二 37 7 无 平板三 62 9 无 平均菌数（个/g） 4.2102 7.7102 5.3102 注：每个平板加入0.5ml的稀释液酵母菌菌落呈白色，且表面很潮湿。 样品中霉菌的含量稀 释 度 10-2 10-3 10-4 平板一 12 2 无 平板二 23 3 无 平板三 17 6 无 平均菌数（个/g） 3.4103 7.3103 / 注：
13、每个平板加入1ml的稀释液霉菌菌落有菌丝，菌落较大，有白色、黄色、黑色的菌落。三、油豆腐中大肠菌群的测定大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱：361。 1.2 冰箱:04。 1.3 恒温水浴 :44.50.5。 1.4 天平。 1.5 乳钵。 1.6 试管。 1.7吸管。 1.8 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.9 玻璃珠:直径约5mm。
14、1.10 酒精灯。 1.11 试管架。 2 培养基和试剂 2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。 2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。 2.5 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。 3 操作步骤 3.1 检样稀释 以无菌操作将检样25 g放于有225mL无菌水的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠),经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。3.2 乳糖发酵试验 分别取1ml1:10的均匀稀释液于9个乳糖
15、胆盐发酵管内，置361 温箱内,培养242h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。 3.3 分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置361 温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。 3.4 证实试验 在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置 361温箱内培养242h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。 3.5 报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。 4
16、大肠菌群 4.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见3.2条)转种于EC肉汤管内,置44.50.2水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养242h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置 培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。 4.2 结果报告 下表为实验时记录的油豆腐中大肠菌群的含量数据：1. 乳糖发酵罐现象 9只试管中有一支产生气泡，所有的试管都由蓝色变成黄色。注:每只试管加入1ml稀释液，产气的现象为杜氏小管中有气泡产生，产酸的现象为培养基颜色由蓝色变为黄色。
17、2.EMB平板分离现象注：每个平板加入1ml平板现象镜检结果(革兰氏染色)乳糖复发酵结果试管二有金属光泽的深色菌落革兰氏阴性短杆菌产酸,产气试管二稀释10倍有金属光泽的深色菌落革兰氏阴性短杆菌产酸,产气试管三 有金属光泽的深色菌落革兰氏阴性短杆菌产酸,产气试管三稀释10倍有金属光泽的深色菌落 革兰氏阴性短杆菌 产酸,产气试验结论:油豆腐中检测出无大肠菌群。四、实验经验与心得总结一、微生物实习过程中心得体会:1、实习中我们需要树立安全第一的思想，服从领导，尊重指导教师，认真学习，勤于思考！2、在实习过程中应充分考虑到所处环境与设备的条件，适当更改实验方案，使实验更加合理可靠！3、在实习过程中，我
18、们应充分考虑到平板涂布时所加入的稀释液的量，太少会使菌落数过少，不利于计数；太多则会导致倒置培养的不便，并会是菌落数过多。还有就是要考虑好稀释度的问题，不同的样品不可相同，稀释度过高，会导致菌落数过少，稀释度过低则会导致菌落数过多，不利于计数，也容易导致误差，所以，在这两个方面，是需要我们重点考虑的！4、在实验过程中，我们要注意灭菌和无菌操作的重要性，尽量避免杂菌污染，导致实验误差！5、每次实验结束时，都需要整理好自己所负责的台面卫生，确保实验室的安全整洁。6、涂布的时候要均匀，不然菌落生长不均匀。7、样品预处理时一定要处理的妥当。二、试验中存在的不足与建议：1、实验室的样品试剂需好好保存，每
19、次用完后都需盖好放回原处好好保存，防止变质。2、在做细菌的实验时，我们组做了两次，第一次是因为涂布不均匀，导致菌落只有一处生长，计数无法进行，于是我们将这个实验都重新做了一遍，在做实验时，应该充分考虑到样品的特性，从而设计出合理的实验方案。3、在做大肠菌群的测定时，杜氏小管需用注射器注满培养基，再倒置后缓缓放入试管中，切忌不可垂直丢入，这样很可能会导致试管破裂，杜氏小管注射培养基时，需注满，不然，放入试管后会导致小管内出现气泡，影响实验结果！总的来说，这次的微生物课程实习，让我学到了很多，比如说怎样设计实验方案以及团队精神的重要性、操作时操作技术日渐成熟等等，而且，这次的课程实习，让我对自己的
20、实验动手能力有了一个新的认识和提高，能更深刻的认识到自己实验过程中不足的一方面，让自己在日后的学习中能更好地运用操作实验，对自己日后的发展打下了坚实的基础！五、课后思考题1、用滤膜法检测大肠菌群有什么优点？答：（1）与直接法比较可以检测大量的样品。（2）浓缩效应使微生物的检测结果提高。（3）带有菌落的滤膜可作为检测的永久记录存档。（4）可见的菌落与样品量直接对应，得出定量结果。2、检查豆制品中的大肠菌群有何意义？答：主要是以该菌群的检出情况来表示豆制品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带
21、菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。实习报告书写要求每次实习结束后，每个学生应按时写出实习报告。一、实习报告内容提纲1、实习时间、地点和实习单位；2、实习过程概述；3、主要实习岗位和实习内容；4、实习收获和重要心得体会；（不少于300字，每个人体会不同，雷同重写）5、存在不足和建议；6、其他。二、排版要求1、统一用A4纸打印；2、页边距25mm，小标题用四号黑体字，正文内容用小四号宋体，行间距固定值24；插入页码居中，3、其他参照有关编排规范进行。注意：1、 学生姓名一栏请注明姓名及学号，如张三（ 0000001）2、 实习报告提交时间为2013年1月11日
