1、培养基的制备试验报告培养基的制备实验报告培养基的制备与消毒灭菌实验报告实验目的1.学习和掌握配制培养基（以牛肉膏蛋白月东培养基的配制为例）的一般方法和原理。2.了解消毒和灭菌的原理，掌握常用灭菌方法的操作步骤。实验原理培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中.微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。不同微生物对PH要求不一样.雷菌和酵母的培养基的pH一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH一
2、般为中性或微碱性的（嗜碱细菌和嗜酸细菌例外）。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。止匕外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌.如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。高压蒸气灭菌是将持灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀.继续加热，此时由于蒸气不能道出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100c的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌
3、的目的。牛肉膏蛋白月东培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白月东和NaClo其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白月东主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96c时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下而垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40c时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。由于这种培养基多用于培养细
4、菌，因此要用稀酸或稀碱将其PH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖牛肉膏蛋白月东培养基的配方如下:牛肉膏3.0g蛋白月东10.0gNaCl5.0g水1000mlpH7.47.6实验仪器与药品1.溶液或试剂：牛肉膏、蛋白月东、NaCl、琼脂、1mol/LNaOH1mol/LHCl。2.仪器或其他用具：试管、三角瓶、1000ml烧杯(或1000ml刻度搪瓷杯)、量筒、玻棒、培养基分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(pH5.5-9.0)、普通棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布等。实验步骤（一）牛肉膏蛋白月东培养基的制备1.称量（假定配制1000ml培养基）按培养基配方比例依次准确地称取牛
5、肉膏、蛋白月东、NaCl放入烧杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中.牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放人水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。2.溶化在上述烧杯中先加入少于所需要的水量（如约700ml）,用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积（1000ml）;如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放人已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。3.调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH,如果偏酸.用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH边加边搅拌
6、，并随时用pH试纸测其PH直至pH达7.4-7.6。反之,用1mol/LHCl进行调节。4.过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。可以省去（本实验勿需过滤）。5.分装液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。分装三角瓶的虽则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。固体分装分装试管，具装量不超过管高的1/5,灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。半固体分装一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。6,加塞培养基
7、分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞（或硅胶塞、金属或高温塑料试管帽等），以阻止外界微生物进入培养基内面造成污染，并保证有良好的通气性能（棉塞制作方法附本实验后面）。7.包扎加塞后，将全部试管放入铁丝筐或用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、配制日期。8.灭菌将上述培养基以0.103MPa,121C,20min高压蒸气灭菌。9.摆斜面将灭菌的试管培养基冷至50c左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在玻棒或其他合
8、适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜10.无菌检查将灭菌培养基放入37c的恒温箱中培养24-48h.以捡查灭菌是否O注意事项1.蛋白月东很容易吸湿，在称取时动作要迅速，另外，称量时严防药品混杂.一把牛角匙用于一种药品.或称取一种药品后，洗净一一擦干一一再称职另一药品一一瓶盖也不要盖错。2.在琼脂溶化过程中.应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦，制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。3.对于有些要求PH较精确的微生物，其PH的调节可用酸度计进行（使用方法、可参考有关说明书）。pH不要调过头，以避免回调而影
9、响培养基内各离子的浓度。配制pH低的琼脂培养基时.若预先记好PH并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整pH4.分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污面塞而引起污染。（二）高压蒸汽灭菌法步骤1.加水使用前在锅内加入适量的水，加水不可过少，以防将灭菌锅烧干，引起炸裂事故。加水过多有可能引起灭菌物积水。水面与三角架相平为宜2.装料将灭菌物品放在灭菌桶中，不要装得过满。3.加盖盖好锅盖，按对称方法旋紧四周固定螺旋，打开排气阀。4.加热排气加热后水蒸气与空气一起从排气孔排出，待锅内沸腾并有大量蒸汽自排气阀冒出
10、时，排出的气流很强并有嘘声时，维持23min以排除冷空气。如灭菌物品较大或不易透气，应适当延长排气时间，务必使空气充分排除，然后将排气阀关闭。5.加压将排气阀关闭6.保压当压力升至0.1MPa时，温度达121C,此时应注意观察，控制热源。保持压力稳定，维持20-30min后，切断热源。7.自然降压当压力表降至“0”处，稍停，使温度继续降至100c以下后，打开排气阀，旋开固定螺旋，开盖，取出灭菌物。注意：切勿在锅内压力尚在“0”点以上，温度也在100c以上时开启排气阀，否则会因压力骤然降低，而造成培养基剧烈沸腾冲出管口或瓶口，污染棉塞，以后培养时引起杂菌污染。压力降到“0”时，方可打开排气阀。8
11、.保养灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，以保持内壁及内胆干燥，9.培养基无菌检查五、关键步骤及注意事项1.要严格按配方配制。2.调pH不要过头。3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC以下放物、取物。4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。陕西师范大学远程教育学院生物学实验报告报告题目培养基的制备与消毒灭菌姓名学号专业批次/层次指导教师学习中心实验报告培养基的常规配置程序、目的要求1,掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。2,掌握培养基的配置原则和方
12、法。3,掌握高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。二、基本原理营养琼脂培养基：是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。高压蒸汽灭菌：主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。将灭菌的物品放在一个密闭和加压的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。待蒸汽将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气阀继续加热。此时蒸汽不溢出，压力增大，沸点升高，获得高于100c的温度导致菌体蛋白凝固变性，而达到灭菌的目的。三、实验材料1.药品：营养琼脂、蒸储水。2.仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭
13、菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿等。3.其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。四、操作步骤(一)玻璃器皿的洗涤和包装1.玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿浸入含有洗涤剂的水中.用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸储水冲净。再置于烘箱中烘干后备用。2.灭菌前玻璃器皿的包装(1)培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，用报纸按传统包月饼的方法，将几套培养皿包成一包，准备灭菌。(2)移液管的包扎:先将报纸裁成宽约5cm的长纸条，然后将移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45c角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧。在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，
14、准备灭菌。(3)无菌水的制备：往两支洁净的试管中分别加入10ml蒸储水，用试管塞塞好，准备灭菌。(二)固体培养基的配制过程1.培养基配制(1)称取4g营养琼脂，溶于125ml的蒸储水中，加热使其完全溶解。(2)培养基的分装分装时，将4支洗净的试管放置在试管架上，用5ml的移液管分别移取适量的上述溶液于试管中(装入量不宜超过试管高度的1/5);将剩余溶液倒入锥形瓶中(装入量以锥形瓶总体积的一半为限度)，用橡皮塞塞好瓶口。(3)试管、锥形瓶的包扎将上述所有试管(包括盛装无菌水的试管)捆成一捆。然后，将捆好的试管与锥形瓶标明组别与日期。(4)培养基的灭菌将包扎好的玻璃器皿与捆好的试管与锥形瓶在高压灭
15、菌锅中常压,121c条件下灭菌20min。(5)斜面的制作将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒或玻棒上，使成适当斜度(斜面长度不超过试管长度l/2为宜)，凝固后即成斜面。(6)平板的制作在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿三角瓶的底部，左手同时用小指和手掌将塞子打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，将装在锥形瓶中已灭菌的培养基，待冷至50C左右分别倾入1012m冷养基，于2个无菌培养皿中，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。五、实验过程原始记录营养琼脂：4g1、4g黄色营养琼脂粉，完全溶于125ml蒸储水后，得到橙黄色
16、的，透明的胶体溶液。2、将营养琼脂液按实验步骤操作，冷却至室温后，即得到无色（略带黄色）的胶状培养基。六、结果及讨论（一）实验结果成功的制备出了斜面和固体培养基，使后续细菌接种试验顺利进行。但仍存在些缺陷，有待改进。1、理论上，培养基分装于试管后，应用棉塞封好试管口，且棉塞的质量好坏直接影响试验结果。但试验时，使用试管塞封口，由于试管塞一般不透气，在灭菌的升温和降温过程中，试管内外压力会有差异，当管内压力大于管外压力时可能使塞子飞出或试管爆裂。而棉花塞透气，能保持内外压平衡，且阻止细菌进入。2、动手能力差，有时不知所措；且操作粗心大意，损坏玻璃器皿。（二）、注意事项：1、在琼脂加热溶解的整个过
17、程用玻棒不断搅匀，防止琼脂粘在烧杯底部而使烧杯破裂；同时也使其充分溶解，避免培养基制作失败，必要时可补足因蒸发而失去水分至总体积。2、一般情况下在配制固体培养基时，溶解的琼脂液无须过滤。必要时，可趁热用45层纱布过滤。3、根据不同需要，可将已配好培养基分装入试管或锥形瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染，如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镣子夹一小块脱脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱脂棉弃去。4、平板制作时，将已灭菌的培养基待冷至50c时倾入培养皿；若温度过高时，则皿盖上的冷凝水太多；反之，培养基易于凝固而无法制作平板。5、灭菌时，以灭菌最而营养破坏最少，且方法最简
18、便为原则。加压之前，冷空气一定要完全排尽，以提高灭菌效果；恒温灭菌时，最好等自然使表压减至“0”以后，才能打开灭菌锅盖。（三）思考题回答1、霉菌时，塞试管的棉塞是否可以用橡皮塞代替？为什么？答：不可以，因为橡皮塞不透气，在灭菌的升温和降温过程中，试管内外压力会有差异。当管内压力大于管外压力时可能使塞子飞出或试管爆裂。而棉花塞透气，能保持内外压平衡，且能阻止细菌进入。2、如何检查所配置的培养基无菌？若没有灭菌，一定有菌。而有灭菌，则置于37c恒温箱中培养,两三天观察表面有无菌落形成。若无，证明培养基无菌，反之亦然。【目的】了解选择性培养基的原理，并掌撮配制选择性培养基的方法和步骤。【概述】选择性
19、培养基是一类根据某微生物的特殊营养要求或对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合苗样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。选择性培养基均含有增菌剂和选择剂Y样接种子这类培养基后，由于抑荫剂的选择性抑制作用.使所要分离的目的菌得到较好的繁殖，而其他菌被抑制。经过一定的培养时间后.再将目的菌接种到鉴别培养基上，可以提高目的菌的分离阳性率。抑菌剂的种类很多，如孔雀绿、煌绿、去氧胆酸钠、胆盐、四硫磺酸钠或抗生素等，但加人量需准确，有的可以水溶液无菌配制冷藏备用。以上成分的用量、加人方法均按各类配方进行。马丁氏培养基常用于从自然环境中分离真菌，培养基中的去氧胆酸钠和链霉素不是微生
20、物的营养成分。由于去氧胆酸钠为表面活性剂,不仅可防止霉菌菌丝蔓延，还可抑制G一细菌生长，而链霉素对多数G一细菌具抑制生长作用，所以它们是用于抑制细菌和放线菌的生长,而对于真菌的生长则没有影响，从而达到分离真菌的目的。Ashby无氮培养基常用于从自然界环境中分离固氮菌。培养基中只含有基本的碳源和无机盐，没有氮源。一般的细菌不能在此培养基上生长，一些固氮的细菌可以利用空气中的氮气作为氮源，可以在此培养基上生长，从而达到分离固氮菌的目的。【材料和器皿】(1)试剂：蛋白月东，葡萄糖，甘露醇，孟加拉红，链霉素，去氧胆酸钠，KH2P04MgSO47H2O,NaC1,CaSO42H2QCaCO3琼月旨。(2
21、)器皿：台秤，烧杯，共角烧瓶，量筒，漏斗，试管，玻棒，加压蒸汽灭菌锅等。(3)其他：药匙，pH试纸，称量纸，记号笔，棉花塞，纱布，线绳，不锈钢试管帽，牛皮纸，报纸等。【方法和步骤】1l)培养基成分:葡萄糖10g蛋白月东5gKH2PO41gMgSO47H2O0.5g0.1%孟加拉红溶液3.3ml琼脂16g蒸储水1000ml自然PH2%去氧胆酸钠溶液20ml(预先灭菌，临用前加入)链霉素溶液(10000U/ml)3.3ml(临用前加入)(2)配制方法:称量：称取培养基各成分的所需量。溶化：在烧杯中加入约2/3所需水量，然后依次逐一加人并溶化培养基各成分，再按每1000ml培养基加人3.3ml的0.
22、1%孟加拉红溶液。定容：待各成分完全溶化后，补足水量至所需体积。加琼脂：加人所需琼脂量，加热融化，补足失水。分装，加塞，包扎。加压蒸汽灭菌；121c灭菌20min。临用前，加热融化培养基，待冷至60c左右，按每1000ml培养基以无菌操作加入20ml2%去氧胆酸钠溶液及3.3ml的链霉素溶液，迅速混匀。(l)培养基成分：甘露醇10gKH2PO40.2gMgSO47H2O0.2gNaCl0.2mlCaSO42H2O0.1gCaCO35g琼脂1520g蒸储水1000mlpH7.27.4(2)配制方法:称量：称取培养墓各成分的所需量溶化：在烧杯中加入约2/3所需水量，依次逐一溶化培养基各成定容。调pH至7.2一7.4。加琼脂：加入所需琼脂量，加热融化，补足失水。分装，加塞，包扎。：加压蒸汽灭菌；121c(0.07MPa)灭菌20min。【结果记录】记录本实验配制培养基的时问、名称和数量。【注意事项】1.称药品用的牛角匙不要混用2.称完药品应及时盖紧瓶盖。3.调pH时要小心操作，避免回调。【思考题】1.何谓选择性培养基？2.在马丁氏培养基中的孟加拉红、链霉素各起什么作用3.Ashby氏无氮培养基为什么可以分离固氮菌？内容仅供参考
