1、过氧化氢催化荧光法测定维生素c化学工程与现代材料学院2015届本科毕业论文过氧化氢催化荧光法测定维生素C 专 业 化 学 姓 名 张满强 学 号 11043114 指 导 教 师 刘萍 完 成 时 间 2014.06 陕西 商洛独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得商洛学院或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名： 日期： 年 月 日关于论文使用授权
2、的说明本人完全了解商洛学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。公开 保密（_年_月） (保密的学位论文在解密后应遵守此协议)签名： 导师签名： 日期： 年 月 日 过氧化氢催化荧光法测定维生素C化学专业 张满强 指导教师 刘萍摘要：维生素C也称抗坏血酸，它是动物和人体生命活动必须的一种物质，当机体从外界摄取的维生素C不能满足其生命活动的需要或摄入的量超过人体吸收的最大能力，就会引起新陈代谢功能的紊乱甚至死亡。因此探究一种简单、灵灵敏的、快速的维生素C测定方法具有重要意义
3、。本论文利用在PH为6.8的磷酸介质中（由氢氧化钠和磷酸二氢钾配置），70水浴加热12min，维生素C对过氧化氢氧化二氯荧光素的反应具有显著地催化作用，由此建立了催化动力学荧光法测定维生素C的新方法。探讨了该催化反应的较优试验条件并测定了动力学参数，在最佳条件下，非催化体系荧光强度F与催化体系荧光强度F之间的差值F与维生素C浓度在0.132.4 mg/L范围内呈良好的线性关系，方法的检出限为0.78 mg/L，反应为零级反应，表观速率常数为3.510-4 mol/Ls-1。表观活化能为Ea = 47.31 kJ/mol。该方法灵敏度高、仪器简单。关键词：催化荧光法；过氧化氢；二氯荧光素；维生素
4、CDetermination of vitamin C by hydrogen peroxide catalytic fluorimetryChemistry Specility ZhangManqiang Tutor LiuPingAbstract:Vitamin C also known as ascorbic acid, it is the activities of animal and human life must be a substance, when the body from outside the uptake of vitamin C can not meet the
5、need or intake amount exceeds the human body absorption maximum capacity, it will cause metabolic disorders and even death. Therefore, to explore a simple, sensitive, rapid Lingling vitamin C determination method has important significance. At pH 6.8 phosphate medium (by sodium hydroxide and potassi
6、um dihydrogen phosphate configuration), 70 water bath heating 12min, the reaction of vitamin C on the hydrogen peroxide oxidation of dichlorofluorescein has significant catalytic effect, which resulted in the establishment of the Catalytic Kinetic Spectrofluorimetric Determination of Vitamin vitamin
7、 C of the new method by this thesis. Discusses the optimized experimental conditions for the catalytic reaction and kinetic parameters were determined. Under the optimum conditions, the non catalytic fluorescence intensity of the system f and catalytic fluorescence intensity of the system f between
8、difference delta f and the concentration of vitamin C in 0 9.024 mg / Lrange showed a good linear relationship, the method detection limit was 0.78 mg / L, and the reaction is zero order reaction, the apparent rate constant is 3.5 10-4 mol / L - s-1. The apparent activation energy of Ea = 47.31 kJ/m
9、ol. The method has high sensitivity, simple apparatus. Key words:Catalytic Fluorescence Method; Hydrogen peroxide; Two dichlorofluorescein ; vitamin C1 绪 论1.1 催化荧光动力学分析法简介荧光动力学分析始于50年代,它是基于化学反应的速率与反应物的浓度有关,在某些情况下还与催化剂、活化剂、阻化剂或解阻剂的浓度有关,因而,可通过应用荧光法来监测反应速率从而对待测物进行检测,该法也称为荧光速率法。催化荧光动力学分析法是荧光动力学分析法的主要类型,
10、我们将这类方法分为由无机物、有机物、酶催化3类方法。催化荧光法基于催化反应来检测物质含量,由于测量对象并非待测物本身,而是经“化学放大”了的其它物质,因而检测灵敏度很高,检测限可达ng甚至pg级。近年来分析仪器日趋自动化,使得催化荧光动力学分析呈现许多新的特点,其中最为突出的是与流动及停流注射技术的结合使其时间精度、实验条件控制和实验自动化程度得以提高;且催化荧光动力学分析自身也涌现出一些新技术如激光诱导荧光分析、时间分辨荧光分析等,以及一些新应用如应用于生物反应器控制、药物监测和生物分析等方面。Mottola，Crouch等 均阐述了动力学在分析化学中 的重要作用及发展。Valcrcel等探
11、讨了荧光动力学分析法在无机分析中的应用。Kawas等则对流动注射和停流技术在催化动力学分析中的应用进行了评述。 1.2 维生素C简介1.2.1理化性质维生素C（又称抗坏血酸）分子式为C6H8O6是一种含有6个碳原子的酸性多羟基化合物，熔点在190192，分子量为176.1。无色晶体易溶于水不溶于有机溶剂，在酸性条件下稳定存在遇空气中氧、热、光、等碱性物质，特别是由氧化酶及痕量金属离子存在时，可促进其氧化破坏。因此维生素C应该避光、避热保存。1.1.2生理作用 （1）维生素C进入人体后可促进抗体的形成，提高白细胞的吞噬能力。增强人体对疾病的抵抗力和对寒冷的耐受能力，进而增强人体的免疫力。（2）预
12、防缺铁性贫血食物中铁存在的离子形式包括Fe2+和Fe3+两种，而人体能够吸收的只有 Fe2+。铁是合成血红细胞的重要材料，人体缺铁可患缺铁性贫血症（IDA），又称营养性贫血。维生素C具有较强的还原性，它可将食物中的Fe3+还原成Fe2+，促进食物中铁在肠道内的吸收，有利于预防缺铁性贫血（IDA）。（3）预防和治疗坏血病坏血病又称维生素C缺乏症。维生素C是胶原蛋白形成所必需的，它有助于保持间质物质的完整，如结缔组织，骨样组织以及牙本质。严重缺乏可引起坏血病，这是一种急性或慢性疾病，特征为出血，类骨质及牙本质形成异常。儿童主要表现为骨发育障碍，肢体肿痛，假性瘫痪，皮下出血。成人表现为齿龈肿胀、出血
13、，皮下瘀点，关节及肌肉疼痛，毛囊角化等。因此保证膳食中维生素C的足量供应，有利于预防和治疗坏血病。（4）抗衰老科学实验证明，自由基和过氧化脂质是人体衰老的重要诱因。充足的维生素 C 可抑制体内自由基、过氧化脂质等有害物质的形成，从而延缓人体的衰老。1.3 目前测定维生素C的方法1.3.1光度法(1)分光光度法分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。赵兴红等用邻二氮菲-铁比色法测定维生素C,谢全彪等利用分光光度法同时测定食品中的维生素C和山梨酸,都取得较好的结果。比较常用的分光光度法是维生素C的二氯靛酚分光光度法;An-wa
14、r提出的新分光光度法,该法基于在邻二氮菲存在下,于pH=5.5用维生素C将Fe3+还原成Fe2+于515 nm测其吸光度,线性响应为0.21.0ug/mL变异系数为0.96%。（2）动力学光度法动力学光度法是利用反应速度与物质浓度（反应物、产物等）之间的定量关系，测量与反应速度成比例的吸光度，计算出待测组分的浓度。李建平等应用光度法催化动力学根据对氨基苯磺酸与亚硝酸根进行重氮化反应生成重氮盐,抗坏血酸对重氮盐的分解有催化作用测定维生素C片剂与荔枝晶中的抗坏血酸含量。1.3.2电极法（1）碘离子选择电极法杨秀芳等应用电极法提出用碘离子选择电极测定维生素C与碘在乙醇溶液中发生氧化还原反应时定量释放
15、出游离碘离子溶液中的电位以测定样品中Vc含量的方法。（2）聚中性红修饰电极法中性红是一种吩嗪类染料,能够在电极上发生电化学聚合。张秋灵等用中性红制备的化学修饰电极作为工作电极,饱和甘汞电极作为参比电极,铂电极作对比电极,浓度为0.50mol/L的NaNO3作为支持电解质,0.50mol/L的中性红溶液作为修饰液,利用修饰电极对维生素C有催化氧化的作用,通过循环伏安法测定维生素C的含量。1.3.3滴定法（1）2,6-二氯靛酚滴定法2,6-二氯靛酚具有较强的氧化性,在酸性溶液中2,6-二氯靛酚呈粉红色,在中性或者碱性溶液中呈蓝色,还原型抗坏血酸可被2,6-二氯靛酚氧化生成脱氢抗坏血酸,2,6-二氯
16、淀粉则被还原为无色。用2,6-二氯淀粉溶液滴定维生素C的草酸溶液,溶液中的抗坏血酸均被氧化成为脱氢抗坏血酸,过量的2,6-二氯靛酚使溶液呈粉红色,即达到滴定终点。（2）直接碘量法抗坏血酸中的烯二醇结构具有还原性,可与碘定量的发生氧化还原反应,氧化生成2,3-二酮古乐糖酸。以淀粉作为指示剂,用碘的标准溶液滴定抗坏血酸,过量的碘标准溶液与淀粉发生反应使溶液呈蓝色,即达到滴定终点。此法较为成熟,条件易控制,操作快速方便、仪器简单、精密度和准确度较高,数据可靠。适合于一般基层机构对维生素C的测定。1.3.4色谱法（1）薄层色谱法蔡毓琼应用色谱法采用硅胶GF254-CMC-Na薄层板,正戊醇-氯仿-甲酸
17、(6:2:1)为展开剂展开测定Vc银翘片中的维生素C。在紫外灯254nm下检测,Rf值约0.6,最低检出限量1ug。该方法较化学方法检测专属性强且用量少,操作方法简单,易于掌握。适合于含维生素C的中药和中药的鉴别检测。(2) 高效液相色谱法邵丽华等研究了饮料中还原型Vc与总Vc的的高效液相测定方法。方法利用二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)可以选择性地将脱氢抗坏血酸还原为还原型抗坏血酸,而二酮古乐酸则不会被还原来分别测定还原型Vc与总Vc。用C18柱,0.11%乙酸水溶液作为流动相,流速1mL/min,二极管阵列检测器245nm波长处检测。（6）荧光法(1)直接荧光法Deuts
18、ch和Weeks曾经报道过一种检测维生素 C的荧光分析法(OPDA), 并被指定为维生素 C的经典荧光分析法。在该方法中,维生素 C 先被活性炭( Norit) 氧化为脱氢抗坏血酸 (DHAA),DHAA再与荧光底物邻苯二胺 (OPDA) 结合生成荧光产物, 通过对该荧光产物的检测实现对维生素 C的定量分析。（2）间接荧光法抗坏血酸在水溶液中能将无荧光的铈离子还原成能发射特征荧光的铈离子,加入六偏磷酸钠溶液可使体系荧光强度增强,在激发和发射波长分别为303nm和340nm处测定荧光强度;童裳伦等利用该方法测定抗坏血酸标准溶液,抗坏血酸含量在1.010-68.010-6mol/L范围浓度内与体系
19、的荧光强度呈良好的线性关系,相关系数为0.9997,检出限为1.610-8mol/L(S/N=3)。1.4 目前利用二氯荧光素测定的物质陈兰化等在近中性的介质中，利用痕量镍对过氧化氢氧化二氯荧光素的反应有明显的催化作用，当加入痕量镍时可以使体系的荧光强度减小，并以此建立催化动力学荧光法测定痕量镍；除此之外还研究了在氨性介质中,铜()催化过氧化氢氧化二氯荧光素的褪色反应,建立了动力学荧光法测定痕量铜的新方法。李学强等以2,7-二氯荧光素为指示剂，在PH=5.5-7.5中性缓冲介质中，I2与2,7-二氯荧光素反应，使2,7-二氯荧光素的荧光猝灭，当加入As3+后，As3+与I2发生反应是体系的荧光
20、强度增强，体系的激发波长和发射波长分别为ex=508nm,em=524nm。基于此建立荧光法间接测定工业废水和河水样品中的微量As3+的新方法。龚波林，龚国权等以2,7-二氯荧光素(DCF)为指示剂,荧光法间接测定痕量酚的新方法。在0.5mol/LH2SO4介质中,Br-和BrO3-反应生成Br2,Br2与2,7-二氯荧光素反应,使2,7-二氯荧光素荧光猝灭,当加入酚时,酚的溴代反应使体系荧光增强。pH 4. 06. 0范围内,该体系激发波长,发射波长分别为ex=505nm,em=520nm。酚浓度在1. 652ng /L范围内呈线性关系,检出限为1. 6ng /L。本法选择性好,用于环境水样
21、中酚的测定,结果满意。张威等利用2,7-二氯荧光素与蛋白质的显色反应,建立了一种测定蛋白质的新方法。在pH=7.00的缓冲溶液中,2,7一二氯荧光素与蛋白质发生灵敏的显色反应,生成1:1的复合物,最大吸收波长为500nm且在4h内稳定,蛋白质在310-8310-7g/L,范围内符合比尔定律,且回收率在90%一101%之间。探讨了氨基酸及金属离子K+等对测定的影响。测定了人血清中蛋白质的含量,结果满意。2 试验部分2.1 引言：维生素C也称抗坏血酸，它是动物和人体生命活动必须的一种物质，当机体从外界摄取的维生素C不能满足其生命活动的需要或摄入的量超过人体吸收的最大能力，就会引起新陈代谢功能的紊乱
22、甚至死亡。目前维生素C的常用测定方法有光度法、电极法、滴定法、色谱法、荧光法等。这些方法各有优缺点，灵敏度、准确度及适用范围也不尽相同。寻找新的高灵敏度测定维生素C方法仍有重大意义，本实验旨在探究一种简单、灵敏的、快速的测定方法，催动力学荧光法测定维生素C，并应用到对日常生活中保健药品中维生素C的测量。在磷酸缓冲液（磷酸二氢钾和氢氧化钠配置）介质中以及水浴加热70的条件下，维生素C对过氧化氢氧化二氯荧光素的褪色反应有催化作用，据此建立了测定痕量维生素C的新方法。探究了该催化反应的较优试验条件。如最大波峰的确定，介质用量和种类的选择，荧光剂用量的选择，氧化剂种类及用量的选择，反应温度和反应时间的
23、控制等等。通过测量催化体系荧光强度F和非催化体系荧光强度F在激发波长为500 nm处荧光强度的变化，用F指示催化动力学荧光法来测定痕量维生素C，测定了动力学参数。试验过程中的大部分干扰离子可得到有效的抑制。2.2 主要仪器及试剂 实验过程中所用主要仪器、化学试剂及生产厂家见表1：仪器与试剂生产厂家F-4600荧光分光光度计维生素C标准贮备液DCF(二氯荧光素)H2O22.3 溶液的配制0.3%过氧化氢溶液：量取1mL30%的过氧化氢溶液于100mL的容量瓶中，加水稀释至刻度。PH(6.8)混合磷酸液：用0.1mol/L(NaOH)23.6mL,0.2mol/L(KH2PO4)25mL,加水至1
24、00mL的容量瓶中既得。二氯荧光素（2.010-4mol/L）:称取0.01g二氯荧光素，加5mL1mol/LNaOH再加3mL1mol/LHCL溶解后转移至100mL容量瓶中既得到浓度为100ug/mL的二氯荧光素溶液，取配好的100ug/mL二氯荧光素溶液80.2mL于100mL的容量瓶中，加水稀释至刻度即可制得所需浓度的二氯荧光素溶液。1 g/L 维生素C标准贮备液：称取0.25g抗坏血酸溶于30mL水中溶解，移入250 mL容量瓶中，最后转入棕色的试剂瓶冷藏保存。所用试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。2.4 试验方法取两支25 mL带塞比色管，分别依次加入1.75mLDCF(二氯荧光素溶
25、液)，2.0mL磷酸缓冲液溶液，1.5mLH2O2(0.3%)溶液。于一支管中加入1.0 mL 维生素C标准工作液，另一支不加维生素C，用水稀释到刻度并摇匀，同时放入70恒温水槽中加热12 min后取出，流水冷却5 min，用1 cm比色皿，在荧光分光光度计上以500nm为激发波长，525nm为发射波长，测定非催化反应的荧光强度F0和催化反应吸光度F1，计算F=F0-F1值，以F定量。3 结果与讨论3.1 荧光光谱DCF（二氯荧光素）是一种酸性燃料，它的水溶液可以显示出绿色荧光，除此之外还具有易溶于水，稳定等优点。在近中性介质中,用F-4600型荧光分光光度计绘制了几种不同体系溶液的激发光谱(
26、图1)和发射光谱(图2)。从图1可以看出,几种体系溶液的最大激发波长和最大发射波长均为500nm和527nm。在无维生素C存在的情况下,过氧化氢氧化二氯荧光素的反应进行很慢,但当有维生素C存在时,反应速率明显加快(如曲线3,3),说明维生素C对此反应有很强的催化作用。因此在F-4600型荧光光度计上测定时,选用500nm的激发滤光片与527 nm发射滤光片组合,较为合适。 图1激发光谱 图2发射光谱1,1.DCF+buffer solution;2,2.DCF+buffer solution+H2O2;3,3.DCF+buffer solution+ H2O2+Vc.(Vc):1.0g/L3.
27、2 条件优化3.2.1温度优化取两支25 mL带塞比色管，分别依次加入1.0mL二氯荧光素溶液，2.0mLPH为6.8的混合磷酸缓冲溶液,1.5mLH2O2。于一支管中加入1.0 mL 1 g/L维生素C标准工作液，另一支不加维生素C，用水稀释到刻度，摇匀，同时放入40、50、60、70、80、90、100（温度低于40反应进行的很慢）恒温水槽中加热10min后取出，采用流水冷却5 min终止反应且溶液放置1 h, F值几乎不发生变化，在激发波长为500nm波长处，用1 cm比色皿，测定非催化反应的荧光强度F0和催化反应的荧光强度F1，计算F=F0-F1的值。根据不同时间对应不同的F做出下图。
28、结果显示在温度为70时，F有最大值。因此反应的最佳温度为70。3.2.2时间优化 取两支25 mL带塞比色管，分别依次加入1.0mL二氯荧光素溶液，2.0mLPH为6.8的混合磷酸缓冲溶液,1.5mLH2O2。于一支管中加入1.0 mL 1 g/L维生素C标准工作液，另一支不加维生素C，用水稀释到刻度，摇匀，同时放入70恒温水槽中加热(2min、4min、6min、8min、10min、12min、14min、16min、18min、20min)后取出，流水冷却5 min，在激发波长为500nm波长处，用1 cm比色皿，测定非催化反应的荧光强度F0和催化反应的荧光强度F1，计算F=F0-F1的
29、值。根据不同时间对应不同的F做出下图。结果显示当反应时间为12min时，F有最大值。因此反应的最佳时间为12min。3.2.3介质优化（1）种类的选择按照试验方法，BR、乙酸，乙酸钠、磷酸二氢钾氢氧化钠和柠檬酸二氢钾一硼砂四种缓冲体系对体系荧光猝灭值的影响。结果表明BR、乙酸一乙酸钠和柠檬酸二氢钾硼砂缓冲体系中荧光猝灭值及其稳定性均不如磷酸二氢钾氢氧化钠缓冲体系。因此本实验采用磷酸混合液（磷酸二氢钾氢氧化钠缓冲）为缓冲剂，当PH=6.8时F有最大值且稳定。（2）用量的选择取两支25 mL带塞比色管，分别依次加入1.0mL二氯荧光素溶液，PH为6.8的混合磷酸缓冲溶液(0.5mL、1.0mL、1
30、.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL),1.5mLH2O2。于一支管中加入1.0 mL 1 g/L维生素C标准工作液，另一支不加维生素C，用水稀释到刻度，摇匀，同时放入70恒温水槽中加热12 min后取出，流水冷却5 min，在激发波长为500nm波长处，用1 cm比色皿，测定非催化反应的荧光强度F0和催化反应的荧光强度F1，计算F=F0-F1的值。根据不同体积的PH为6.8的混合磷酸缓冲溶液对应不同的F做出下图。结果显示当加入PH为6.8的混合磷酸缓冲溶液为1.5mL时F有最大值，因此反应所需最佳缓冲液的量为1.5mL。3.2.4氧化剂优化取两支25 mL带塞比色管，分别
31、依次加入1.0mL二氯荧光素溶液，1.5mLPH为6.8的混合磷酸缓冲溶液，(0.3mL、0.6mL、0.9mL、1.2mL、1.5mL、1.8mL、2.1mL)H2O2。于一支管中加入1.0 mL 1 g/L维生素C标准工作液，另一支不加维生素C，用水稀释到刻度，摇匀，同时放入70恒温水槽中加热12 min后取出，流水冷却5 min，在激发波长为500nm波长处，用1 cm比色皿，测定非催化反应的荧光强度F0和催化反应的荧光强度F1，计算F=F0-F1的值。根据不同体积的H2O2对应不同的F做出下图。结果显示当加入的H2O2量为1.2mL时，F有最大值。因此反应所需H2O2的最佳量为1.2m
32、L。3.2.5二氯荧光素优化取两支25 mL比色管，依次加入（0.50mL、0.75mL、1.00mL、1.25mL、1.50mL、1.75mL、2.00mL、2.25mL、2.50mL的二氯荧光素溶液，1.5mLPH为6.8的混合磷酸缓冲溶液,1.2mLH2O2。于一支管中加入1.0mL 1g/L维生素C标准液，另一支不加维生素C，用水稀释到刻度，摇匀，同时放入70恒温水槽中加热12min后取出，流水冷却5 min，在激发波长为500 nm波长处，用1 cm比色皿，测定非催化反应的荧光强度F0和催化反应荧光强度F1，计算F=F0-F1的值，根据不同体积的二氯荧光素对应不同的F做出下图。结果显示当加入二氯荧光素的量为1.75m
