1、高效液相色谱方法的建立高效液相色谱方法的建立高效液相色谱方法的建立高效液相色谱方法的建立 步骤步骤步骤步骤 样品制备样品制备样品制备样品制备 分离模式的选择分离模式的选择分离模式的选择分离模式的选择 色谱柱的选择色谱柱的选择色谱柱的选择色谱柱的选择 流动相的选择流动相的选择流动相的选择流动相的选择 洗脱方式的优化洗脱方式的优化洗脱方式的优化洗脱方式的优化 检测方式的选择检测方式的选择检测方式的选择检测方式的选择 色谱理论简单回顾色谱理论简单回顾色谱理论简单回顾色谱理论简单回顾 分离和保留分离和保留分离和保留分离和保留:保留因子保留因子保留因子保留因子，分离因子（选择性），分离因子（选择性），分
2、离因子（选择性），分离因子（选择性）谱带展宽谱带展宽谱带展宽谱带展宽:柱外效应柱外效应柱外效应柱外效应:分离度：分离度：分离度：分离度：，峰对称性：拖尾因子峰对称性：拖尾因子峰对称性：拖尾因子峰对称性：拖尾因子，对称因子对称因子对称因子对称因子 校正因子校正因子校正因子校正因子:()WWttRRR21122+=+=114kknRdWThf2105.0=basymmetryh1.0uCuCuBAHms+=22det22tubeinjext+=10=ttkR12kk=CACAfRRss=HPLCHPLC方法建立的步骤方法建立的步骤方法建立的步骤方法建立的步骤 收集样品信息，明确分析的目的和要求收集
3、样品信息，明确分析的目的和要求收集样品信息，明确分析的目的和要求收集样品信息，明确分析的目的和要求 选择样品制备方法选择样品制备方法选择样品制备方法选择样品制备方法 确定检测方法和条件确定检测方法和条件确定检测方法和条件确定检测方法和条件 确定确定确定确定HPLCHPLC分析模式，选择相应色谱柱分析模式，选择相应色谱柱分析模式，选择相应色谱柱分析模式，选择相应色谱柱 优化分离条件优化分离条件优化分离条件优化分离条件 定性、定量分析定性、定量分析定性、定量分析定性、定量分析 方法验证方法验证方法验证方法验证 样品信息样品信息样品信息样品信息样品中的化学成分，及各成分的含量范围样品中的化学成分，及
4、各成分的含量范围样品中的化学成分，及各成分的含量范围样品中的化学成分，及各成分的含量范围化合物的结构或官能团化合物的结构或官能团化合物的结构或官能团化合物的结构或官能团化合物的分子量化合物的分子量化合物的分子量化合物的分子量化合物的酸碱性和化合物的酸碱性和化合物的酸碱性和化合物的酸碱性和pKapKa、pKbpKb值值值值适宜的样品溶剂及溶解度适宜的样品溶剂及溶解度适宜的样品溶剂及溶解度适宜的样品溶剂及溶解度化合物的紫外吸收光谱化合物的紫外吸收光谱化合物的紫外吸收光谱化合物的紫外吸收光谱 分析目的和要求分析目的和要求分析目的和要求分析目的和要求 主主主主成分的定性、定量成分的定性、定量成分的定性
5、、定量成分的定性、定量 杂质分析，如有关物质及降解产物等杂质分析，如有关物质及降解产物等杂质分析，如有关物质及降解产物等杂质分析，如有关物质及降解产物等 药物代谢动力学或药物代谢物研究药物代谢动力学或药物代谢物研究药物代谢动力学或药物代谢物研究药物代谢动力学或药物代谢物研究 中药有效成分或指标成分的定性、定量中药有效成分或指标成分的定性、定量中药有效成分或指标成分的定性、定量中药有效成分或指标成分的定性、定量 中药指纹图谱分析中药指纹图谱分析中药指纹图谱分析中药指纹图谱分析 合成聚合物或生物大分子的分子量及其分布或序列分析合成聚合物或生物大分子的分子量及其分布或序列分析合成聚合物或生物大分子的
6、分子量及其分布或序列分析合成聚合物或生物大分子的分子量及其分布或序列分析 准确度准确度准确度准确度 精密度精密度精密度精密度 分离度分离度分离度分离度 灵敏度灵敏度灵敏度灵敏度 分析速度分析速度分析速度分析速度 样品处理样品处理样品处理样品处理 溶解、稀释、过滤溶解、稀释、过滤溶解、稀释、过滤溶解、稀释、过滤 超声萃取超声萃取超声萃取超声萃取 溶剂萃取溶剂萃取溶剂萃取溶剂萃取 固相萃取固相萃取固相萃取固相萃取 多种方式联合使用多种方式联合使用多种方式联合使用多种方式联合使用 柱前衍生，柱后衍生柱前衍生，柱后衍生柱前衍生，柱后衍生柱前衍生，柱后衍生根据实验目的，目标分析物，检测要求等选择适当的样
7、品处理方法根据实验目的，目标分析物，检测要求等选择适当的样品处理方法根据实验目的，目标分析物，检测要求等选择适当的样品处理方法根据实验目的，目标分析物，检测要求等选择适当的样品处理方法注意：供试品溶剂与色谱条件的匹配注意：供试品溶剂与色谱条件的匹配注意：供试品溶剂与色谱条件的匹配注意：供试品溶剂与色谱条件的匹配 HPLCHPLC模式的选择模式的选择模式的选择模式的选择样品样品样品样品溶于有机溶剂溶于有机溶剂溶于有机溶剂溶于有机溶剂溶于水溶于水溶于水溶于水溶于四氢呋喃溶于四氢呋喃溶于四氢呋喃溶于四氢呋喃非离子化非离子化非离子化非离子化离子化离子化离子化离子化溶于有机溶剂溶于有机溶剂溶于有机溶剂溶
8、于有机溶剂溶于水溶于水溶于水溶于水溶于正己烷溶于正己烷溶于正己烷溶于正己烷溶于甲醇或甲醇溶于甲醇或甲醇溶于甲醇或甲醇溶于甲醇或甲醇/水水水水或乙腈或乙腈或乙腈或乙腈或乙腈或乙腈或乙腈或乙腈/水水水水硅胶的正相色谱硅胶的正相色谱硅胶的正相色谱硅胶的正相色谱用键合相的正相色谱用键合相的正相色谱用键合相的正相色谱用键合相的正相色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱低分子凝胶渗透色谱低分子凝胶渗透色谱低分子凝胶渗透色谱低分子凝胶渗透色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱用键合相的反相色谱用键
9、合相的反相色谱抑制电离反相键合相色谱抑制电离反相键合相色谱抑制电离反相键合相色谱抑制电离反相键合相色谱离子对键合相的反相色谱离子对键合相的反相色谱离子对键合相的反相色谱离子对键合相的反相色谱用硅胶的正相色谱用硅胶的正相色谱用硅胶的正相色谱用硅胶的正相色谱离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱大孔填料的离子交换色谱大孔填料的离子交换色谱大孔填料的离子交换色谱大孔填料的离子交换色谱用大孔填料的反相色谱用大孔填料的反相色谱用大孔填料的反相色谱用大孔填料的反相色谱分子量分子量分子量分子量2,000
10、2,000分子量分子量分子量分子量2,0002,000 HPLCHPLC分离模式及应用范围分离模式及应用范围分离模式及应用范围分离模式及应用范围生物大分子生物大分子生物大分子生物大分子亲和配基，非成键亲和配基，非成键亲和配基，非成键亲和配基，非成键作用力，分子识别作用力，分子识别作用力，分子识别作用力，分子识别缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液亲和色谱亲和色谱亲和色谱亲和色谱应用范围应用范围应用范围应用范围色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱流动相流动相流动相流动相方法方法方法方法光学异构体（对映体）光学异构体（对映体）光学异构体（对映体）光学异构体（对映体）各种手性填料各种手性填料各种手性填料各种手性填料
11、水水水水-有机溶剂有机溶剂有机溶剂有机溶剂手性色谱手性色谱手性色谱手性色谱水溶性蛋白质，疏水性随盐浓水溶性蛋白质，疏水性随盐浓水溶性蛋白质，疏水性随盐浓水溶性蛋白质，疏水性随盐浓度而改变度而改变度而改变度而改变类似反相填料，但类似反相填料，但类似反相填料，但类似反相填料，但疏水性小得多疏水性小得多疏水性小得多疏水性小得多缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液疏水疏水疏水疏水-相互作用相互作用相互作用相互作用色谱色谱色谱色谱大分子化合物，蛋白质或聚合大分子化合物，蛋白质或聚合大分子化合物，蛋白质或聚合大分子化合物，蛋白质或聚合物等物等物等物等GFC:GFC:二醇基；二醇基；二醇基；二醇基；GPC:GP
12、C:聚苯乙烯或聚苯乙烯或聚苯乙烯或聚苯乙烯或硅胶硅胶硅胶硅胶水相（水相（水相（水相（GFCGFC）；）；）；）；纯有机纯有机纯有机纯有机溶剂（溶剂（溶剂（溶剂（GPCGPC）分子（尺寸）排分子（尺寸）排分子（尺寸）排分子（尺寸）排阻色谱阻色谱阻色谱阻色谱蛋白，多肽，核酸；无机离子蛋白，多肽，核酸；无机离子蛋白，多肽，核酸；无机离子蛋白，多肽，核酸；无机离子分离应首选离子色谱分离应首选离子色谱分离应首选离子色谱分离应首选离子色谱阴离子交换或阳离阴离子交换或阳离阴离子交换或阳离阴离子交换或阳离子交换子交换子交换子交换缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱难
13、溶或不溶于难溶或不溶于难溶或不溶于难溶或不溶于水水水水-有机混合溶有机混合溶有机混合溶有机混合溶液的化合物，异构体（立体，液的化合物，异构体（立体，液的化合物，异构体（立体，液的化合物，异构体（立体，位置）分离以硅胶更好位置）分离以硅胶更好位置）分离以硅胶更好位置）分离以硅胶更好氰基，氨基，二醇氰基，氨基，二醇氰基，氨基，二醇氰基，氨基，二醇基，硅胶基，硅胶基，硅胶基，硅胶有机溶剂的混合溶剂有机溶剂的混合溶剂有机溶剂的混合溶剂有机溶剂的混合溶剂正相正相正相正相HPLCHPLC酸酸酸酸碱性化合物或离子化合物碱性化合物或离子化合物碱性化合物或离子化合物碱性化合物或离子化合物C18C18，C8C8水
14、水水水-有机溶剂，缓冲溶液有机溶剂，缓冲溶液有机溶剂，缓冲溶液有机溶剂，缓冲溶液和离子对试剂和离子对试剂和离子对试剂和离子对试剂离子对离子对离子对离子对HPLCHPLC能溶于能溶于能溶于能溶于水水水水-有机混合溶液的中有机混合溶液的中有机混合溶液的中有机混合溶液的中性或弱酸、弱碱性化合物性或弱酸、弱碱性化合物性或弱酸、弱碱性化合物性或弱酸、弱碱性化合物C18C18，C8C8，苯基，苯基，苯基，苯基，氰基氰基氰基氰基水水水水-有机溶剂有机溶剂有机溶剂有机溶剂反相反相反相反相HPLCHPLC 选择色谱柱选择色谱柱选择色谱柱选择色谱柱1.1.根据样品特性选择分离模式根据样品特性选择分离模式根据样品特
15、性选择分离模式根据样品特性选择分离模式2.2.根据色谱柱性能根据色谱柱性能根据色谱柱性能根据色谱柱性能3.3.根据分离规模来选择根据分离规模来选择根据分离规模来选择根据分离规模来选择4.4.柱硬件状态柱硬件状态柱硬件状态柱硬件状态 色谱柱的选择色谱柱的选择色谱柱的选择色谱柱的选择不同的传质阻力，分离速度，柱容量不同的传质阻力，分离速度，柱容量不同的传质阻力，分离速度，柱容量不同的传质阻力，分离速度，柱容量全全全全多孔微粒，微表膜颗粒，灌流颗粒多孔微粒，微表膜颗粒，灌流颗粒多孔微粒，微表膜颗粒，灌流颗粒多孔微粒，微表膜颗粒，灌流颗粒颗粒类型颗粒类型颗粒类型颗粒类型柱柱柱柱容量容量容量容量保留位点
16、的多少保留位点的多少保留位点的多少保留位点的多少比比比比表面积表面积表面积表面积色谱柱使用寿命色谱柱使用寿命色谱柱使用寿命色谱柱使用寿命pH28(36),pH111pH28(36),pH111；40804080C CpHpH，温度适用范围温度适用范围温度适用范围温度适用范围碱性化合物的峰形，选择性碱性化合物的峰形，选择性碱性化合物的峰形，选择性碱性化合物的峰形，选择性屏蔽硅醇基，消除二次化学平衡作用屏蔽硅醇基，消除二次化学平衡作用屏蔽硅醇基，消除二次化学平衡作用屏蔽硅醇基，消除二次化学平衡作用封端技术封端技术封端技术封端技术柱容量柱容量柱容量柱容量柱床实密性柱床实密性柱床实密性柱床实密性柱填料
17、量柱填料量柱填料量柱填料量选择性，水性流动相的耐受性选择性，水性流动相的耐受性选择性，水性流动相的耐受性选择性，水性流动相的耐受性键合相修饰键合相修饰键合相修饰键合相修饰键合方式键合方式键合方式键合方式容量因子，保留时间容量因子，保留时间容量因子，保留时间容量因子，保留时间含碳量含碳量含碳量含碳量键合密度键合密度键合密度键合密度适用的化合物分子量范围适用的化合物分子量范围适用的化合物分子量范围适用的化合物分子量范围7 71212nmnm，30nm30nm填料孔径填料孔径填料孔径填料孔径充填均匀度，流速相关性充填均匀度，流速相关性充填均匀度，流速相关性充填均匀度，流速相关性粒径大小分布，均匀度粒
18、径大小分布，均匀度粒径大小分布，均匀度粒径大小分布，均匀度填料粒径填料粒径填料粒径填料粒径峰形峰形峰形峰形金属含量，填料酸性金属含量，填料酸性金属含量，填料酸性金属含量，填料酸性硅胶纯度硅胶纯度硅胶纯度硅胶纯度柱容量，充填均匀度柱容量，充填均匀度柱容量，充填均匀度柱容量，充填均匀度不定形硅胶，球形硅胶不定形硅胶，球形硅胶不定形硅胶，球形硅胶不定形硅胶，球形硅胶硅胶类型硅胶类型硅胶类型硅胶类型反相硅胶键合色谱柱性能参数反相硅胶键合色谱柱性能参数反相硅胶键合色谱柱性能参数反相硅胶键合色谱柱性能参数 流动相的选择流动相的选择流动相的选择流动相的选择 有机溶剂：甲醇，乙腈，四氢呋喃，异丙醇等有机溶剂：
19、甲醇，乙腈，四氢呋喃，异丙醇等有机溶剂：甲醇，乙腈，四氢呋喃，异丙醇等有机溶剂：甲醇，乙腈，四氢呋喃，异丙醇等 酸：磷酸，乙酸，甲酸，三氟乙酸等酸：磷酸，乙酸，甲酸，三氟乙酸等酸：磷酸，乙酸，甲酸，三氟乙酸等酸：磷酸，乙酸，甲酸，三氟乙酸等 碱：三乙胺，稀氨水（注意色谱柱的耐受性）等碱：三乙胺，稀氨水（注意色谱柱的耐受性）等碱：三乙胺，稀氨水（注意色谱柱的耐受性）等碱：三乙胺，稀氨水（注意色谱柱的耐受性）等 离子对试剂：烷基磺酸钠，氢氧化四丁基铵等离子对试剂：烷基磺酸钠，氢氧化四丁基铵等离子对试剂：烷基磺酸钠，氢氧化四丁基铵等离子对试剂：烷基磺酸钠，氢氧化四丁基铵等 缓冲盐：磷酸盐，醋酸盐，枸
20、橼酸盐等缓冲盐：磷酸盐，醋酸盐，枸橼酸盐等缓冲盐：磷酸盐，醋酸盐，枸橼酸盐等缓冲盐：磷酸盐，醋酸盐，枸橼酸盐等反相色谱反相色谱反相色谱反相色谱 中性化合物中性化合物中性化合物中性化合物1.1.首先以水首先以水首先以水首先以水-有机溶剂进行有机溶剂进行有机溶剂进行有机溶剂进行二元分离；首次实验采用二元分离；首次实验采用二元分离；首次实验采用二元分离；首次实验采用强溶剂，随后逐渐降低有强溶剂，随后逐渐降低有强溶剂，随后逐渐降低有强溶剂，随后逐渐降低有机相比例机相比例机相比例机相比例经验规律：有机相降低经验规律：有机相降低经验规律：有机相降低经验规律：有机相降低10%10%，k k 增加约增加约增加
21、约增加约3 3倍倍倍倍2.2.采用梯度洗脱方式，优化采用梯度洗脱方式，优化采用梯度洗脱方式，优化采用梯度洗脱方式，优化流动相组成流动相组成流动相组成流动相组成调节有机相的比例改善分离调节有机相的比例改善分离调节有机相的比例改善分离调节有机相的比例改善分离 中性化合物中性化合物中性化合物中性化合物溶剂强度及溶剂优化溶剂强度及溶剂优化溶剂强度及溶剂优化溶剂强度及溶剂优化 酸、碱及离子化合物酸、碱及离子化合物酸、碱及离子化合物酸、碱及离子化合物 1.1.酸碱平衡与保留酸碱平衡与保留酸碱平衡与保留酸碱平衡与保留H A+AB H+BH+H+pH27pH27磷酸及其盐磷酸及其盐磷酸及其盐磷酸及其盐缓冲盐浓
22、度：缓冲盐浓度：缓冲盐浓度：缓冲盐浓度：10501050mmolmmol/L/LpH45pH45乙酸及其盐乙酸及其盐乙酸及其盐乙酸及其盐pH34pH34甲酸及其盐甲酸及其盐甲酸及其盐甲酸及其盐适用的适用的适用的适用的pHpH范围范围范围范围缓冲对缓冲对缓冲对缓冲对 酸、碱及离子化合物酸、碱及离子化合物酸、碱及离子化合物酸、碱及离子化合物2.2.离子对色谱法离子对色谱法离子对色谱法离子对色谱法碱性化合物：烷基磺酸盐碱性化合物：烷基磺酸盐碱性化合物：烷基磺酸盐碱性化合物：烷基磺酸盐(R R-SOSO3 3Na)Na)酸性化合物：四丁基铵盐酸性化合物：四丁基铵盐酸性化合物：四丁基铵盐酸性化合物：四丁
23、基铵盐(TBATBA+X X-)B+H+BH+RSO3NaRSO3+Na+-BH+RSO3-BH+RSO3-.RCOOHRCOOH+TBA XTBAX+-+RCOO+TBARCOO TBA.+-硅胶担体硅胶担体硅胶担体硅胶担体C C1818/C/C8 8离子对试剂离子对试剂离子对试剂离子对试剂离子对色谱法，对流动相离子对色谱法，对流动相离子对色谱法，对流动相离子对色谱法，对流动相pHpH，温度等温度等温度等温度等因素较敏感；且柱平衡相对较慢，因因素较敏感；且柱平衡相对较慢，因因素较敏感；且柱平衡相对较慢，因因素较敏感；且柱平衡相对较慢，因此，通常不建议采用梯度洗脱方式。此，通常不建议采用梯度洗
24、脱方式。此，通常不建议采用梯度洗脱方式。此，通常不建议采用梯度洗脱方式。色谱柱和流动相的协同考虑色谱柱和流动相的协同考虑色谱柱和流动相的协同考虑色谱柱和流动相的协同考虑低低低低pHpH流动相流动相流动相流动相调节有机相比例调节有机相比例调节有机相比例调节有机相比例试用试用试用试用ZORBAX SBZORBAX SB-CN,SBCN,SB-C3,SBC3,SB-PhenylPhenyl 改换有机相改换有机相改换有机相改换有机相(MeOH/THF)MeOH/THF)调节有机相使调节有机相使调节有机相使调节有机相使 0.5 0.5 k 20k 20碱性化合物的离碱性化合物的离碱性化合物的离碱性化合物
25、的离子对试剂子对试剂子对试剂子对试剂改变温度改变温度改变温度改变温度加加加加2020mmolmmol/L TEA/L TEA峰拖尾峰拖尾峰拖尾峰拖尾分离度改善不足分离度改善不足分离度改善不足分离度改善不足碱性化合物保留弱碱性化合物保留弱碱性化合物保留弱碱性化合物保留弱ZORBAX SBZORBAX SB-C18/SBC18/SB-C8C8 pH2(13)2050pH2(13)2050 mmolmmol/L/L 缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 T=30T=30C C 调节调节调节调节%ACNACN使使使使 0.5 0.5 k 20k 20 色谱柱和流动相的协同考虑色谱柱和流动相的协同考虑色谱柱和流动相
26、的协同考虑色谱柱和流动相的协同考虑中等中等中等中等pHpH流动相流动相流动相流动相调节有机相比例调节有机相比例调节有机相比例调节有机相比例试用试用试用试用ZORBAX XDBZORBAX XDB-CN,XDBCN,XDB-Phenyl,BonusPhenyl,Bonus-RPRP 改换有机相改换有机相改换有机相改换有机相(MeOH/THF)MeOH/THF)调节有机相使调节有机相使调节有机相使调节有机相使 0.5 0.5 k 20k 20酸性化合物的离酸性化合物的离酸性化合物的离酸性化合物的离子对试剂子对试剂子对试剂子对试剂改变温度改变温度改变温度改变温度(室温室温室温室温6060C C）加加
27、加加2020mmolmmol/L TEA/L TEA峰拖尾峰拖尾峰拖尾峰拖尾分离度改善不足分离度改善不足分离度改善不足分离度改善不足酸性化合物保留弱酸性化合物保留弱酸性化合物保留弱酸性化合物保留弱ZORBAX XDBZORBAX XDB-C18/XDBC18/XDB-C8C8 pH7(69)2050pH7(69)2050 mmolmmol/L/L 缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 T=30T=30C C 调节调节调节调节%ACNACN使使使使 0.5 0.5 k 20k 20 色谱柱和流动相的协同考虑色谱柱和流动相的协同考虑色谱柱和流动相的协同考虑色谱柱和流动相的协同考虑高高高高pHpH流动相流动相流
28、动相流动相调节有机相比例调节有机相比例调节有机相比例调节有机相比例试用其它液相分离模式试用其它液相分离模式试用其它液相分离模式试用其它液相分离模式 改换有机相改换有机相改换有机相改换有机相(ACN/THF)ACN/THF)调节有机相使调节有机相使调节有机相使调节有机相使 0.5 0.5 k 20k 20改变温度改变温度改变温度改变温度分离度改善不足分离度改善不足分离度改善不足分离度改善不足ZORBAX Extend C18ZORBAX Extend C18 pH10.5(912)5 pH10.5(912)5 mmolmmol/L/L 氨水、氨水、氨水、氨水、TEATEA或或或或10501050
29、mmolmmol/L/L有机硼酸缓冲液有机硼酸缓冲液有机硼酸缓冲液有机硼酸缓冲液 T=25T=25C C(室温室温室温室温8080C C）调节调节调节调节%MeOHMeOH使使使使 0.5 0.5 k 20k 20 梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱1.1.梯度洗脱原理及类型梯度洗脱原理及类型梯度洗脱原理及类型梯度洗脱原理及类型Gks20*k*k*：组分迁移至色谱柱中间点时的组分迁移至色谱柱中间点时的组分迁移至色谱柱中间点时的组分迁移至色谱柱中间点时的k k(平均平均平均平均k k)G Gs s：梯度斜率梯度斜率梯度斜率梯度斜率 梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱5 595956565100100
30、0 060605 595953 35 595950 0%甲醇甲醇甲醇甲醇/乙腈乙腈乙腈乙腈%水相水相水相水相时间（时间（时间（时间（minmin）通常不应从通常不应从通常不应从通常不应从100%100%水相开始（色谱柱键合相修饰）水相开始（色谱柱键合相修饰）水相开始（色谱柱键合相修饰）水相开始（色谱柱键合相修饰）根据初始条件分析结果，逐步改变梯度起始、终止比例，以及梯度斜率根据初始条件分析结果，逐步改变梯度起始、终止比例，以及梯度斜率根据初始条件分析结果，逐步改变梯度起始、终止比例，以及梯度斜率根据初始条件分析结果，逐步改变梯度起始、终止比例，以及梯度斜率起始阶段，建议先进行短暂的等度洗脱，便
31、于进样平衡，以及延迟体积校正起始阶段，建议先进行短暂的等度洗脱，便于进样平衡，以及延迟体积校正起始阶段，建议先进行短暂的等度洗脱，便于进样平衡，以及延迟体积校正起始阶段，建议先进行短暂的等度洗脱，便于进样平衡，以及延迟体积校正经验：色谱峰分布时间经验：色谱峰分布时间经验：色谱峰分布时间经验：色谱峰分布时间 梯度时间的梯度时间的梯度时间的梯度时间的1/41/4，有可能优化为等度洗脱，有可能优化为等度洗脱，有可能优化为等度洗脱，有可能优化为等度洗脱2.2.梯度的建立梯度的建立梯度的建立梯度的建立 梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱起始流动相组成对梯度分离的影响起始流动相组成对梯度分离的影响起始流动相
32、组成对梯度分离的影响起始流动相组成对梯度分离的影响终止流动相组成对梯度分离的影响终止流动相组成对梯度分离的影响终止流动相组成对梯度分离的影响终止流动相组成对梯度分离的影响3.3.流动相组成及梯度斜率对梯度分离的影响流动相组成及梯度斜率对梯度分离的影响流动相组成及梯度斜率对梯度分离的影响流动相组成及梯度斜率对梯度分离的影响 梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱min051015202502004006008001000mAU梯度起点梯度起点低延迟系统低延迟系统高延迟系统高延迟系统滞后时间滞后时间4.4.延迟体积延迟体积延迟体积延迟体积 Vdelay=Vmixer+Vpre-column 建议：测定不
33、同系统的延迟体积，建议：测定不同系统的延迟体积，建议：测定不同系统的延迟体积，建议：测定不同系统的延迟体积，并通过调节梯度的起始时间，以便并通过调节梯度的起始时间，以便并通过调节梯度的起始时间，以便并通过调节梯度的起始时间，以便在不同仪器上获得重现的色谱图在不同仪器上获得重现的色谱图在不同仪器上获得重现的色谱图在不同仪器上获得重现的色谱图 梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱min0246802004006008001000120014001600梯度曲线梯度曲线2345min02468020040060080010001200相对延迟相对延迟相对延迟相对延迟32梯度曲线梯度曲线在不同系统之间进行方法转换，需分别测定系统延迟体积在不同系统之间进行方法转换，需分别测定系统延迟体积在不同系统之间进行方法转换，需分别测定系统延迟体积在不同系统之间进行方法转换，需分别测定系统延迟体积柱前延迟体积的影响
