1、KEY WORDS: flow injection; chemiluminescence; hydrocortisone氢化可的松（hydrocortisone, Hd），又名可的索、皮质醇，是肾上腺分泌的糖皮质激素的一种，其药理作用主要有抗炎、抗过敏和免疫抑制、抗核割裂等。临床上主要用于肾上腺功能不全所引发的疾病、类风湿性关节炎、过敏性皮炎、角膜炎、神经性皮炎、结核性脑膜炎等。目前，测定氢化可的松的方式主要有高效液相色谱法1 6、分光光度法7 12、旋光法13 14、光谱法15 16。但这些方式存在灵敏度低和操作繁琐等不足。化学发光分析法由于灵敏度高、分析速度快、方式简便等特点，愈来愈受到人
2、们的青睐17 19。范顺利等20采用铁氰化钾 奎宁发光体系测定氢化可的松，但其灵敏度较低，方式的线性范围和检出限别离为10-5g/mL和10-8g/mL。本实验发觉，在酸性介质中，氢化可的松对高锰酸钾 亚硫酸钠体系有明显的增敏作用。据此，成立了氢化可的松的流动注射化学发光新方式。1 材料与方式 材料 IFFL DD 流动注射化学发光分析仪系西安瑞迈电子科技有限公司产品。氢化可的松对比品溶液：精密称取氢化可的松对比品（中国药品生物制品查验所提供），用少量乙醇溶解后，用蒸馏水定容于100mL容量瓶中，即得10-4g/mL储蓄液，低温避光保留，使历时逐级稀释至所需浓度。亚硫酸钠溶液10-2mol/L
3、）：准确称取亚硫酸钠，用蒸馏水溶解并定容于250mL容量瓶中，得10-2mol/L溶液，新鲜配制。高锰酸钾溶液准确称取 KMnO4，用蒸馏水溶解并定容于100mL容量瓶中，得10-2mol/L储蓄液，使历时稀释。氢化可的松注射液为山西晋新双鹤药业有限责任公司产品，标示量：10mg/支。实验所用试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。 方式 流动注射 化学发光仪器流路图见图1。流路a、b、c别离用来输送Na2SO3溶液、样品溶液、酸性KMnO4溶液。实验中，样品溶液和KMnO4溶液在三叉管M中混合，再与流路a中的Na2SO3溶液混合，发生化学发光反映，所产生的化学发光信号当即被光电倍增管检测，运算机记录
4、的数据利用IFFL DD型流动注射化学发光分析软件分析。按图1所示装置装好流路，开启蠕动泵，待基线稳固后进行测定，以相对发光强度I进行定量。图1 流动注射化学发光分析仪流路图（略） Schematic diagram of the CL flow system for the determination of hydrocortisonea: Na2SO3 solution; b: Sample solution; c: KMnO4 H2SO4 solution; M: Manifold; V: Six way values; P1, P2: Peristaltic pump; F: Flow
5、 cell; PMT: Multiplier phototube; HV: High voltage; COM: Computer; W: Waste solution2 结果与讨论本实验用 10 6 g/mL氢化可的松对比品溶液进行条件优化。 仪器参数的优化 流路的选择：考察了不同流路对化学发光强度的影响。由于b、c管路无区别，所以只考虑a管路的情形。当a管路别离为 Na2SO3溶液、酸性KMnO4溶液和样品溶液，b、c管路为其他二者时，10-4mol/L KMnO4 10-2mol/L Na2SO3 10-6g/mL Hd中的相对发光强度别离为25五、4二、2。因此，当采用如图1所示流路时
6、，氢化可的松的相对化学发光强度最大，且信号稳固。故本文选择此流路进行分析。流路参数的选择：蠕动泵转速、采样管长和阀池距都会影响反映混合液进入检测器的时刻，从而影响检测器对发光信号的检测。本实验选择流通管内径为。结果表明，当蠕动泵主泵转速为30r/min，副泵转速为35r/min，采样管长为10cm，阀池距为10cm时，测定具有最大的信噪比。 实验条件的优化 反映介质及其浓度的选择：别离考察了以HCl、HNO3、HAc、H2SO4、H3PO4和NaOH为反映介质的发光强度。在这些介质中，10-4 mol/L KMnO4 10-6g/mL氢化可的松的相对发光强度别离为二、八、1五、13六、109和
7、1。H2SO4介质中化学发光信号最大，且信号稳固。因此，该实验选择H2SO4为反映介质。实验观察到，当H2SO4存在于Na2SO3中时，其浓度对发光无影响。所以选择将H2SO4加入KMnO4中，对H2SO4在浓度范围进行了考察。实验表明，化学发光信号随着H2SO4浓度的增加而增加，当H2SO4浓度超过L时，发光信号随H2SO4浓度转变很小。考虑到发光信号的稳固性及H2SO4对管路的侵蚀性，咱们选择L的H2SO4为最佳浓度。氧化剂的选择：实验对高锰酸钾、高碘酸钾、高氯酸钾、重铬酸钾等氧化剂做了考察，观察到在KMnO4中化学发光信号最大，而在其他氧化剂中几乎无化学发光。因此，实验选择KMnO4作为
8、氧化剂。考察了KMnO4在10-4mol/L浓度内对发光信号的影响。实验表明，随着KMnO4浓度的不断增加，相对化学发光强度也不断增大；当浓度增加到10-4 mol/L时，相对化学发光强度出现最大值；当浓度大于这一数值时，由于KMnO4本身颜色加深，产生内滤效应使化学发光强度降低。因此，实验中所选的KMnO4浓度为10-4mol/L。Na2SO3浓度的选择：考察了L范围内不同浓度Na2SO3对化学发光强度的影响。结果表明，随着Na2SO3浓度的不断增加，相对化学发光强度也不断增大，当Na2SO3浓度超过10-2mol/L时，相对发光强度随浓度的增大转变不大。因此，实验当选择10-2mol/L作
9、为Na2SO3的最佳浓度。 标准曲线、精密度及检出限 在优化的最佳实验条件下按图1所示装置装好流路，对氢化可的松的对比品溶液进行逐级稀释并测定分析，以相对发光强度I（即样品的化学发光强度减去空白的强度）对浓度做图。结果表明，在10-9g/10-6g/mL范围内发光强度与药物浓度呈良好的线性关系。对浓度为10-6g/mL的氢化可的松进行11次平行测定，其相对标准误差（relative standard deviation, RSD）为%。计算得氢化可的松的检出限为10-10g/mL。为了提高检测的精密度，标准曲线分段绘制，其相关线性参数见表1。表1 氢化可的松的标准曲线及其参数（略）Table
10、1 Parameters for calibration curve and detection limit of hydrocortisone（略）I: relative CL intensity; C （concentration）: ng/mL 干扰实验 在10-6g/mL的氢化可的松对比品溶液中，对实验中可能存在的辅料和干扰物质进行分析。结果表明在相对误差为5%条件下，1000倍的K+、Ca2+、Cl-、NO-3；200倍的Mg2+、Zn2+、CO2-3；100倍的抗坏血酸、EDTA；10倍的葡萄糖、乳糖、蔗糖不干扰测定。 样品分析 取氢化可的松注射液10支，精密量取相当于50mg的氢
11、化可的松，用蒸馏水定容于50mL容量瓶中，配成10-3g/mL的待测溶液。精密吸取上述溶液适量，加水稀释至工作曲线线性范围内，按图1所示流路进行测定，并采用标准加入法进行回收率实验，测定结果见表2。同时与药典21方式做对比，测定结果见表3。表2 氢化可的松的回收率实验（略）Table 2 Determination results of recovery test表3 氢化可的松注射液中氢化可的松含量的测定（略）Table 3 Determination results of hydrocortisone in pharmaceutical injections 发光机理探讨 氢化可的松对KM
12、nO4 Na2SO3发光反映具有增敏作用，参考文献22和实验资料，咱们以为该体系化学发光反映的实质是在酸性条件下氢化可的松第一受到高锰酸钾的氧化生成大量活泼的单线态氧1O2（1g），1O2（1g）再迅速与Na2SO3反映生成S2O2-6，S2O2-6随后分解为SO*2，SO*2回到基态的SO2时产生强烈的化学发光。由此能够推断，高锰酸钾 亚硫酸钠 氢化可的松体系的发光体可能为激发态的二氧化硫，整个机理能够表示为：MnO-4+Hd+H+ 1O2（1g）+Mn（-）+产物1O2（1g） + Na2SO3 S2O2-6S2O2-6 SO2-4+ SO*2SO*2 SO2+ h【参考文献】 1Yuko
13、 RN, Per OE. Determination of corticosteroids in tissue samples by liquid chromatography tandem mass spectrometry J. J Pharm Biomed Anal, 2005, 37（2）:341 350.2Hjkov R, Solich P, Dvork J, et al. Simultaneous determination of methylparaben, ropylparaben, hydrocortisone acetate and its degradation prod
14、ucts in a topical cream by RP HPLC J. J Pharm Biomed Anal, 2003, 32（5）:921 927.3Grippa E, Santini L, Castellano G, et al. Simultaneous determination of hydrocortisone, dexamethasone, indomethacin, phenylbutazone and oxyphenbutazone in equine serum by high performance liquid chromatography J. J Chrom
15、atogr B, 2000, 738（1）:17 25.4张顺国，陈敏玲，唐跃年. 高效液相色谱法测定尿中氢化可的松和6 羟基氢化可的松的含量 J. 中国医院药学杂志, 2004, 24（12）:733 735.5单萍萍，申国庆. 高效液相色谱法测定复方联苯苄唑搽剂中联苯苄唑和氢化可的松的含量 J. 江苏药学与临床研究, 2006, 14（1）:26 28.6杜静, 傅应华. 离子对反相高效液相色谱法同时测定复方氟脲嘧啶二甲亚砜溶液中氟脲嘧啶和氢化可的松的含量 J. 中国现代应用药学杂志, 2005, 22（2）:163 165.7Lemus Gallego JM, Prez Arroyo J
16、. Spectrophotometric determination of hydrocortisone, nystatin and oxytetracycline in synthetic and pharmaceutical preparations based on various univariate and multivariate methods J. Anal Chim Acta, 2002, 460（1）:85 97.8李小军, 王永桂. 分光光度法测定氯霉素氢化可的松滴耳液中氢化可的松的含量 J. 中国药事, 2004, 18（3）:179 180.9刘菁. 双波长分光光度法
17、测定氯可滴耳液中氢化可的松含量 J. 中国药师, 2001, 4（4）:306 307.10高新富，王玉，张循格，等. 三波长分光光度法测定氢化可得松软膏的含量J. 药品检测, 1999, 8（7）:48 49.11林宇星，郑璇. 卡尔曼滤波分光光度法测定口康含漱液中3组分的含量 J. 海峡药学, 2000, 12（4）:38 40.12姜明燕，沈君，张家林，等. 紫外分光光度法测定复方马来酸氯苯那敏酊中两组分含量 J. 中国药学杂志, 1997, 32（7）:426 427.13胡道德，辛维兰. 旋光法测定复氢霜中氢化可的松的含量 J. 华西药学杂志, 1998, 13（3）:196 197
18、.14张赛男. 旋光法测定氢化可的松二甲基亚砜溶液中氢化可的松 J. 海峡药学, 1997, 9（3）:53 54.15张艳，茅志安，汪建民，等. 褶合光谱法测定复方氧氟沙星滴耳液含量 J. 药学实践杂志, 1999, 17（1）:40 42.16刘世军，杨樊辉，张建成，等. 褶合光谱法测定氢化可的松麻黄碱滴鼻液中氢化可的松和盐酸麻黄碱的含量 J. 武警医学, 2004, 15（6）:419 421.17饶志明，吴秋莲，谢国平，等. 流动注射化学发光测定盐酸普萘洛尔 J. 分析化学, 2004, 32（12）:1660 1662.18范顺利，吴志皓，张磊，等. 多巴酚丁胺的流动注射化学发光法测定 J. 分析测试学报, 2003, 22（2）:87 89.19韩小年，唐玉海，于春玲，等. 流动注射化学发光法测定吩噻嗪类药物 J. 西安交通大学学报（医学版）, 2005, 26（6）:611 613.20范顺利，李薇，林金明，等. 反相流动注射 化学发光法测定氢化可的松 J. 分析化学, 2004, 32（11）:1421 1425.21国家药典委员会编. 中华人民共和国药典（二部） M. 北京: 化学工业出版社, 2005:404.22张志洁, 壮亚峰, 鞠熀先. 阿西美辛在高锰酸钾 亚硫酸钠体系中的流动注射化学发光分析 J. 药学学报, 2004, 39（11）:925 928.
