1、 出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶 管与瓶身相连接， 其目的是防止空气中微生物的污染。 开口向下的目的是有利 于二氧化碳的排出。使用该装置制酒时，应该关闭充气口 ; 制醋时，应该充气 口连接气泵，输入氧气。课题 2 腐乳的制作1、多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主 要作用的是毛霉。 毛霉是一种丝状真菌。 代谢类型是异养需氧型。 生殖方式是 孢子生殖。营腐生生活。2、原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽 和氨基酸 ; 脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。3、实验流程：让豆腐上长出毛霉加盐腌制加卤汤装瓶密封腌制4、酿造腐乳的主
2、要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。前期发酵的主要作用：（1）创造条件让毛霉生长。（2）使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。后期发酵主要是酶与微生物协同 参与生化反应的过程。通过各种辅料与酶的缓解作用，生成腐乳的香气。5、将豆腐切成 3cm 3cm1cm的若干块。所用豆腐的含水量为 70%左右，水 分过多则腐乳不易成形。 * 水分测定方法如下：精确称取经研钵研磨成糊状的 样品 510g（精确到 0.02mg），置于已知重量的蒸发皿中， 均匀摊平后，在100 105电热干燥箱内干燥 4h，取出后置于干燥器内冷却至室温后称重，然后再 烘 30min ，直至所称重量不变为止。样品水分含量 （%）
3、计算公式如下：（烘干前容器和样品质量 - 烘干后容器和样品质量 ）/ 烘干前样品质量毛霉的生 长：条件：将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的控制在 1518，并保持一 定的温度。来源： 1. 来自空气中的毛霉孢子， 2. 直接接种优良毛霉菌种时间：5天加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中， 同时逐层加盐， 随着层数的加高 而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。加盐腌制的时间约为 8 天左右用盐腌制时，注意控制盐的用量： 盐的浓度过低， 不足以抑制微生物的生长可 能导致豆腐腐败变质 ; 盐的浓度过高会影响腐乳的口味食盐的作用：（1）抑制微生物的生长，避免腐败变质（2）析出水分，是豆腐变
4、硬，在后期制作过程中不易酥烂（3）调味作用，给腐乳以必要的咸味（4）浸提毛酶菌丝上的蛋白酶。配制卤汤：卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。卤汤是由酒及各种香辛料配 制而成的。卤汤中酒的含量一般控制在 12%左右。酒的作用：（1）防止杂菌污染以防腐（2）与有机酸结合形成酯，赋予腐乳风味（3）酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系， 酒精含量越高， 对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长 ; 酒精含量过低，蛋白酶的活 性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。香辛料的作用：（1）调味作用（ 2）杀菌防腐作用（ 3）参与并促进发酵过程防止杂菌污染：1用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗
5、刷干净后要用沸水消毒。2装瓶时，操作要迅速小心。整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶 口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。课题 3 制作泡菜制作泡菜所用微生物是乳酸菌，其代谢类型是异养厌氧型。在无氧条件下， 降糖分解为乳酸。分裂方式是二分裂。反应式为：C6H12O62C3H6O能3+量含抗生素牛奶不能生产酸奶的原因是抗生素杀死乳酸菌。 常见的乳酸菌有乳酸 链球菌和乳酸杆菌。乳酸杆菌常用于生产酸奶。亚硝酸盐为白色粉末，易溶于水，在食品生产中用作食品添加剂。膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，国家规定肉制品中不超过 30mg/kg，酱腌菜中不超过 20mg/kg，婴
6、儿奶粉中不超过 2mg/kg。亚硝酸盐被 吸收后随尿液排出体外，但在适宜 pH、温度和一定微生物作用下形成致癌物 质亚硝胺。一般在腌制 10 天后亚硝酸盐含量开始降低，故在 10 天之后食用最好*测定亚硝酸盐含量的原理是在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发 生重氮化反应后，与 N-1- 萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料，与已知 浓度的标准显色液目测比较，估算泡菜中亚硝酸盐含量。2专题二微生物的培养与应用课题 1 微生物的实验室培养培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求， 配制出供其生长繁殖的营 养基质，是进行微生物培养的物质基础。培养基按照物理性质可分为液体培养基半固体培养基和固
7、体培养基。 在液体 培养基中加入凝固剂琼脂 （ 是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作 凝固剂 ）后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成液体培养基应用于工 半固体培养基则常用肉眼可见的菌落。 根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。 业或生活生产， 固体培养基应用于微生物的分离和鉴定， 于观察微生物的运动及菌种保藏等。按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。 合成培养基是用成分 已知的化学物质配制而成， 其中成分的种类比例明确， 常用于微生物的分离鉴 定。天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成， 常用于实际工业生产。按照培养基的用途， 可将培养基分为选择培养
8、基和鉴定培养基。 选择培养基 是指在培养基中加入某种化学物质， 以抑制不需要的微生物生长， 促进所需要 的微生物的生长。 鉴别培养基是根据微生物的特点， 在培养基中加入某种指示 剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。碳源： 能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如 CO2、NaHCO3等无机碳源 ; 糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不 能作为碳源。氮源： 能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如 N2、NH3、 NO3-、 NH4+（无 机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨 （有机氮源 ）等。
9、只有固氮微 生物才能利用 N2。培养基还要满足微生物生长对 pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如， 培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的 pH调至酸性，培养细菌是需要将 pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需 要提供无氧的条件无菌技术获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几 个方面：1对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。2将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。3为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。4实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 无菌技术除了用来防止实验室的培
10、养物被其他外来微生物污染外， 还有什么目 的?答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。消毒与灭菌的区别消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体 有害的微生物 （不包括芽孢和孢子 ）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法 （对 于一些不耐高温的液体 ）还有化学药剂 （ 如酒精、氯气、石炭酸等 ） 消毒、紫外 线消毒。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢 子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。灭菌方法：1接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法 ;2玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ;3培养基、无菌水等使
11、用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯比较项比理化因素的作 用强度消灭微生物的数 量芽孢和孢子能否 被消灭消毒较为温和部分生活状态的 微生物不能灭菌强烈全部微生物能制作牛肉膏蛋白胨固体培养基（1） 方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。（2） 倒平板操作的步骤：1将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上， 右手拿装有培养基的锥形瓶， 左手 拔出棉塞。2右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。3用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙， 右手将锥形瓶中 的培养基（约 1020mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。4等待平板冷却凝
12、固，大约需 510min。然后，将平板倒过来放置，使培养 皿盖在下、皿底在上。倒平板操作的讨论1.培养基灭菌后，需要冷却到 50左右时，才能用来倒平板。你用什么办法 来估计培 养基 的温度 ?提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶， 感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫 手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰 ? 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置 ?平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高， 将平板倒置， 既可以使培养基表面的水分更好地挥发， 又可以防止皿盖上的水 珠落入培 养基， 造成污染。4.在倒平板的过
13、程中， 如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位， 这个 平板还能用来培养微生物吗 ?为什么 ?空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生， 因此最好不要用 这个平板培养微生物。纯化大肠杆菌（1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。（2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集 的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。 在数次划线后培养， 可以分离到由一个 细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。（3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌 液分别涂布到琼脂固体培养基的表面， 进行培养。分为系列稀释操作和涂布平 板操
14、作两步。（4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分 散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。（5）平板划线法操作步骤：1将接种环放在火焰上灼烧， 直到接种环烧红。 在火焰旁冷却接种环， 并打 开棉塞。3将试管口通过火焰。将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。5将试管通过火焰， 并塞上棉塞。 左手将皿盖打开一条缝隙， 右手将沾有菌 种的接种环迅速伸入平板内， 划三至五条平行线， 盖上皿盖。 注意不要划破培 养皿。灼烧接种环， 待其冷却后， 从第一区域划线的末端开始往第二区域内 划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划
15、线 与第一区相连。将平板倒置放入培养箱中培养。平板划线操作的讨论1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环 ?在划线操作结束 时，仍然需要灼烧接种环吗 ?操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养 物; 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后， 接种环上残留的菌种， 使下一次划线时， 接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端， 从而通过划线 次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少， 以便得到菌落。 划线结束后 灼烧接种环， 能及时杀死接种环上残留的菌种， 避免细菌污染环境和感染操作 者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线 ?以免接种环温
16、度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时， 为什么总是从上一次划线的末端开始划 线?划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少， 每次从上一次划线的末 端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少， 最终能得到由单个 细菌繁殖而来的菌落。（6）涂布平板操作的步骤：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。取少量菌液，滴加到培养基表面。将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却 8 10s4用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面 涂布平板操作的讨论涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。 结合平板划线与系列稀释的无菌操 作要求，想一想，第 2 步应如何进行无菌操作 ?应从操作的各个
17、细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合 适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围 ; 等等。菌种的保存（1） 对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。1临时保藏方法将菌种接种到试管的固体斜面培养基上， 在合适的温度下培养。 当菌落长成后， 将试管放入 4的冰箱中保藏。以后每 36 个月，都要重新将菌种从旧的培 养基上转移到新鲜的培养基上。2缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。在 3mL的甘油瓶中，装入 1mL甘油后灭菌。将 1mL培养的菌液转移到甘油瓶中， 与甘油充分混匀后，放在 -20 的冷
18、冻箱中保存。课题 2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数尿素是一种重要的农业氮肥， 尿素并不能直接被农作物吸收。 只有当土壤中的 细菌将尿素分解成氨之后， 才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素， 是因为他们能合成脲酶尿素最初是从人的尿液中发现的筛选菌株（1） 实验室中微生物的筛选应用的原理人为提供有利于目的菌株生长的条件 （包括营养、温度、 pH等） ，同时抑制或 阻止其他微生物生长。（2） 选择性培 养基在微生物学中， 将允许特定种类的微生物生长， 同时抑制或阻止其他种类微生 物生长的培养基，称作选择培 养基。（3）配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到
19、选择的目的。例如， 培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物 ; 培养基中不加入氮元素，可 以选择培养能固氮的微生物 ; 加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌 统计菌落数目（1） 测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。（2） 稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的稀释度足够高时， 培养基表面生长的一个菌落， 来源于样品稀释液中 的一个活菌。 通过统计平板上的菌落数， 就能推测出样品中大约含有多少活细 菌。为了保证结果准确，一般设置 35 个平板，选择菌落数在 30300的平 板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此， 统 计结果一般用
20、菌落数而不是活菌数来表示。采用此方法的注意事项：（1）一般选取菌落数在 30300 之间的平板进行计数（2）为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入 TTC3 . 本法仅限于形 成菌落的微生物设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响， 提高实验 结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外， 其他条件都相同的实验， 其作用是比照试验组， 排除任何其他可能原因的干扰， 证明确实是所测试的条 件引起相应的结果。实验设计 实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及 时间安排等的综合考虑和安排。（1） 土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生
21、物，数量最大， 种类最多。 在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、 pH 7 的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约 38cm的土壤层取样。（2） 样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际 操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在 30300之间、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量，一般选用 104 105 106 测定放线菌的数量，一般选用 103 104 105 测定真菌的数量，一般选用 102 103 104（3）微生物的培养与观察 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌 3037 12 天 放线
22、菌 252857天霉菌 252834 天 每隔 24 小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样 可以防止因培养时间不足而导致一楼菌落的数目。 一般来说，在一定的培养条 件下（ 相同的培养基、唯独及培养时间 ） ，同种微生物表现出稳定的菌落特征。 形状、大小、隆起程度、颜色 课题 3 分解纤维素的微生物的分离 纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物， 是地球上含量最丰富的 多糖类物质。纤维素与纤维素酶（1） 棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤 维素。（2） 纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即 C1 酶、CX酶 和葡萄糖苷
23、酶， 前两种酶使纤维素分解成纤维二糖， 第三种酶将纤维二糖分解 成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。纤维素分解菌的筛选（1） 筛选方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。（2） 刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理刚果红是一种染料， 它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物， 但并 不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。 当我们在含有纤维素的培养基 中加入刚果红时， 刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。 当纤维素被 纤维素酶分解后，刚果红 - 纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤 维素分解菌为中心的透明圈。 这样，我们就可以通过是否
24、产生透明圈来筛选纤 维素分解菌。分离分解纤维素的微生物的实验流程土壤取样选择培养 （ 此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确 定） 梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明 圈的菌落（1） 土壤采集选择富含纤维素的环境。（2） 刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤倒平板操作、制备菌悬液、涂布平 板（3）刚果红染色法种类一种是先培养微生物， 再加入刚果红进行颜色反应， 另一种是在倒平板时就加 入刚果红。专题六植物有效成分的提取6.1 植物芳香油的提取 天然香料的主要来源是植物和动物。 动物香料主要来源于麝、 灵猫、海狸和抹 香鲸等。不同植物的根、茎、叶、花、果实、种子都
25、可以提取芳香油。植物芳 香油具有很强的挥发性，主要包括萜类化合物及其衍生物。提取方法有蒸馏、 压榨、萃取等，具体采用哪种方法要根据植物原料的特点来决定。1、玫瑰精油的提取 1）玫瑰精油化学性质稳定， 难溶于水，易溶于有机溶剂， 能随水蒸气一同蒸馏， 可用水中蒸馏法提取。2）提取玫瑰精油的实验流程：1鲜玫瑰花+清水：采集盛花期 （5 月中上旬）的玫瑰花，清水清洗沥干 ;称取 50g 玫瑰花放入蒸馏瓶，添加 200mL蒸馏水。2水蒸气蒸馏：温度不要太高，最好延长蒸馏时间， 控制蒸馏时间和速度为 12 滴 / 秒，可以保证品质。3油水混合物：获得乳白色乳浊液。4分离油层：向乳浊液加入 0.1g/mL
26、 NaCl 溶液后，促使油和水的分离，利用 分液漏斗分离出上面的油层。5除去水分：向油层中加入无水硫酸钠吸收油层中的水分， 24h 后过滤，得到 玫瑰油。2、橘皮精油的提取1） 橘皮精油的主要成分为柠檬烯， 主要分布在橘皮中， 由于橘皮精油的有效成 分在用水蒸气蒸馏时会发生部分水解， 使用水中蒸馏法又会产生原料焦糊的问 题，所以一般用萃取法。2）提取橘皮精油的实验流程：石灰水浸泡：新鲜橘皮含大量的果蜡、果胶和水分，将其干燥去水，并用石 灰水浸泡，可以提高出油率，并防止压榨时滑脱，降低压榨液黏稠度，过滤不 堵塞筛眼。2漂洗：浸泡好的橘皮用流水彻底漂洗干净，沥干。3压榨：将橘皮粉碎，加入相当于橘皮
27、质量 0.25%小苏打和 5%硫酸钠后 （ 促进 油和水的分离 ） ，用压榨机压榨得到压榨液。4过滤：用布袋过滤除去固体物和残渣， 滤液再高速离心处理除去质量较小的 固体残留物，再用分液漏斗或吸管分离出上层橘皮油。5静置：将橘皮油在 5 10冰箱中静置 57d，使杂质沉淀，分离出上层澄 清橘皮油。6再次过滤： 将下层橘皮油用滤纸过滤， 滤液与上层橘皮油合并， 得到最终橘 皮精油。6.2 胡萝卜素的提取 胡萝卜素为橘黄色结晶，化学性质比较稳定，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于 石油醚等有机溶剂。依据碳碳双键的数目可以划分为 、三类，其中最 主要的组成成分为 - 胡萝卜素。提取胡萝卜素的实验流程粉碎：
28、使原料与有机溶剂充分接触，增大溶解度。干燥：脱水温度太高，干燥时间太长会导致胡萝卜素分解。3萃取：避免明火加热，采用水浴加热，防止有机溶剂燃烧和爆炸。为防止加 热时有机溶剂挥发，还要在加热瓶口安装回流冷凝装置。除去萃取液中的不溶物。5浓缩：用蒸馏装置加热使有机溶剂挥发，剩下的即为浓缩的胡萝卜素。植物有效成分提取的方法比较：提取方法实验原理方法步骤适用范围水 蒸 气 蒸 馏利用水蒸气将 挥发性较强的 芳香油携带出 来1. 水蒸气蒸馏2. 分离油层 3. 除水过滤适用于提取玫瑰油、 薄荷油等挥发性强 的芳香油压 榨 法通过机械加压， 压榨出果皮中 的芳香油1. 石灰水浸泡、漂洗 2.压榨、过 适用于柑橘、柠檬等 滤、静置 3. 再次 易焦糊原料的提取过滤1.粉碎、干燥 2.萃取、过滤 3.浓缩有机 使芳香油溶解 溶 在有机溶剂中， 剂 蒸发溶剂后就 萃 可获得芳香油 取适用范围广，要求原料的颗粒要尽
