1、根管实验设计方案油脂是人类饮食的必需品, 年人均约食用25 kg油脂, 其中80%为大豆(Glycine max)、油菜(Brassicacampestris) 、向日葵 (Helianthus annuus) 、油棕(Elaeis gunieensis)和棉花(Gossypium sp.)等油料作物的种子油(http:/www.ers.usda.gov/Briefing/Soyb-eansOilCrops/)。植物种子油不仅为人类提供了基本的脂肪酸营养, 而且还具有保健功效和医药价值, 同时也是重要的工业原料和可再生资源。大田栽培的普通油料作物种子油的主要成分包括棕榈酸(C16:0)、硬脂酸
2、(C18:0)、油酸(C18:19)、亚油酸(C18:29,12)和亚麻酸(C18:39,12,15)。此外, 其它油料植物及一些野生植物的种子能够高水平合成并积累一些具有重要价值的稀有脂肪酸。例如, 蓖麻(Ricinus com-munis)种子含有90%的蓖麻油酸(C18:19, 12-OH),油桐(Vernicia fordii)种子含有80%的桐油酸(C18:39trans,10trans,12cis)。加利福尼亚月桂树(Umbe-llularia californica)种子油中含有大约60%的月桂酸(C12:0)。据报道源于植物的脂肪酸多达200多种(vande Loo et al
3、., 1993)。脂肪酸的碳链长度、双键数目及位置决定着脂肪酸的理化性质、烹饪特性及对人类健康的影响(刘立侠等, 2005; 石娟等, 2007)。因此, 不同用途的脂肪酸要求不同的碳链长度和双键数目(刘立侠等, 2005;石娟等, 2007)。油料作物的种子油通常需经过一系列昂贵的加工过程, 才能符合食用要求, 但在种子油的加工过程中会产生一些对人体有害的反式脂肪酸和氢化脂肪酸。近年来, 为提高种子油的食用、医用和工业用价值以及便于加工和制作各种不同用途的植物油脂产品, 培育富含单一脂肪酸植物种子油的新种质(品种)已成为油料作物遗传改良和植物油脂代谢工程的一个新的热点研究领域(吴永美等, 2
4、004; 刘立侠等, 2005; 岳爱琴等, 2007; 戴晓峰等, 2007;Damude and Kinney, 2008; Dyer and Mullen,2008)植物生理与分子生物学学报33卷SUCrOSG图1种子油的生物合成Fig1BiosynthesisPathwayofstorage0115indeveloPingseedsER,endoPlas而eretieulum:3GPA,3一PhosPhoglyeericacid:PEP,PhosPhoenolPyruvate:即r,Pyruvicaeid:PDH,Pyruvatedehydrogenase:ACC,acetyl一CoA
5、carboxylase:KASlll,3一ketoacyl一ACPsynthase111;KASI,3一ketoaeyl一ACPsynthase;KASll,3一ketoacyl一ACPsynthase11:一gD,dissolubilestearyl一ACPdesaturase;TE,thioesterase:FatB,aeyl一ACPthioesteraseB:FatA,aeyl一ACPthioesteraseA:AT,aeyltransferase:FadZ,fattyaciddesaturaseZ:Fad3,fattyaeiddesaturase3:G3P,glyeerol一3一Pho
6、sPhate;GPAT,glycerol3一PhosPhateaeyltransferase:LPA,lysoPhosPhatidieaeid:LPAT,lysoPhosPhatidieaeidaeyltransferase;PA,PhosPhatidieacid:PAP,PhosPhatidieacidPhosPhatase:DAG,diacylglyeerol:DGAT,diacylglyeerolaeyltransferase:TAG,triaeylglyeerol质体中脂肪酸合成酶复合体的3种主要酶分子是酮脂酞一ACP合成酶(KAS)(Ohlrogge和Browse1995)。酮脂酞一
7、ACP合成酶111(KASlll)催化丙二酞-CoA和乙酞一CoA最初聚合成3一酮丁酞一ACP(4C侧链)的反应。酮脂酞一ACP合成酶I(KASI)催化正在加长的酞基侧链与丙二酞一ACP聚合生成6C一16C脂肪酸。酮脂酞一ACP合成酶n(KASll)催化丙二酞-ACP与16:0一ACP的缩合生成18C脂肪酸,从而在决定16C与18C脂肪酸合成比例中起重要作用。因此KASll是脂肪酸代谢工程的重要靶标分子之一。另一种重要的酶是硫酷酶(小ioesterase,TE)。犯能把正在延长的脂肪酸基侧链从ACP分子上解离下来,从而终止脂肪酸碳链的延长,这就导致某些植物(如,椰子)种子油中积累了大量的短链(
8、SC)和中等链长(8一14C)的脂肪酸。在质体中合成的16:0一ACP代谢有不同分支。这些不同途径对种子油中脂肪酸组成有重要影响。例如,在棕搁种子中,硫脂酶FatB将16C脂肪酸侧链从ACP上切割下来,使大量的16C脂肪酸(即棕搁酸)游离出来。因而棕桐种子油中棕搁酸含量高。16:0一ACP也可以在KASll作用下延长成18:0一ACP(即硬脂酞一ACP)。硬脂酞基在另一种硫酷酶FatA作用下从AcP上分离,生成硬脂酸(1SC)。硬脂酞基-ACP也可在可溶性硬脂酸基一ACP去饱和酶(一gD)的作用下,在第9与第10个碳原子之间形成一个双键,即形成油酞一ACP(18:lgcis)。再在FatA作用
9、6期岳爱琴等:食用植物油脂的代谢工程下,油酞基团从ACP分子上分离而成为油酸(18:1gcis)。油酸可以在位于内质网的酶作用下,进一步去饱和反应,从而生成其他不饱和脂肪酸。由此可见,FatB、KASll、FatA和杏gD等酶活性高低对种子油中饱和与不饱和脂肪酸的含量起着重要作用。在质体中合成的16:0一、18:0一和18:1gcis-ACP,经不同硫酷酶(TE)催化分别生成16:0、18:O和18:19015,接着与位于质体外膜上的CoA结合,形成16:O一、18:O一和18:lgeis一CoA。这些脂肪酞基一COA从质体经细胞质转运到内质网,用于合成甘油脂。首先,在3一磷酸甘油酞基转移酶(
10、GPAT)和溶血性磷脂酸酞基酶(LPAT)分别作用下,脂肪酸碳链从各种脂肪酞基一CoA分子上转移到3一磷酸甘油(3PG)的sn一l和sn一2位置上,从而生成磷脂酸(PA)。然后,PA分子上、n一3位的磷酸基被磷脂酸磷酸酶(PAP)切除后就形成二酞甘油酷(DAG)。最后,在二酞甘油脂转移酶(DGAT)作用下,DAG的sn一3位置上发生酞基化(即结合一个脂肪酸碳链),形成三酞基甘油酷(TAG)。新近发现了另一条不依赖于乙酞辅酶A的TAG合成途径,即在磷脂二酞甘油醋转移酶(PDAT)的催化作用下,脂酞基直接从磷脂酞胆碱(PC)转移至DAG,从而合成TAG,而没有经中间产物CoA(Stahl等2004
11、)。目前提高种子中TAG积累的水平,即种子含油量的分子操作的主要靶标是TAG合成的最后一步反应(Lung和weselake2006)。除DGAT和PDAT外,DGATZ和DGTA(diaeylglyeeroltransaeylase)亦催化TAG合成,对种子含油量有较大贡献(Li等2005)。另外,在内质网上,脂肪酸还能进行多种修饰反应。例如,油酸(18:1gcis)可在脂肪酸去饱和酶2和3(FADZ和FAD3)依次催化下,碳链中生成新的双键,依次形成亚油酸(18:2geis,12cis)和亚麻酸(18:3geis,12cis,15cis)。这些经修饰过的脂肪酸最终也整合到TAG分子中,积累于
12、油体。在所有主要油料作物种子油中正是队DZ和FAD3相对活性的高低决定着所有主要油料作物种子油中多不饱和脂肪酸所占的比例。因此近年来编码这些酶的基因已经成为种子油中不饱和脂肪酸含量遗传改良的主要靶分子。TAG是疏水性的,聚集在内质网脂质双层膜结构的脂酞基区域。内质网膜中高含量的TAG可以在脂质双层结构中形成“脂质凸起”,并且从膜中分离出来;油脂外由单层磷脂膜包裹,即以油体形式从膜上分离出来。这些贮藏TAG的亚细胞结构或油体,一般直径为l“m,由许多结构蛋白包被,称为油质体。2应用代谢工程改良食用植物油营养价值的策略植物种子油一般是多种脂肪酸甘油酷的混合物,它的理化特性和营养品质主要取决于其脂肪
13、酸的组成。为提高植物油脂的营养价值和适合于烹调及食品工业应用,调控植物种子油中目标脂肪酸的比例己成为脂肪酸代谢工程改良的主攻目标,且己取得了可商业化利用的成果。目前应用代谢工程对植物种子油及脂肪酸进行遗传改良主要有两种策略。其一是在植物种子中,超表达或沉默靶基因以达到提高种子中目标脂肪酸的含量。例如应用RNA干涉(RNAinterference,RNAi)、共抑制(eo一suppression)、转录后基因沉默(post一trans-eriptionalgenesilencing,pTGS)以及反义RNA等技术阻断目标基因的表达(范圣此等2004)和应用种子特异表达启动子驱动目标基因在种子中的
14、过量表达。其二是将来自其他物种的靶基因或一个完整的脂肪酸合成途径导入大田油料作物,从而使种子高水平积累新的脂肪酸,创造出对人类健康更有益的食用植物油。植物油脂改良现今应用较多的遗传转化方法是根癌农杆菌介导法和基因枪法。简便易行的花粉粒介导法也成功地应用于油菜遗传转化(杜春芳等2006),在经攫步优化后可用于其他油料作物的油脂品质改良。2.1超表达或沉默靶基因以提高种子油中目标脂肪酸含量高油酸种子油与亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)相比,油酸(18:1)是一种单不饱和脂肪酸,稳定性高,能降低人体有害胆固醇(LDL)含量和维持人体有益胆固醇(HDL)的水平。富含油酸的食用油可用于长时间的保存
15、和高温烹调而不易氧化变质。普通油料作物种子油中油酸含量较低(25%,甚至可高达50%以上。催化油酸转变为亚油酸的关键酶是杏12脂肪酸去饱和酶/脱氢酶植物生理与分子生物学学报33卷(又称FAD2)。迄今己分离到10多种植物杏12脂肪酸去饱和酶的。DNA克隆。代谢工程提高种子油中油酸含量的技术策略主要是通过抑制FADZ酶的活性,从而使油酸含量增加,亚油酸含量降低。应用共抑制技术使得大豆FADZ一1酶基因不表达,即沉默,所培育的转基因大豆的种子油中油酸含量高达56%,而亚油酸含量低到一%(Kinney1996a;Kinney等1998)。采用核酶介导的终止转录技术阻断大豆FADZ一1酶基因在种子中的
16、表达,亦使大豆油中油酸含量提高到85%以上(Buh:等2002)。同样,应用抑制FADZ酶活性的技术策略,也在创育高油酸含量的油菜(Kinney1996a)、棉花(Liu等2002)和拟南芥(Stoutjesdijk等2002)上获得成功。我们实验室通过对转录因子锌指蛋白进行分析设计,使它能特异地结合大豆FADZ一1酶基因靶序列,关闭该基因表达,获得了大豆种子高油酸积累的转基因植株(吴永美等2004)。经基因修饰所培育的高油酸大豆在北美己经商业化。高硬脂酸种子油植物种子油中的硬脂酸(18:0),是一种重要的饱和脂肪酸。食用硬脂酸不会提高血液中低密度脂蛋白胆固醇的含量,而且可以降低血液中总胆固醇
17、的含量(JoneS等1999)。多数油料作物种子油中硬脂酸含量较低(l%一4%),不能满足食品工业中使用的需要。应用代谢工程技术对油菜(Hawkins和知dl1998)和棉花(Liu等2002)等作物种子硬脂酸含量提高的改良己获成功。增加种子油中硬脂酸含量的主要技术策略是提高种子发育过程中从棕搁酸(16:0)生成硬脂酸的代谢通量。如图1所示,以下几种酶可以作为基因操作的分子靶标来提高植物油中硬脂酸的含量。(l)抑制FatB硫脂酶的活性,阻止16:0一ACP的切割;(2)增加酮脂酞一ACP合成酶H(KASll)的活性,促进16:0一AeP生成18:0一ACP;(3)增加FatA硫酷酶的活性,促使
18、18:O从ACP上分离下来,从而阻止其在硬脂酸一ACP去饱和酶(一9脂肪酸去饱和酶)的作用下发生去饱和反应;(4)抑制杏9脂肪酸去饱和酶的活性,阻止18:0一ACP转变成18:1一ACP。上述每一种基因操作都是以促进棕搁酸转化成硬脂酸,或阻止油酞一ACP进一步去饱和反应,从而增加硬脂酸积累。然而,对于一个靶标作物,究竟采用哪一种代谢工程策略,则要依赖于该作物脂肪酸合成代谢途径中经由这些不同代谢步骤的脂肪酸相对流通量的大小。超表达酮脂酞一ACP合成酶川KASll)可小幅度提高种子油中硬脂酸含量(Kinney1996b)。然而,增加FatA硫酷酶活性则能显著提高硬脂酸含量。例如,山竹果(Garci
19、niamangostana)是一种硬脂酸含量高达56%的热带果实(Padzey等2994)。把它的FatA硫醋酶基因转移至油菜使其在种子中超表达,油菜中的FatA硫酷酶活性明显增高,转基因油菜种子油中硬脂酸含量从2%提高到22%(HawkinS和Kridl1998)。应用DNA定点突变技术,对该FatA基因进行修饰,使该酶催化硬脂酸一ACP合成的活性提高了13倍。超表达该突变FatA基因的植物种子油中硬脂酸含量比表达该野生型酶基因植物高出70%(Fa。iotti等1999)。目前,硬脂酸含量最高的转基因植物是通过降低硬脂酸一ACP去饱和酶活性所获得的。例如,应用RNA干涉或反义抑制技术沉默棉花
20、或油菜种子中硬脂酸一ACP去饱和酶的mRNA表达,可使硬脂酸含量增加2%科O%(Knutzon等1999:Liu等2002)。Keidi(2002)培育的转基因大豆种子油中硬脂酸含量高达53%,该转基因系的油酸含量也高,而亚油酸和亚麻酸含量极低。高软脂酸种子油棕搁是世界上第二大油料作物,其种子油称为棕搁油,含有高达44%的软脂酸(棕搁酸)(16:0)。可可树的种子油,通常称作可可黄油,是另一种具有高饱和脂肪酸含量的植物油(种子油含25%软脂酸)(Padley等1994),这些种子油多专用于食品制作等工业,包括油酥、糖果点心和肥皂。为了取代来源于可可树或棕搁树的具有高饱和脂肪酸含量的植物油脂,应
21、用代谢工程技术通过对相关酶活性的修饰,可使普通油料作物种子合成和积累高含量的软脂酸。例如,通过抑制酮脂酚一ACP合成酶n(KASll)基因和增加FatB硫脂酶基因的表达,已使大豆种子油中软脂酸含量从10%提高到50%(Kinney等1998)。高棕搁油酸种子油棕桐油酸(16:19)具有重要的营养、医药和工业用价值。因此提高种子油中棕搁油酸含量也是脂肪酸代谢工程的一个靶标。wang等(1996)报告,在番茄中表达酵母杏9脱氢酶基因可大幅提高棕搁油酸含量。大豆含有55%亚油酸和巧%棕桐酸,如能将这些脂肪酸转换成棕搁油酸,食用植物油脂的代谢工程岳爱琴,孙希平,李润植山西农业人学农业生物I几程研究中心
22、,太谷030801摘要:植物种子油可提供人类营养所需的多种脂肪酸,也是工业用油的原料之一。文章结合我们对植物种子发育、脂肪酸生物合成途径和大豆油脂遗传改良的研究,重点论述参与脂肪酸合成及其调控的一些关键酶的基因、代谢工程改良植物油脂营养价值的技术策略及其研究进展,分析目前应用油料作物种子作为“生物反应器”规模化生产有重要营养价值和特殊用途的脂肪酸的问题及技术。瓶颈”,讨论未来植物脂肪酸代谢工程主攻方向以及在培育可再生资源和推动人类社会及经济可持续发展中的应用前景。值的技术策略及其研究进展。关键词:脂肪酸;种子油;代谢工程;油料作物;营养价值中图分类号:Q945大豆、油菜、向日葵、油棕、棉籽和花
23、生等油料作物成熟种子中所含的油脂(种子油)是人类食用油的主要来源。现今,约85%的植物油用于人类的食用。种子油不仅可为人类提供基本的脂肪酸营养,还具有保健功效和医药价值。油料作物种子油的主要成分是棕搁酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:l)、亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)。脂肪酸碳链的长度、双键数目及位置决定着脂肪酸的理化性质、烹饪特性和对人类健康的影响。因此,不同用途对脂肪酸要求不同的碳链长度和双键数。对油料作物的种子油通常要经过一系列昂贵的加工过程,才能符合食用的要求。基因组学和代谢物组学的发展极大地促进了对植物种子油和脂肪酸合成及代谢调控的研究,已成功分离到一些参与种
24、子油及脂肪酸生物合成的基因。应用代谢工程技术对油料作物种子油脂肪酸组成及其含量的改良也己取得有应用价值的成果。结合我们对植物种子发育与脂肪酸生物合成途径和大豆品质遗传改良的研究结果(张莉等2004;吴永美等2004;岳爱琴等2005;Li等2005;杜春芳等2006),本文重点论述参与脂肪酸合成及其调控的一些关键酶的基因、用代谢工程改良植物油脂营养价1植物脂肪酸生物合成途径代谢工程的靶标植物油脂代谢工程所修饰的主要靶标是参与种子脂肪酸生物合成的一些酶基因及调控基因。此外,一些并不直接参与种子脂肪酸生物合成的基因,对种子油合成积累也有较大影响,如AM尸I(alteredmeristemprogr
25、amnungl)和材尸S(myo一inositoll一phosphatesynthase)基因亦可作为植物油脂代谢工程的分子靶标(张莉等2004)。图1概括说明了参与种子油脂生物合成的亚细胞结构及其相关的代谢途径和所需的酶分子。质体是发育种子中脂肪酸生物合成的主要场所。蔗糖是脂肪酸碳(C)骨架的最初来源。叶片中合成的蔗糖运输到发育种子细胞中,经一系列生化反应形成丙酮酸(Pyr)。丙酮酸进入质体,在丙酮酸脱氢酶(pDH)催化下生成乙酞辅酶A(aeetyl一CoA),为脂肪酸合成提供了起始的ZC分子。丙酮酸的合成及转入质体中的数量是脂肪酸合成和积累的一个限速步骤。脂肪酸生物合成的第一步反应是乙酞一
26、CoA在乙酞一c0A梭化酶(ACC)的催化下加上一个梭基生成3C分子丙二酞一CoA。接着,在转酞基酶(AT)的作用下,丙二酞基从辅酶A分子转移到酞基载体蛋白(AcP)上,形成丙二酞一AcP。然后,在脂肪酸合成酶(FAS)复合体的作用下,丙二酞一ACP经过多次循环,每次循环使碳链增加2个碳原子,直到饱和脂肪酸链长度达到16(16:0)或18(18:0)个碳原子为止。2007一06一14收到,2007一10一24接受。国家教育部科技重点项目(No.2002一03)和山西省青年科技研究基金项目(Nos.2007021036,2005一039)资助。*通讯作者(E一mail:rli2001hotmai
27、l.eom:Tel:0354一6288374)。6期岳爱琴等:食用植物油脂的代谢工程可极大程度地提高大豆油附加值。Liu等(1996)报道,表达杏9一CoA脱氢酶基因可使大豆棕搁酸的一半转化成棕搁油酸。转杏9一CoA脱氢酶基因大豆体细胞胚中棕搁油酸含量由转基因前的0提高到10%,而棕搁酸含量则从25%降低到5%。我们的实验室从一种食用蘑菇沪leurotu、ostreatus)分离到杏9脱氢酶cDNA克隆,用种子特异启动子驱动杏9脱氢酶基因在大豆体细胞胚中表达,已获得了棕搁油酸含量高达14%的转化体,目前正在筛选棕搁油酸含量高、无抗生素标记和遗传稳定的转基因纯合株系。2.2导入其他物种的基因或一
28、个完整的脂肪酸合成途径从而使种子积累新的脂肪酸软脂酸和硬脂酸双低的种子油正如前面所提到的,通过基因修饰油料作物质体中的脂肪酸代谢途径中一些酶基因,可促进软脂酸或硬脂酸的合成。然而,在某些情况下,例如,为生产低含量饱和脂肪酸的油脂,需要同时减少软脂酸和硬脂酸的含量。在正常代谢情况下,质体中从ACP分离下来的软脂酸和硬脂酸,一般不需要进行去饱和反应,常被认为是终产物。应用代谢工程技术可使软脂酸和硬脂酸在从质体转运出来后进行去饱和反应,从而使种子油中这两种饱和脂肪酸含量均降低。研究发现酵母和哺乳动物细胞内质网中含有作用于软脂酞和硬脂酞一COA底物的杏9去饱和酶。在植物中表达酵母或哺乳动物的杏9去饱和
29、酶可减少饱和脂肪酸,并且增加不饱和脂肪酸含量(Polashoek等1992:Grayburn和Hildebrand1995)。尽管脂肪酸含量的这些变化在叶片组织中最明显,通过对这些基因的进一步修饰,提高这些酶在种子中的特异活性,有望培育出种子油中饱和脂肪酸含量极低的植物新类型(Moom等2000)。富含中链脂肪酸的种子油中链脂肪酸(C8一14)具有独特理化性质,多用于食品和医药业(Fitch-Hanmannl997)。工业上所用中链脂肪酸是由可可油和棕搁油分馏制备而成(Broun等1999)。通过代谢工程使普通大田油料作物种子高水平积累中链脂肪酸则可极大地提高这些中链脂肪酸的工业利用效率。显然
30、,鉴定介导中链脂肪酸合成和积累的酶基因尤为重要。例如,加利福尼亚月桂树(vmbllula:iacallfornisa)种子油中含有大约60%月桂酸(12:0),研究发现控制月桂酸积累的是一种中链脂肪酸特异的FatB硫脂酶(voelker等1992)。将该FatB硫脂酶基因在油菜种子中超表达,可以使种子油中的月桂酸含量高达60%(Voelker等一996)。这种转基因油菜籽已经在北美上市,应用于制造糖果点心等。立体化学分析表明,这些转基因油菜种子油中的月桂酸主要位于TAG的:n一1和:n一3位置,而不出现在、n一2位。但是在可可油中,TAG的3个位置均能结合月桂酸。催化月桂酸结合到TAG的、n一2位点的酶是可可树的溶血性磷酸酞基转移酶(LPAT)。然而,油菜种子中自身的LPAT不能将月桂酸结合到TAG的、n一2位点。将从可可树分离到的LPAT基因导入上述转基因油菜植株,超表达这两种外源基因的油菜种子油中月桂酸含量进一步上升到67%(Knutzon等1999)。尊距花属千屈菜科(Cuphea)植物,其种子油中含有90%中链脂肪酸(8:0和10:0),现已从这些植物中鉴定克隆出控制中链脂肪酸合成的FatB硫脂酶基因(Graham1989)。转基因表达控制中链脂肪酸
