1、基因工程原理复习提纲和答案基因工程原理复习提纲基因工程绪论1、基因工程的定义与特征。定义：在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。特征：1、具跨越天然物种屏障的能力。 2、 强调了确定的DNA片段在新寄主细胞中的扩增。2、试述基因工程的主要研究内容。1）、目的基因的分离2）、DNA的体外重组（载体、受体系统等）3）、重组DNA分子转移到受体细胞及其筛选4）、基因在受体细胞内的扩增、表达、检测及其分析。3、基因工程在食品工业上
2、有何应用发展？主要是通过基因重组，使各种转基因生物提高生产谷氨酸、调味剂、酒类和油类等有机物的产率；或者改良这些有机物组成成分，提高利用价值。4、转基因是一把双刃剑，请客观谈谈对转基因及转基因食品安全性的认识。转基因技术所带来的好处是显而易见的，在人类历史进步和发展中起到了积极作用。首先，通过该项技术可以提供人们所需要的特性，改良培育新品种；第二，延长食品保存时间或增加营养成分；第三，将抗虫防菌基因转入到作物中，使作物本身产生抵抗病虫害侵袭的能力， 减少了农药的使用量，有利于环境保护；第四，转基因技术及基因食物在医学方面得到广泛研究和应用。人们对转基因技术的主要担忧在于环境方面。外源基因的导入
3、可能会造就某种强势生物， 产生新物种或超级杂草、损害非目标生物、破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性，也即转基因生物存在潜在的环境安全问题。转基因作物的大面积种植已有数年， 食用转基因食品的人群至少有10亿之多，但至今仍未有转基因食品对生命造成危害的实例；更何况目前每一种基因工程食品在上市前，都要经过国家法律认可， 食品卫生部门和环境部门的严格检测。只有测试合格了，才能投放市场。因此公众完全可以安全地消费、大胆地食用转基因食品。第一章 DNA的分子特性与利用1、 原核生物和真核生物的基因表达调控有何差别？1）原核基因表达调控的三个水平：转录水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控原核基因
4、表达调控主要是在转录水平上的调控。2）真核生物基因表达的特点： 1基因组DNA存在的形式与原核生物不同； 2真核生物中转录和翻译分开进行； 3基因表达具有细胞特异性或组织特异性； 4真核基因表达的调控在多个水平上进行：DNA水平的调控、转录水平调控、转录后水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控； 2、 什么是基因？根据基因的产物，基因可分为哪三类？基因是具有生物学功能的、在染色体上占据一定位置的一段核苷酸序列，是分子遗传的功能单位。根据基因的产物，基因可分为三类： 转录并翻译编码蛋白质的基因: 包括结构蛋白基因、编码酶的基因、调节基因 转录但不翻译产物的基因: 包括tRNA、rRNA 不
5、转录但有功能的DNA区段: 如启动子、操纵基因B、基因的连续性： 连续基因、断裂基因C、基因的位置相对性： 位置不变的基因、移动基因3、 引起核酸变性的因素主要有哪些？核酸变性后性质有何变化？引起核酸变性的因素：-温度、酸、碱、甲醛和尿素等。DNA变性后，它的一系列性质发生变化，如紫外吸收(260 nm)值升高（增色效应）, 粘度降低等，如DNA增加2540%. RNA约增加1.1%。4、 DNA复性及其影响因素。变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关，也与它本身的组成和结构有关：分子量越大复性越难。
6、浓度越大，复性越容易。（附加：注意：将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。复性的应用：核酸的杂交，分子扩增）核酸的分类：脱氧核糖核酸（DNA）核糖核酸（RNA）根据RNA的功能，可以分为mRNA、tRNA和rRNA三种。核酸的组成：核酸（DNA和RNA）是一种线性多聚核苷酸，它的基本结构单元是核苷酸；它是通过核苷酸的5-磷酸基与另一分子核苷酸的C3-OH形成磷酸二酯键相连而成的链状聚合物核苷酸本身由核苷和磷酸组成, 核苷则由戊糖和碱基形成多聚核苷酸的特点 在多聚核苷酸中，两个核苷酸之间形成的磷酸二酯键通常称为53磷酸二酯键。 多聚核苷酸链具
7、有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35。水解：（1）酸或碱水解 （2）酶水解核酸的紫外吸收：一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。核酸的变性：指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程。Tm值： 引起DNA变性的温度。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。DNA的复制：1.在复制开始阶段，DNA的双螺旋拆分成两条单链。2.以DNA单链为模板，按照碱基互补配对的原则, 在DNA聚合酶催化下，合成与模板DNA完全互补的新链，并形成一个新的DNA分子。基因的结构对一个结构基因和调控基因而言，一个基因具有完整的OR
8、F，并能编码多肽；具有起时密码子（通常为ATG）、终止子（UAA/UAG/UGA） 、操纵子真核细胞mRNA的3 -末端有一段长达200个核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，称为 “尾结构” ，5 -末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为 “帽子结构”基因表达调控：围绕基因表达过程中发生的各种各样的调节方式。基因活性的调控:主要通过反式作用因子（通常是蛋白质）与顺式作用元件（通常在DNA上）相互作用而实现。顺式作用元件:是指对基因表达有调节活性的DNA序列，通常不编码蛋白质，多位于基因旁侧或内含子中，如启动子。反式作用因子:是能调节与它们接触的基因的表达的各种扩散分子（通常是蛋白质），如转录因子；其编
9、码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列不在同一个DNA分子上。乳糖（lac）操纵子由阻遏蛋白基因（I）、启动子（P）、操纵基因（O）和编码与乳糖利用密切相关的三个酶的结构基因：Z、Y、A区段组成。Lac操纵子的P、O区有部分重叠。启动子的RNA聚合酶结合部位的上游处，还有一个CAP-cAMP结合部位。阻遏蛋白基因（I）属于组成型的调控，是经常表达的，因此，lac操纵子通常是处于关闭状态的。DNA水平的调控DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化与表达。机理是DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑制了转录因子与启动区DNA 的结合效率。
10、转录水平调控：转录发生之前，染色质常常在特定的区域被解旋或松弛，形成自由DNA并发生DNA局部结构的变化，导致结构基因暴露，促进转录因子与启动区DNA的结合，从而使基因转录。不转录原因：染色质的异染色质化。第二章 基因工程操作的基本技术1. DNA凝胶电泳中核酸分子分离的机理。 在碱性环境下，核酸分子带负电荷，在外加电场的作用下，分子在凝胶多孔性刚性滤孔中从负极向正极泳动，其中主要由于分子筛效应和电荷效应达到分离不同大小核酸分子的目的。2. DNA凝胶电泳中影响电泳迁移率的因素主要有哪些？1）分子本身的影响 分子的大小：小则快 带电荷数：多则快 分子构型：超螺旋解螺旋2）电场：直流电场 电压高
11、则快 电压太高则结果不准确常用35V/CM3）支持物介质 种类：琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 凝胶浓度: 浓度大，筛孔小，适合小分子电泳；浓度小，筛孔大，适合大分子电泳4）电泳缓冲液 pH值：偏碱性，带负电荷 离子浓度：离子浓度高 电流大发热快胶溶解 种类：TAE、TBE、TPE、TNE3. PCR的原理和主要反应过程，并分析影响PCR扩增的影响因素。PCR原理：变性温度下， DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的
12、新链，实现DNA的扩增。主要过程：变性：DNA双链变为单链；退火：引物与模板结合；延伸：合成互补链；影响PCR扩增的影响因素：(1)Taq酶：常用1U/25L 浓度低，扩增产物不够； 浓度高，非特异性扩增增加； 酶的活性；(2)dNTP的浓度：常用100-200mol/L，不能低于20mol/L，特异性、保真性；(3)模板：主要考虑纯度及使用量，对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个ng到100ng.(4)引物浓度：0.1-0.5mol/L之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体；(5)Mg2+浓度：常用 0.5-2.5mmol/L； 影响：酶的活性、引物-模板退火、特
13、异性(6)PCR反应程序设定：变性温度和时间：要求变性彻底，但要考虑酶的半衰期：92.5 （2小时）95 （40min）97 （5min）94变性比较彻底，酶的半衰期也不短。引物退火温度Tm与时间：Tm值由引物ATGC数决定每A、T计为2， G、C计为4，时间一般为40秒到60秒引物延伸温度与时间：72最佳，30-100nt/s，也有用68 如La Taq 循环数： 25-35 cycles 之间，过多则非特异扩增增加；平台效应；4. PCR引物设计的原则，若给一指定DNA序列并需要通过PCR扩增此序列，如何设计扩增引物？（关于如何设计这个问题，靠自己了）引物设计原则： 1、G+C含量45-5
14、5%； 2、Tm值高于55； 3、引物特异性； 4、引物扩增跨度； 5、是否形成引物二聚体PCR例子：反应体系配置：5. 定量PCR的原理？Ct值的含义。原理：通过实时检测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量及定性的分析。初始模板量X0的对数值与C(T) 值之间呈线性关系：log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log N Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号开始由本底进入指数增长阶段时到达设定的域值时所经历的循环数（如后图所示，图仅供参考）Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越
15、小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。杂交三要素1、探针（DNA、RNA或抗体）包括探针的来源和标记2、被检测的对象（DNA、RNA或蛋白质）包括被检测样品的分离准备3、杂交膜 硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman 541滤纸 6. 分子杂交的类型主要有哪些？探针的标记方法与标记类型？常用的双链DNA的标记方法是哪两种？探针的标记方法：切口平移法、随机引物合成法，末端标记法，PCR标记法，体外转录标记法。探针按核酸分子分：DNA探针和RNA探针；按标记物的不同：放
16、射性标记探针和非放射性标记探针。标记类型：按核酸分子的不同：可分为DNA探针和RNA探针根据标记物的不同：可分放射性标记探针和非放射性标记探针；双链DNA探针标记主要方法：切口平移法、随机引物合成法；7. Southern杂交一般过程及影响杂交因素。Southern杂交操作步骤:(1) 用限制性内切酶酶切DNA, 经凝胶电泳分离各酶切片段； (2) 转膜：将DNA片段转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；(3) 预杂交：封阻滤膜上非特异性位点； (4) 杂交：让探针与同源DNA片段特异性结合；(5) 洗脱：去除非特异性结合的探针；(6) 自显影检查目的DNA所在的位置。Southern杂交影响因子1
17、）、目的DNA在总DNA中所占的比例2）、探针的大小和标记效率3）、转移到滤膜上的DNA量4）、探针与靶DNA的同源性目的：用来检测被研究DNA中（包括经限制性内切酶切割后的DNA片段或PCR产物）是否存在与探针同源的DNA序列。用途：基因定位转基因的真实性、转基因的拷贝数、克隆基因的正确性等方面的检测鉴定。Northern杂交：过程基本同Southern杂交，但有两处不同：一是检测的对象是RNA；二是凝胶电泳用变性琼脂糖凝胶，打开二级结构。Western杂交杂交对象是蛋白质，通过PAGE胶电泳，再将蛋白质转移到固相支持物上，通过抗体与蛋白质特异性反应进行检测。8. 基因组文库的构建过程？如何
18、确定文库的大小？基因文库构建的目的: 从文库中筛选出目的基因或用于生物基因组测序基因组文库：是一个特定生物体所有基因的集合，以各基因重组子的克隆形式表现。基因组文库的构建过程：1）从生物体提取大片断的基因组DNA；2）用适当的限制性内切酶（常为4碱基识别位点）进行部分酶切或超声波打断基因组DNA ；3）在琼脂凝胶电泳上或蔗糖梯度离心筛选适当长度的DNA片断（根据载体的要求）； 4）载体的酶切、回收；5）将处理好的基因组DNA片断与载体连接；6）将重组子导入宿主细胞7）文库的鉴定、收集、保存；确定文库大小的方法：以在构建的基因组文库中任一基因存在的概率来衡量文库的质量或完备性，它与基因文库最低所
19、含克隆数N（即文库大小）之间的关系可用下式表示： N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f ) 其中： N：文库所需的总克隆数； P：任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率； f：克隆片段的平均大小/ 生物基因组的大小。9. 基因文库的类型包括哪两种？各有什么特点？10. 一般质粒DNA的构型有哪几种？在琼脂糖凝胶电泳中的有何特点？超螺旋质粒DNA、开环质粒DNA、线状质粒DNA在琼脂糖凝胶电泳的特点是：电泳的泳动速度由大到小分别是：超螺旋质粒DNA线状质粒DNA开环质粒DNA质粒提取的方法：碱裂解法、煮沸法、SDS法11. 碱裂解法提取质粒DNA的原理，分析影响试验结果的各种可
20、能因素。碱裂解法原理：在碱性条件下，双连DNA氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除去。（各种可能因素是上一届的，具体其实大家可以根据那天师兄说的去写）提取失败：1）洗去双链时，将质粒DNA洗去； 2）破壁失败，质粒没析出； 3）加剂问题电泳失败：1）电压太高 2）没加染色剂 3）胶穿孔 4）电泳时间过长12. 电泳缓冲液使用一定时间后出现DNA在凝胶中跑不动现象的原因，有何解决办法？原因：电泳缓冲液的离子的富集作用；解决方法：1.更换成新配置的电泳缓冲液； 2.把电泳槽中的缓冲液倒出混匀后再重新使用
21、13. 电泳的指示剂和染色剂有何区别，各自的作用是什么？指示剂一定要在电泳前加入，指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液；（一般为：溴酚兰，二甲苯青）作用：预知电泳的速率及方向；使样品呈现颜色，便于加样；一些高浓度蔗糖或其它物质增加DNA的密度，可以防止DNA的扩散染色剂即可以在电泳前加入样液，又可以电泳后再对凝胶染色；（溴化已锭EB、硝酸银、Goldview染料）作用：呈现出核酸电泳后的带型。植物组织中基因组DNA的提取用机械研磨使组织和细胞破碎，然后加入SDS、CTAB等离子型表面活性剂，使细胞膜和核膜破裂，解聚核中的核蛋白（并与蛋白质形成混合物），然后在酚和氯仿等表面活性剂的
22、作用下使蛋白变性，再经离心除去组织和变性蛋白，上清夜加乙醇使DNA沉淀。研磨破碎组织必须在低温下进行。防止DNA降解。幼嫩组织DNA的得率高提取DNA的质量鉴定：DNA的相对完整性：凝胶电泳DNA的纯度：测OD值吸收峰： DNA紫外光260nm 蛋白质紫外光280nm比值：OD260/280 = 1.8-2.0 较纯 OD260/280 平端(100倍)； 5，突出3，突出； 平端：HaeIIIAluIHinCIISmaI2）连接温度 连接效果最好在37 ，但形成的互补不稳定;最佳连接温度：12-16 ，较好的连接效果，互补又较稳定;3）反应液中的成分： ATP：反复冻熔，ATP活性降低，AT
23、P溶解度不高，连接缓冲液宜分装； 单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； PEG：5%以下可以提高连接效率4）插入片段与载体的浓度比例 载体DNA与外源DNA的分子摩尔比通常为13左右，甚至110 或更高。 目的或作用：增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。7、 试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。（传说中的网上答案）1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。3、足够多的载体和插入片段是最重要的 。4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能
24、缩小连接反应的体积6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好8、 基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大肠杆菌DNA聚合酶 53的DNA聚合酶活性； 53的核酸外切酶活性； 35的核酸外切酶活性。2）Klenow fragment 53的DNA聚合酶活性35的核酸外切酶活性3）T7 DNA聚合酶 4）T4 DNA聚合酶 均具有53的DNA聚合酶活性， 35的核酸外切酶活性T4聚合酶35的核酸外切酶活性强，而T7聚合酶53的DNA聚合酶活性5）修饰过的T7 DNA聚合酶 6）逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶,最主要用途，以mRNA为模板合成cDNA7）Taq DNA聚合酶：主要用于DNA的体外扩增（聚合酶链式反应）基因克隆的载体系统1、 作为基因工程载体，其应具备哪些条件？ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）； 具有合适的筛选标记
