1、7加入2.5体积预冷的乙醇，立即充分混匀，-20至少放置2小时。85000g 0离心10分钟沉淀核酸，去上清，室温挥发乙醇。9按每克组织细胞加5min的比例分两次加入0.02molL EDTA（pH8.0） 先加12体积EDTA振荡l2分钟，3000g离心2min吸出上清再加另一个1/2体积的EDTA振荡l一2分钟合并两次核酸溶解液。10用等体积氯仿正丁醇（4：1）抽提核酸溶液，5000g室温离心l0min，5000g室温离心10min。吸出上清至另一个干净离心管中。11加3倍体积lmolL乙酸钠 （PH7.0） 混匀，-20放置1h以上，此时RNA将选择地沉淀，而DNA仍为溶解状况。1250
2、00g，0离心20min，沉于管底的是RNA。13吸去上清，用4预冷的lmolL乙酸钠（pH70）漂洗RNA沉淀。然后20 5000g，离心20分钟。回收RNA。14尽量去除上清液。按每g组织细胞1m的比例加入RNA溶解液（0.2SDS，0.5molL EDTA，pH8.0）。注意：若有SDS沉淀析出滴加0.11molL NaOH调溶液pH至75。15加入2倍体积冰预冷乙醇混匀，0放置至少2小时，5000g，4离心10分钟，RNA沉淀用70乙醇漂洗，短暂离心后，弃上清，室温干燥蒸发乙醇。16用适当小容积DEPC处理过的ddH2O溶解RNA沉淀，加入3倍体积乙醇，-70保存RNA备用。用时加入0
3、.1体积的3molL乙酸钠，混匀，120xxg，4离心回收RNA。三.试剂1盐酸胍匀浆液成分：8molL盐酸胍（分子量为95.6），O1molL乙酸钠（pH52），5mmolL 2巯基乙醇，0.5十二烷基肌氨酸钠配制方法：取191g盐酸胍加8.35m1 3molL乙酸钠（pH52）和625ml 02molL 2琉基乙醇溶液中，再加水至2375ml，混匀后加125ml 10十二烷基肌氨酸钠,振荡混匀溶解。2盐酸胍匀浆液8molL盐酸胍（分子量力95.6）,0.1molL乙酸钠（pH52）,1mmolL 2琉基乙醇，20mmolL EDTA（pH8.0）取191g盐酸胍，加日35ml 3molI。
4、乙酸钠（pH52）和125ml 02molL 2巯基乙醇溶液中，再加入10ml 0.5molL EDTA（pH8.0）。加水至250ml混匀。3.乙醇4.70乙醇5.氯仿正丁醇（4：l，体积比）6.4molL乙醇钠，pH7.07.3molL乙醇钠，pH5.28.RNA溶解液O2SDS0.05molL EDTA, pH8.0四、说明提取RNA时，要特别注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均应用0.1的二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate，DEPC）处理。塑料器材均使用一次性用品，并高压灭菌处理，必要时，也可用0.1%DEPC处理。RNA是基因表达产物，由以下几类分子组成，
5、rRNA（占细胞总RNA的80%85%）、tRNA和核内小分子RNA（占1015%）、mRNA（占15%）。其中mRNA是分子生物学的主要研究对象，分离制备mRNA是克隆基因，分析基因表达以及建立cDNA文库的首要步骤。真核细胞总RNA分离提取的目的是要获得高纯度的具有充分长度的RNA分子，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的关键是尽量减少RNA酶的污染。RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性的RNA酶外，环境中也存在RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶的污染和抑制内源性RNA酶活性。主要是采用RNA酶的阻抑蛋白RNasin和强力的蛋白质
6、变性剂盐酸胍或异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶，采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶。一、RNA提取 的关键真核细胞RNA的提取过程有四个关键点，即样品（细胞或组织）的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；其中最关键的是抑制酶活性。提取的RNA可以用于核酸杂交、cDNA合成以及体外翻译等。二、组织RNA提取的基本步骤1.仪器：匀浆器、低温离心机、离心管。2.试剂：氯仿、75%乙醇、异丙醇、DEPC溶液、1%甲醛变性胶、37%甲醛、3%过氧化氢、甲酰胺、RNA上样缓冲液。3.主要步骤（1）取组织50100mg，加0.8ml
7、Trizol冲洗匀浆器，移入同一离心管，冰上静置5min。氯仿，充分震荡混匀，静置0.5ml异丙醇，颠倒混匀。1ml 75%乙醇溶液，漂洗沉淀，10min。l DEPC溶液，充分溶解RNARNA溶解液，按一定比例稀释后，紫外分光光度计测值，计算OD260/OD280OD2601时，RNA浓度约为）OD260稀释倍数401%甲醛变性胶电泳观察甲醛变性凝胶板：4.5l RNA，120xxg静置2h，41.72.0，根据下述公式计算甲醛胶电泳缓冲液，离心。弃沉淀。 10min5min离心。 ：1之间，说明RNA浓度：3%过氧化3.5l 37%甲（2）加0.2ml3min，415min（3）取上清，加
8、入204，120xxg离心。 （4）弃上清，取沉淀，加入，7500g（5）弃上清，沉淀真空干燥（6）加40。 4.结果鉴定 （1）紫外分光光度计检测：取定260nm、280nmOD比值，如果比值在RNA纯度可。 标准样品当40g/mlRNA浓度（g/ml。 （2）电泳检测：RNA质量，电泳槽及制胶板先用氢浸泡过夜；制1%，2ul 5醛，10ul甲酰胺，离心混匀，65变性15min后，迅速置冰浴中；再加入2l RNA上样缓冲液，离心混匀后上样，6V/cm电压，电泳12h；暗室内紫外光下观察，拍照；如果观察到清晰的18S、28S RNA电泳带，无大量小分子RNA，说明RNA无明显降解，样品70保存
9、备用。三、注意事项1、所有玻璃器皿160180高温干烤6h以上，非耐高温器皿经0.1% DEPC液浸泡后，经高温（15磅，20min）处理灭活RNA酶，所用试剂均用DEPC水配制，然后高压处理。2、实验用水要经DEPC处理，但含Tris的试剂不能用DEPC处理。3、实验操作过程中要戴一次性手套，以避免RNA酶污染。药大实验原理：根据成熟雌蟾蜍体内含大量卵细胞且可以方便获取，细胞内含核酸丰富，没有其它组织器官等的干扰等优点以确定蟾蜍卵细胞为实验所需的真核细胞。通过TRIZOL溶液中变性剂破碎真核细胞，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再利用RNA不溶于异丙醇的性质将自身析出，达到分离提纯的目的。
10、TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。甲基绿吡罗红为碱性染料，它分别能与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。当甲基绿与吡罗红作为混合染料
11、时，甲基绿与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；吡罗红与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色。而吡罗红则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色（但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色）。即RNA对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大，被染成绿色。09419实验材料：（一）试剂1.甲基绿吡罗红染料：染色剂A液的两种配制方法第一种方法：取吡罗红甲基绿粉1g，加入到100mL蒸馏水中溶解，然后用滤纸过滤，将滤液放入棕色瓶中备用。第二种方法：取甲基
12、绿2g溶于98mL蒸馏水中，取吡罗红G5g溶于95mL蒸馏水中。取6mL甲基绿溶液和2mL吡罗红溶液加入到16mL蒸馏水中，即为A液，放入棕色瓶中备用。（注意：用于核酸染色的是吡罗红G，请不要错买吡罗红B。）染色剂B液的配制方法B液是一种缓冲液，由乙酸钠和乙酸混合而成。先取乙酸钠16.4g，用蒸馏水溶解至1000mL备用；再取乙酸12mL，用蒸馏水稀释至1000mL备用。取配好的乙酸钠溶液30mL和稀释的乙酸20mL，加蒸馏水50mL，配成pH为4.8的B液（缓冲液）。染色剂的配制染色剂是由A液、B液混合配制而成的。取A液20mL和B液80mL混合，就是实验中所用的吡罗红甲基绿染色剂。应该注意
13、的是该试剂应现配现用。2.TRIZOL试剂（Invitrogen公司购买）3.75%乙醇4.氯仿5.异丙醇6.Nacl（0.14m/l）（二）器材1.离心机（3000r.p.m）2.冰浴3研钵4.烧杯5.量筒6.试管7.玻棒8.胶头滴管99.离心管10.天平实验方法：制备匀浆：以班级为单位，称取大概10g蟾蜍卵细胞（23保存），于研钵（可置于冰浴锅上）中，根据1030mg组织细胞加1mltrizol试剂的量加入其中，快速研磨，制备匀浆。实验二人合作为一组，每组取大概10ml匀浆。RNA的提取：取回匀浆后，室温静置10min，使样品充分裂解离心（3000r.p.s）20mins取上清液移至新的离
14、心管加1/5TRIZOL溶液体积氯仿在手中反复振荡摇匀，室温静置10min。离心20mins取上清液在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10min。充分混匀，静置10minute离心20min沉淀用75%乙醇洗涤两次定性试验：取2支干净试管，一管加入1.5MLRNA溶液（将RNA颗粒状的沉淀溶于2ML0.14/NACL溶液中），另一管加入蒸馏水1.5ML,像两管中加入3M甲基绿-吡罗红染色剂，溶液变成红色为阳性反应。实验结果：利用TRIZOL法可成功提取的RNA，并使得甲基绿-吡罗红染色剂显红色。实验注意事项：TRIzol对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。由于本科生实验室里的为普通离心机，转速不高，故可适当延长离心时间。离心后，注意上清液和沉淀的取舍以及对RNA层的小心吸取，否则将导致RNA样品中有DNA污染。
