1、说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处 只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。 因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言， 几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那 么EDTA呢？大家知道 EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金 属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是： 抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入 高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的 所有二价金属离子都螯合掉。如果不加 EDTA，其实也没 什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里 完成质粒抽提，就不用怕 DNA会迅速被降解，因为最终 溶解质粒的TE缓
2、冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好 缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用 等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点 不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。轮到溶液II 了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的 SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N 的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2 而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱， 而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上 NaOH是最佳的 溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞， 碰 到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer （双层
3、膜）结构向 micelle （微囊）结构的相变化 所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无 法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难 高效率抽提得到质粒。如果只用 SDS当然也能抽提得到 少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很 多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组 DNA变性， 以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关 DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是 NaOH溶解的细胞，那为什么要加 SDS呢？那是为下一步操作 做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千 万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组 DNA片断会
4、慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女 孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的 断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。每个人都知道，溶液 川 加入后就会有大量的沉淀，但大 部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，疑, 往1%的SDS溶当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你 这样怀液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事 了。大量沉淀的出现，显然与 SDS的加入有关系。如果 在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但 量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。 既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的 沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的N
5、aCI，你 会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓 的盐导致了 SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCI而是 KCI，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫 酸钠（sodium dodecylsulfate遇到钾离子后变成了十二 烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS 而 PDS 是 水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液 III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了 SDS中的钠离子形成了不 溶性的PDS,而高浓度的盐，使得沉淀更完全。|大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大
6、 部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组 DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因 组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀 了，尽管SDS并不与DNA分子结合。那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和 NaOH，因为长时间的碱性条件会打断 DNA，所以要中和 之。基因组DNA 一旦发生断裂，只要是50- 100 kb大小 的片断，就没有办法再被 PDS共沉淀了。所以碱处理的 时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总 会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一 条浓浓的总DNA条带。很多人误认为是溶液III加入后 基因组DNA无法快速复性就
7、被沉淀了，这是天大的误会， 因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都 是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分 子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有 关系。溶液川 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为 了 PDS沉淀更充分一点。不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了， 其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚 /氯仿/异戊 醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA ,不然时间一长就会因为混入的 DNase而发生降解。 这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做 个全面的介绍。酚（Pheno）对蛋白质的变性作用远大于
8、 氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉， 但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如 4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质 粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚 /氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有 很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到 水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应）， 因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相 中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相 中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而 不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加， 其作用主要是为了让离心后上
9、下层的界面更加清晰， 也方便了水相的回收。已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒 DNA，这些 方法都含有以下3个步骤：（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中 （有含有行当抗生素的液体培养基中生长），然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体（如 pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养 物放在标准LB培养基中生长到对数晚期，就可以大量提 纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒 DNA。然而，较长一代的载体（如pBR322）由于不能如此自由地复制，所 以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续 培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。氯霉
10、素可抑制宿 主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而， 松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续 递增。这样，像pBR 3 2 2 类的质粒，从经氯霉素处理 和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大 为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素 卩g/m已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量, 对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。（二）细菌的收获和裂解 细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用 多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子 型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。 选择 哪一种方法取决于3个因素：质粒的大小、小肠
11、杆菌菌株 及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。尽管针对质粒和宿 主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍 可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。1）大质粒（大于15kb）容易受损，故应采用漫和裂解法从细 胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌 酶和EDTA 进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加 SDS 类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了 从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。2） 可用更剧烈的方法来分离小质粒。 在加入EDTA后，有 时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱 处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的 线状
12、染色体DNA变性，但闭环质粒 DNA链由于处于拓 扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒 DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋 分子。3） 些大肠杆菌菌株（如HB101的一些变种衍生株）用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类， 当随后用氯化铯一溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出 麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒 DNA所占位置形 成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒 DNA内污 染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。故从诸如 HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜 使用煮沸法。4） 当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株（endA+株，如
13、 HB101）中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮 沸不能完全灭活内切核酸酶 A，以后在温育（如用限制酶 消化）时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤（用酚：氯仿进行抽提 河以避免此问题。5 ）目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用 氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者 沿用氯霉素并不是要增加质粒 DNA的产量，而是要降低 细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘 稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期 在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在 时从较少量细胞获得的质粒 DNA的量以与不加氯霉素时 从较大量细胞所得到的质粒 D
14、NA的量大致相等。（三）质粒DNA的纯化 常使用的所有纯化方法都利用了质粒 DNA相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯一溴化乙锭 梯度平衡离心分离质粒和染色体 DNA就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。 溴化 乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与 DNA结合，进而使 双螺旋解旋。由此导致线状 DNA的长度有所增加，作为 补偿，将在闭环质粒 DNA中引入超螺旋单位。最后，超 螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到 饱和（每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子）。由于 染料的结合量有所差别，线状和闭环 D
15、NA分了在含有饱 和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。 多年 来，氯化铯一溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展 了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、 凝胶 过滤层析、分级沉淀等分离质粒 DNA和宿主DNA的方 法。本实验室采用离子交换层析法已可得到极高纯度的质 粒。另外，现在已可买到现成的纯化 KIT。质粒提取常见问题解析涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的 菌烧死？参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时 杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。 建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再
16、涂。同时作多 个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。原先测序鉴定没有问题的细菌，37C摇菌后发现质粒大小 或序列出现异常？这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒 或比较特殊的序列中。解决办法：1、 降低培养温度，在 2025 C下培养，或室温培养可 明显减少发生概率。2、 使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重 组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。3、 质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液U中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：1、 利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠 杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的
17、气味，但 不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉 到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。2、 肉眼观察活化菌株。对于生长不正常的菌液进行划 板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生 长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37C 16h后直 径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑， 如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常 了。】未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？1、 大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进 行液体培养。2、 质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒 DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。3、 菌体中无质
18、粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定 存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质 粒在大肠杆菌中长期保存不稳定， 因此不要频繁转接，每 次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。4、 碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂 解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。 对低拷贝 数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有 助于增加质粒提取量和提高质粒质量。5、 溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑 浊，应置于37 C保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能 使用。6、 吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果 需要提取的质粒量很大，请分多次提
19、取。若用富集培养基， 例如TB或2&T，菌液体积必须减少；若质粒是非常高 的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率， 则需减少LB培养 液体积。7、 质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）：洗脱溶解质粒时， 可适当加温或延长溶解时间。& 乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体， 再加入洗脱缓冲液。9、 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部 位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱 效率。10、 洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱， 如洗脱缓冲液 EB（10mM Tris-HCI, 1mM EDTA，pH8.5） 或水。洗脱效率还取决于 pH值，最大洗脱效率在 pH7.0-8
20、.5间。当用水洗脱时确保其 pH值在此范围内， 如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或 洗脱缓冲液加热至60C后使用，有利于提高洗脱效率。11、 洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随 着洗脱体积的增大回收率增高， 但产品浓度降低。为了得 到较高的回收率可以增大洗脱体积。12、 洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。 洗脱时放置1min可达到较好的效果。细菌离心加入溶液I蜗旋振荡后，发现菌体呈絮状不均匀 或呈细砂状？1、 很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间或者试试平 板培养，质粒提取前用 PBS将菌落洗下，相较来说固体 培养基上细菌生长的要好一些。2、 质粒抽提过程
21、很大程度上是受细菌生长情况决定的， 刚活化的菌比负80C保存菌种所培养出来的菌液状态好， 保存久的菌株可能会造成质粒浓度低，质粒丢失等不明原 因。3、 判断生长的菌液是否正常，可以用肉眼观察，在光线 明亮处摇荡新鲜培养液，如果发现菌液呈漂絮状，情况很 好。如果发现呈泥水状，即看不到絮状，只是感觉很浑浊， 则可能提不出好的质粒，或者没有质粒。4、菌液不宜生长太浓，摇床速度不宜过高。达到OD6001.5就可以了，（尤其是对于试剂盒提取要注意） 另外如果 只是简单的酶切验证根本无需酚氯仿抽提（安全考虑，慎 重），只要溶液I/ II /III比例恰当，转管过程仔细吸取不 会有太多杂志。为什么加了溶液U
22、后，菌体没有逐渐由混浊变澄清？提出 来的条带几乎没有，但是 RNA很亮（没加RNA酶）？ 溶液主要就是NaOH，如果菌液没有由混浊变澄清，参 考见解：1、 可能是因为溶液储存不当，或屡次操作没有及时盖好溶液瓶盖，导致其吸收空气中的 CO2失效。RNA在菌体 中量较多，相对少量的菌体裂解，可有较 DNA明显的条-H-P带。2、 可能是菌量大，加溶液口后，菌体并不能完全裂解， 所以没有变清，这也会导致质粒产率低下.3、 可能是质粒的拷贝数不高，质粒产率不高.如果是使 用自己配的试剂，建议做中提或大提；或者买试剂盒提.用 自己配的试剂，不加 RNA酶，最后RNA是很亮的，要 去除干净就要用比较好的R
23、NA酶。4、 如果不是试剂的原因，可能是质粒表达的过程中使膜 蛋白变化（数量变多），很难使用碱裂解法，可以尝试用 其他比较剧烈的方法（比如高温或者低温研磨等），然后使 用一般的发放5、可能质粒随乙醇一起倒掉了。加入溶液II后，菌液仍然呈浑浊状态，或者混浊度没有 明显的改变？裂解不完全，参考见解：1、 问题可能是发生在溶液II上。首先看看10% SDS是 否是澄清的？ NaOH是否是有效的？如果使用的是试剂盒，也要首先确认溶液II是否澄清没有沉淀？2、 可能是细菌浓度很高，适当调整增加溶液 I/II/III的 体积。3、 可能是 杂菌”污染，如果菌液生长异常快，就有可能 被杂菌污染。这种情况一般
24、表现为和目的菌有相同的抗 性，生长速度异常，能够提出质粒，跑胶的条带也异常的 亮，但产物不是自己想要的质粒，要特别注意一下。抽提 DNA去除蛋白质时，为什么要是酚/氯仿混合使用？怎样 使用酚与氯仿较好？酚与氯仿都是非极性分子，水是极性分子，当 蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子 就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离 心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离， 沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的 DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各 有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶， 大约
25、10%15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分 水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯 仿与水不相混溶，不会带走 DNA。所以在抽提过程中， 混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中 有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变 性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时， 将酚与氯仿混合（1:1）使用。呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？ 参考见解：保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉 红色的，这样的酚容易降解 DNA，一般不可以使用。为 了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度 为0.1%。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅
26、能 抗氧化，并在一定程度上能抑制 DNase的活性，它是金 属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最 好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层 Tris水溶液或TE 缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可 充氮气防止与空气接触而被氧化。平时保存在 4C或一20 C冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可 使酚不变质，可用数月。为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊醇？在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振 荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相 互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力， 可以 降低抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异
27、戊酵为 24: 1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为 25： 24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24： 1的氯仿 与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上 层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。 加入酚/仿抽提，离心后在水相和有机相间没有出现变性 蛋白相层，在随后的乙醇沉淀步骤中却出现大量的半透明 沉淀，溶解后发现蛋白浓度很高？ 乙醇沉淀时，较纯的质粒沉淀是白色的（PEG纯化的沉 淀是透明的肉眼不易发现），如沉淀是半透明的凝胶状， 则应是蛋白含量高。首先看看平衡酚是否已被 氧化？ pH是否是8.0?其次检测溶液III反应完成后的离 心上清pH是否在8.0左右
28、？有时由于溶液III配置的问 题，会出现溶液 川 反应后离心的上清pH与8.0偏差较 大的现象，这会降低平衡酚抽提蛋白抽的有效性， pH偏差过大也会导致水相和平衡酚互溶。使用酚仿抽提方法，质粒的纯度很好，但酶切不能完全切 开?1、 确认酶的有效性。2、 平衡酚是否被氧化（正常是黄色，而氧化后是棕色的）。3、 是否不小心吸入了痕量的酚。4、 乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分（残留的盐类会影响酶切）。5、乙醇漂洗后是否完全干燥（残留的乙醇会影响酶切）。 碱裂解法提取的质粒DNA进行琼脂糖电泳进行鉴定时， 看到的三条带分别是什么？碱法抽提得到质粒样品中不含线性 DNA，得到的三条带是以电泳速度的
29、快慢排序的，分别是超螺旋、 开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一 起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四 条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是 20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。提取质粒中RNA没有去除？可能是RNase失效或效率不高。1、 更换RNase A,并保证其储存条件是正确的2、 手工提取质粒的，可单独增加一步去除RNA的步骤， 溶液川反应后，在离心的上清中加 RNase,室温下去除RNA 10min30min （需要保证 RNase A 是经过失活DNase的），同时较高温度（如50C）会更加快速完全的 去除RNA，经验所得经过咼温处理的质粒质量不是很咼。 提取的质粒电泳后，为连续的一片火箭状？1、 质粒如果盐离子多，会有走胶变形的现象， 如果提 到的质粒不够纯，会有电泳条带不平齐的现象。2、 当电压太大时，容易出现火箭状，而降解应该是弥散状。3、 可能是宿主菌影响的，质粒抽提好后，用酚 -氯仿处 理一下再酶切，若有改善，则为宿主菌
