1、此方法具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。在较低温度超声作用下，对乙醇浸提芹菜叶中黄酮类化合物的工艺研究表明，超声可以强化乙醇浸提法，达到省时、高效、节能的目的。用超声技术提取，可提高提取率并缩短提取时间，而且可以提高原料的利用率。本实验目的就是要找出用超声波辅助提取中芹菜叶中黄酮类物质的最佳提取条件，从而使的黄酮类化合物的提取效果最好，黄酮类化和物的得率达到最高。考察黄酮类化合物的活性和提取条件。实验中，从芹菜叶提取黄酮类化化合物。将芹菜与乙醇以一定的比例混合后，经过超声波清洗仪进行超声，采用不同的加热温度，加热时间，料液比、超声波功率、乙醇浓度等条件等使黄酮从芹菜叶中分离，最终找出最
2、佳的提取条件。本实验研究的结果不仅可用于芹菜叶中黄酮类化合物的提取，在其它植物中黄酮类化合物的提取中也具有参考作用。所以，本实验的研究有一定的实际意义。第1章 绪论1.1 黄酮类化和物的特性1.1.1 物理特性 黄酮类化合物多为结晶性固体1，少数为无定型粉末。黄酮类化合物的颜色与分子中存在的交叉共轭体系及助色团（-OH、-CH3）等的类型、数目及取代位置有关。黄酮一般易溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶等溶剂，难溶于乙醚、三氯甲烷、苯等有机溶剂。黄酮类化合物因分子中多有酚羟基而呈酸性，故可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。1.1.2 化学特性生物类黄酮结构是两个苯环（A-与B-环）
3、通过中央碳链相互联结而成的一系列C6-C3-C6化合物,主要指以2-苯基色原酮为母核的化合物,其基本结构2为: 1.1.3 光谱特性 以乙醇为提取溶剂提取黄酮类化合物，取提取液以溶剂定容测得在510.0nm处的吸光度值最大3，因此确定510.0nm为最大吸收波长。1.1.4 稳定性（1）对光照的稳定性日光对黄酮稳定性有一定影响4,自然光对生姜黄酮的稳定性影响不大,避光条件下黄酮的稳定性较好,紫外光照射4 min以下对黄酮的稳定性几乎没有影响。总之,短时间里光照对生姜黄酮的稳定性影响不大。（2）对热的稳定性50以下,黄酮溶液的吸光度变化很小,当温度超过50时吸光度呈明显下降趋势,溶液颜色由黄色逐
4、渐变为淡黄色,表明,在50以上的温度范围内黄酮的热稳定性较差,应尽量在50以下制备和保存。（3）对pH的稳定性pH为36时黄酮溶液的吸光度变化不大5，稳定性较好。当pH小于3或大于6时,吸光度明显下降,说明溶液过酸或过碱时,黄酮的稳定性较差,可见酸碱对其影响都比较大。（4）氧化剂对黄酮的影响随着氧化剂质量分数的增加，黄酮溶液的吸光度略有增加，但上升幅度不大，说明氧化剂对黄酮的稳定性的影响不大，所以可认为黄酮具有抗氧化做用。1.2 黄酮类化合物的生理功能1.2.1 抗肿瘤、抗癌作用黄酮类化合物6是通过促进肿瘤坏死因子，抑制致癌剂及抗氧化等多途径发挥疗效的。如大豆异黄酮的A环5、7位及B环的4位的
5、羟基是抑制乳腺癌和前列腺癌的主要基团，在前列腺细胞增殖阶段大豆蛋白对其有抑制作用，因此，可减少前列腺肿瘤的发生。Kenneth研究表明，大豆异黄酮能降低乳腺癌、前列腺癌。赵秀兰等的研究表明麦胚黄酮类粗提取物具有抑制乳腺肿瘤的作用。1.2.2 对心血管系统的作用对血压的影响：黄酮类化合物7对高血压引起的头痛、项强、头晕、耳鸣等症状有明显的疗效，尤以缓解头痛、项强为显著。葛根素对正常和高血压动物都有一定的降压作用，静注葛根素能使正常麻醉犬的血压短暂而明显地降低，也能显著降低清醒自发性高血压大鼠血压。抑制血小板凝集作用：黄酮类化合物对凝血因子具有较强的抑制作用，故表现出较好的抗凝血作用。试验表明，不
6、同浓度的黄酮类化合物可以不同程度地抑制二磷酸腺苷诱导的大鼠血小板凝集，对5羟色胺和ADP联合诱导的家兔和绵羊血小板凝集也有同样的抑制作用。黄酮类化合物还可降低血管内皮细胞羟脯酸代谢，使内壁的胶原或胶原纤维含量相对减少，利于防止血小板粘附凝集和血栓形成，有利于防治动脉粥样硬化。大豆异黄酮能抑制凝血酶和血小板活化因子诱导的血小板聚集，高浓度抑制血管渗透性因子诱导的冠状动脉舒张。对外周血管8的影响：静注黄酮类化合物于麻醉犬后，全部动物的脑血流量增加且血管阻力相应降低，还能使乙酸胆碱引起的脑内动脉扩张和去甲肾上腺素引起的收缩减弱，使处于异常状态下的血管功能恢复正常水平。还可改善异丙肾上腺素引起的小鼠微
7、循环障碍，使毛细血管前小动脉管径增加，流速加快。1.2.3抗氧化及抗自由基作用自由基性质活泼，有极强的氧化反应能力9，对人体有很大的危害性，在体内自由基和脂质过氧化作用导致细胞结构改变和功能破坏，而引起癌症、衰老及心血管等退变性疾病。在黄酮提取物的抗氧化性研究方面，国外曾有人利用DPPH法研究羟基黄酮以及单宁和类黄酮的抗氧化能力。徐雅琴研究了黑穗栗叶片黄酮提取物的抗氧化性，结果表明，叶片黄酮提取物具有一定抗氧化效果，且其抗氧化性随天加量的增加而增强。于长青等研究表明，麦胚黄酮可显著增强大鼠血液中和活性，提示麦胚黄酮可能通过提高机体抗氧化酶类的生物合成而增强机体抗氧化能力。1.2.4抗炎、抗微生
8、物及提高免疫功能的作用黄酮类化合物主要通过影响细胞的分泌过程，有丝分裂及细胞间的相互作用而起抗炎及提高免疫功能10。多数黄酮类化合物能抑制大鼠肥大细胞和嗜碱性细胞对多种刺激引起的组胺及慢反应物质的释放，抑制PGE2、白三烯的合成和释放，抑制透明质酸酶的活性，抑制大鼠中性粒细胞溶酶体酶的释放及其脱颗粒。白凤梅等研究表明，天然黄酮对小鼠急性胃溃疡有明显的消退作用。甘草第2期王长远等：黄酮类化合物研究进展 黄酮化合物中抗菌成分较多，其黄酮单体化合物licochalconeA，licochalconeB，glabridin，glabrene等对金黄色葡萄球菌，枯草杆菌，大肠杆菌，绿脓杆菌，白色念珠菌等
9、均有抑制作用。Neobavai isolavone亦能明显抑制烟曲霉菌和新型隐球菌的生长。翟爱华等采用二倍稀释法和管碟法对麦胚黄酮进行体外抑菌试验，结果表明，对灰葡萄孢、白色念珠菌、黑根霉、意大利青霉等真菌具有较好的抑菌效果。1.2.5类黄酮对脂质代谢的调节作用有关对类黄酮作用的大量研究表明，类黄酮物质对动物的脂质代谢具有调节作用11。Lichtenstein认为，大豆产品预防动脉粥样硬化、冠心病的作用归因于大豆类黄酮的降血胆固醇、抗氧化和保护动脉完整的作用。Balmir等在大鼠试验中发现，大鼠日粮中添加大豆异黄酮可显著降低血清总胆固醇和LDL胆固醇浓度12。于长青等试验研究表明麦胚黄酮可明显
10、地降低大鼠血清和肝脏中的胆固醇、甘油三酯的含量。1.3 黄酮类化合物的提取及影响因素黄酮类化合物分布范围广、种类多、生物活性广泛，而且毒性小，使其分离提纯技术得以快速发展。目前在黄酮类化合物的提取方法中13，溶剂提取法、热水提取法等传统方法仍占主导地位，但与一些新兴的提取分离技术相比，逐渐暴露了许多问题，如能量消耗大，提取温度高，时间长，不利于黄酮类化合物母核活性的保护，产品中黄酮类化合物得率和含量低，尤其是存在溶剂残留。相反一些新兴技术如超声波辅助提取技术、微波技术等具有物耗能耗少，提取速度快，产率和纯度高，提取条件温和，有利于黄酮类化合物母核活性的保护等特点。今后的黄酮类化合物提取的发展方
11、向应该是优化现有的传统提取工艺的同时，着手新兴技术的完善和普及。1.4 黄酮类化合物在食品业的应用1.4.1 天然甜味剂柚皮苷属二氢黄酮，经过氢化处理可以转变为二氢查尔酮,具有甜味14,甜度是蔗糖的100倍。柚皮苷与异香兰素作用得新橙皮苷,新橙皮苷经过氢化转变为新橙皮苷二氢查尔酮,其甜度为蔗糖的950倍,而且此两种甜味剂回味均无苦味,可直接用于各种食品中,并具保健作用。1.4.2 天然抗氧化剂研究表明,生物类黄酮均具有较强的抗氧化能力。SatuS Pekkarinen等人发现在亚油酸甲脂体系中,杨梅酮（myricetin）与槲皮素（Quercetin）的抗氧化效果优于维生素E。Susana N
12、ieto等人发现在鱼油体系中,槲皮素与5 ,3,4-三羟基-7-甲氧基黄烷酮（ 5 ,3,4-trihydroxy-7-methoxyflavanone）的混合物的抗氧化能力15高于人工合成的抗氧化剂丁基羟基茴香醚（BHA）及丁基羟基甲苯（BHT）。1.4.3 天然色素生物类黄酮多呈黄色，同时又具有很宽的溶解性16，既具有水溶性的生物类黄酮,又有脂溶性的生物类黄酮,所以完全可以根据食品加工的需要来选择合适的生物类黄酮作为着色剂。萧伟祥等人利用低档的绿茶或茶末制取了纯天然的茶黄色素和茶绿色素，并确定主要成分是黄酮类化合物。1.3.4 保健食品由于生物类黄酮所具有的保健功能,人们又开发出多种保健食
13、品。以富含生物类黄酮的荞麦为例,就有苦荞米、苦荞营养粉、苦荞疗效粉、糖尿病食疗粉、胃病食疗粉、高血脂食疗粉、苦荞颗粒粉、苦荞饼干、苦荞挂面、苦荞通心粉、苦荞食疗酒、苦荞醋、苦荞茶等产品。1.5 超声波辅助萃取的基本原理1.5.1超声波辅助提取技术 超声波是指频率为20千赫50兆赫左右的电磁波17，它是一种机械波，需要能量载体介质来进行传播。超声波在传递过程中存在着的正负压强交变周期，在正相位时，对介质分子产生挤压，增加介质原来的密度；负相位时，介质分子稀疏、离散，介质密度减小。也就是说，超声波并不能使样品内的分子产生极化，而是在溶剂和样品之间产生声波空化作用，导致溶液内气泡的形成、增长和爆破压
14、缩，从而使固体样品分散，增大样品与萃取溶剂之间的接触面积，提高目标物从固相转移到液相的传质速率。利用超声波进行清洗、干燥、杀菌、提取及无损检测等，是一种非常成熟且有广泛应用的技术。1.5.2超声波辅助提取的原理超声波萃取中的优越性，是基于超声波的特殊物理性质。主要是主要通过压电换能器产生的快速机械振动波19来减少目标萃取物与样品基体之间的作用力从而实现固-液萃取分离。 （1）加速介质质点运动。高于20 KHz声波频率的超声波的连续介质（例如水）中传播时，根据惠更斯波动原理，在其传播的波阵面上将引起介质质点的运动，使介质质点运动获行巨大的加速度和动能。质点的加速度经计算一般可达重力加速度的二千倍
15、以上。由于介质质点将超声波能量作用于有效成分质点上而使之获得巨大的加速度和动能，迅速逸出基体而游离于水中。 （2）空化作用。超声波在液体介质中传播产生特殊的“空化效应”，“空化效应”不断产生无数内部压力达到上千个大气压的微气穴，并不断“爆破”产生微观上的强大冲击波作用在被提取物上，使其中所需提取的成分物质被“轰击”逸出，并使得基体被不断剥蚀，其中不属于植物结构的所需提取的成分不断被分离出来。加速植物有效成份的浸出提取。 （3）超声波的振动匀化（Sanitation）使样品介质内各点受到的作用一致，使整个样品萃取更均匀。综上所述，一般所需提取的物质在超声波场作用下不但作为介质质点获得自身的巨大加
16、速度和动能，而且通过“空化效应”获得强大的外力冲击，所以能高效率并充分分离出来。1.5.3超声波萃取的特点 相比较传统的提取方法20，超声波萃取具有如下突出特点：（1）无需高温。在4050水中超声波强化萃取，无水煮高温，不破坏物质的某些具有热不稳定，易水解或氧化特性的有效成份。超声波能促使植物细胞地破壁，提高提取效率。（2）常压萃取，安全性好，操作简单易行，维护保养方便。（3）萃取效率高。超声波强化萃取2040分钟即可获最佳提取率，萃取时间仅为水煮、醇沉法的三分之一或更少。萃取充分，萃取量是传统方法的二倍以上。据统计，超声波在6570时工作效率非常高。而温度在65C度内各种植物的有效成份基本没
17、有受到破坏。加入超声波后（在65条件下），植物有效成份提取时间约40分钟。而蒸煮法的蒸煮时间往往需要两到三小时，是超声波提取时间的3倍以上时间。（4）具有广谱性。适用性广，绝大多数的植物各类成份均可超声萃取。（5）超声波萃取对溶剂和目标萃取物的性质（如极性）关系不大。因此，可供选择的萃取溶剂种类多、目标萃取物范围广泛。（6）减少能耗。由于超声萃取无需加热或加热温度低，萃取时间短，因此大大降低能耗。（7）药材原料处理量大，成倍或数倍提高，且杂质少，有效成分易于分离、净化。（8）萃取工艺成本低，综合经济效益显著。1.6 本课题的目的意义和研究内容本课题所介绍的超声波提取黄酮类化合物的方法与常规提取
18、方法比：（1）超声波提取具有提取温度低等特点，可以避免高温对有效成分的破坏，适合于热敏性物料的提取。（2）提取物的有效成分含量高，有利于进一步的精制。（3）溶媒用量少，可有效降低成本。（4）有效成分的提取率高，原料利用充分，提高经济效益。（5）对大多数有效成分的生理活性基本无影响。黄酮类化和物用传统的有机溶剂加热浸提，时间较长，能源消耗大。采用超声波辅助提取可以加速提取成分的扩散释放，充分与溶剂混合，提高提取效率，且与超临界CO2萃取相比，成本低、投资少、提取效率高。所以研究此种方法对寻求更加有效的黄酮类化和物提取法有较大的帮助。第2章 材料与方法2.1 试验原料、药品及器材2.1.1 试验原
19、料 芹菜叶：购买与安徽省芜湖市鸠江区农贸市场2.1.2 试验药品 芦丁：中国医药（集团）上海化学试剂公司（生化试剂）；无水乙醚，乙醇，NaOH, NaNO2， Al（NO3）3等均为国产分析纯;蒸馏水。2.1.3 试验器材 FC104型电子分析天平；101A-2E型数显电热鼓风干燥箱；FW-100型高速万能粉碎机；KQ-250E超声波清洗器；L-550型台式大容量离心机；分光光度计。2.2 实验步骤2.2.1 芹菜叶的预处理 芹菜叶粉碎按120料液比加无水乙醚40冷凝回流2小时脱脂过滤滤渣干燥后备用。2.2.2 标准曲线的制备及回归方程的建立准确称取芦丁20mg（120烘至恒重）,加95%乙醇
20、水溶液50 mL。准确吸取0、1、2、4、6、8、10、12mL于50mL容量瓶中,加12mL 95%的乙醇,加含5% NaNO2水溶液2mL,摇匀静置6min,再加含10% Al（NO3）3水溶液2mL,摇匀静置6min,再加含5% NaOH水溶液20mL,用95%乙醇水溶液稀释至刻度,摇匀,在490510 nm波长范围内扫描,确定最大吸收波长;在最大吸收波长（510nm）处测定吸光值。以吸收度Y为纵坐标,浓度x为横坐标,进行回归分析,绘制回归曲线。浓度与吸光度有良好的线性关系。得出回归方程:Y=6.363x-0.0119（R2=0.9980）（1）2.2.3 样品总黄酮得率的确定以芹菜叶为
21、原料,经乙醇浸提总黄酮,提取液过滤离心后定容至50mL,每次准确量取1.0mL。代入回归方程（1）中计算,得出提取液中总黄酮含量。总黄酮的得率=C*50/（w*1000）*100 （2）式中：w为样品的质量，单位g；C为提取液中总黄酮的含量，单位mg/mL。2.2.4 单因素试验 选择提取乙醇浓度、超声功率、超声提取温度、料液比、超声提取时间进行单因素试验,考察其对提取率的影响。2.2.5 正交试验根据单因素试验结果,选择超声功率、超声提取温度、料液比、超声提取做4因素3水平正交试验,确定最佳提取条件。正交试验因素和水平见表1。表1正交试验因素和水平表水平A超声波功率/WB提取温度/C料液比/
22、g：mLD超声波时间/min1501:705255608010390152.3 稳定性试验 分别取少量芹菜叶黄酮的提取液进行日光、自然光、避光、加热时间、加热温度、pH、Vc的稳定性实验,在510 nm处测其吸光度,根据芦丁标准曲线的回归方程计算总黄酮含量,由此判断芹菜叶黄酮的光及热稳定性。芹菜叶总黄酮保存率（%）（处理后溶液中总黄酮含量/处理前溶液中总黄酮含量）1002.4 提取物中黄酮类物质的鉴定2.4.1 红外光谱扫描 取少量芦丁粉末与少量在最佳提取条件下干燥后的粉末进行压片，进行红外扫描。2.4.2 紫外可见光谱扫描第3章 结果与讨论3.1 单因素试验3.1.1 乙醇浓度对得率的影响准
23、确称取脱脂后的芹菜叶粉末0.5 g,分别加入50mL的水以及不同浓度的乙醇在60下浸提2h过滤,滤液按方程（2）测定总黄酮提取率。实验结果如图所示。结果表明,在较低浓度条件下,随着乙醇浓度的增加,芹菜叶总黄酮的提取率逐渐提升,到65%的乙醇为溶剂时,总黄酮的提取率达到峰值,之后,总黄酮的得率随着乙醇浓度的增加而降低。因此,选择65%乙醇为最佳溶剂浓度。3.1.2 超声波功率对得率的影响准确称取脱脂后的芹菜叶粉末0. 5g，加入40mL65%乙醇,在60下超声功率分别为0、50W、60W、70W、80W、90W和100W时超声提取10min，过滤，滤液按方程（2）测定总黄酮提取率。结果表明随着使
24、用超声波辅助提取,总黄酮的提取率在增加，而到50W之后，总黄酮提取率随着超声功率的增大而降低。因此50W为最佳提取功率。由于试验仪器的影响，最低的超声波提取功率只能设定在50W。3.1.3 超声波时间对得率的影响准确称取脱脂后的芹菜叶粉末0. 5g，加入40mL 65%乙醇,在60、超声功率为60W时分别超声提取5min、10min、20min、30min和40min，过滤，滤液按方程（2）测定总黄酮得率。结果表明，随着时间的增加,总黄酮提取率增加,但在10min时候达到峰值，之后随着时间的增加,总黄酮提取率降低。所以选择10min为最佳的提取时间。3.1.4 提取温度对得率的影响准确称取脱脂
25、后的芹菜叶粉末0. 5 g，加入40mL 65%乙醇,分别在20、40、50、60、70和78下，超声功率为60W时超声提取10min,过滤,滤液按方程（2）测定总黄酮得率。结果表明,超声提取温度为20至60时,总黄酮得率随着温度的升高而增加,而60之后随着温度的升高,总黄酮提取率降低。因此,选择60为最佳的超声提取温度。3.1.5 料液比对得率的影响准确称取脱脂后的芹菜叶粉末0. 5g，分别加入65%乙醇10mL、20mL、30mL、40mL和50mL，在60、超声功率为60W时超声提取10min,过滤,滤液按方程（2）测定总黄酮得率。结果表明,总黄酮提取率随料液比增大而增大,在料液比为18
26、0时为最大值,随后减小。3.2 正交试验为了全面考察超声波辅助提取的最佳工艺参数，在单因素实验的基础上,选择65%乙醇为最佳提取溶剂,以超声功率,超声提取温度,料液比和超声提取时间这4种因素进行L9（34）正交试验，确定最优方案，结果见表。从表中极差数据可知,超声功率,超声提取温度,料液比和超声提取时间这4种因素对总黄酮提取率影响的主次顺序为：料液比超声波提取温度超声提取时间超声提取功率，最佳的提取条件为65%乙醇浓度，超声功率为55W，超声提取温度为50，料液比为180，超声提取时间为10min，最佳提取条件下所得的黄酮类化合物的得率为0.221%。试验号ABCD黄酮得率0.1931480.188433 30.14835840.19943460.19393470.18136180.13499990.208078K10.5299387080.5739431090.5220807
