1、中国荷斯坦奶牛与鲁西黄牛线粒体DNA多态性和系统进化分析中国荷斯坦奶牛与鲁西黄牛线粒体DNA多态性和系统进化分析中国荷斯坦奶牛与鲁西黄牛线粒体DNA多态性和系统进化分析 ? 第26卷第6期 2008年l2月 上海交通大学(农业科学版)JOURNALOFSHANGHAIJIAOTONGUNIVERSITY(AGRICULTURALSCIENCE)V01.26No.6 Dec.2008 文章编号:1671 中国荷斯坦奶牛与鲁西黄牛线 粒体DNA多态性和系统进化分析 . 邓卫平,焦飞,黄荚., (上海交通大学医学院上海医学遗传研究所;上海市胚胎与生殖工程重点实验室,上海2oo04o) 摘要:为阐明中
2、国荷斯坦奶牛和鲁西黄牛的线粒体DNA多态性及其起源关系,提取了2个品种牛外周血液中的线粒体DNA (mONA),用PCR方法将牛mtDNA全长分为4段进行扩增,并用N/aIII,却alI,BdII等l6种限制性内切酶进行酶解消化,分析 2个品种牛mtDNA的多态性.最终经7种限制性内切酶片段长度多态性分析,共归纳出4种主要的单倍型.通过对2个品种牛 mtDNAD环全序列的聚类分析表明:鲁西黄牛和中国荷斯坦奶牛可能均为混合母系起源.源于欧洲普通牛和印度瘤牛.该研究 结果对提高动物体外受精和体细胞核移植效率等生物技术平台有一定的理论指导意义. 关键词:中国荷斯坦奶牛;鲁西黄牛;线粒体DNA;单倍型
3、;PCR限制性内切酶片段长度多态性分析 中图分类号:$823.919文献标识码:A AnalysisonMitochondrialDNAPolymorphism andPhylogenyofChineseHolsteinCowandLuxiCattle DENGWei-ping,JlA0Fei,HUANGYing (ShanghaiInstituteofMedicalGenetics,SchoolofMedicineShanghai,iiaotongUniversity;Shanghai KeyI.abomtoryofEmbryoandReproductionEngineering,Shang
4、hai200040,China) Abstract:InordertoillustratethepolymorphismmitochondfialDNA(mtDNA1andphylogenyofChineseHolsteinCOWandhI】【i catde,mtDNAWaSextractedfrombovineblood,andthePCRproductionsweredigestedbyN/alIl,aII.gnletcrestrictionen- zymes.Restrictionendonucleasefragmentsweredetectedbyagaroseelectrophore
5、sis.FourmtDNAhaplotypesweregenerated.TheNJ treeindicatedthatthemainoriginsofChineseHolsteinCOWandLu)【icatdemaybefromBostaurusandBo6indicus. Keywords:ChineseHolsteincow;Luxicattle;mtDNA;haplotype;pcr-RFLP 哺乳动物线粒体DNA(mtDNA)是一种存在于 细胞核DNA以外的遗传物质.其基因组大小为 16.0,16.5kb.其中牛的mtDNA全长为l6.3kb.自 从Nass-1于1962年发现线粒
6、体含有自身遗传物质 (mtDNA)后,有关mtDNA的结构,复制,转录,基因 表达调控等方面已积累了大量资料.近年来随着分 子生物学的发展.动物线粒体DNARFLP的分析和 测序技术研究现已广泛应用于动物群体遗传学和进 化生物学等领域的研究21. 本文采用限制性内切酶片段长度多态性 (RFLP)分析和DNA测序方法及生物信息学方法. 对本研究所科研基地的实验用牛(中国荷斯坦奶牛 和鲁西黄牛)的线粒体DNA分段扩增及酶切后进行 单倍型分析,并根据D环测序结果进行2品种牛间 的聚类分析,为实验用牛线粒体DNA的遗传多态性 提供科学资料和在转基因动物研制过程中对胚胎发 育生物学和进化生物学的探索研究
7、以及建立体细胞 核移植的技术平台提供理论基础. 收稿日期:2008-07-02 基金项目:国家.863计划(2007AA100502),上海市重大攻关项目(05DZ19322).上海市重点学科(B204) 作者简介:邓卫平(1972一),男,湖北十堰人,硕士研究生.研究方向:生物化学与分子生物学,E-maihwatcher0508163.corn 通讯作者:黄英(1952一),女,广东人.研究员,研究方向:细胞遗传E 第6期邓卫平,等:中国荷斯坦奶牛与鲁西黄牛线粒体DNA多态性和系统进化分析521 1材料与方法 1.1实验动物 实验用牛由上海医学遗传研究所在松江的科研 基地提供,品种为中国荷斯
8、坦奶牛和鲁西黄牛(其中 中国荷斯坦奶牛410头鲁西黄牛150头). 1.2实验试剂和仪器 实验试剂主要有ExTaqDNA聚合酶,dNTP mix,lOxExTaqBuffer,限制性内切酶(均购自 Takara公司)等;仪器主要有PCR仪,电泳仪,垂直 板电泳槽,凝胶成像仪等. l-3实验方法 1.3.1mtDNA的提取按Brown的方法进行酚/氯 仿抽提mtDNA. 1.3.2线粒体DNA的PCR扩增,纯化,及序列测定 参照本所焦飞先前报道的方法41将线粒体DNA分4 段(HIH4)(表1)分别进行PCR扩增(GenBank登录 号NC006853).PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电 泳检
9、测其大小,纯度及亮度(浓度).每个样品取5 L用于检测,然后用PCR产物回收试剂盒(上海赛 百盛基因技术有限公司)对其剩余的PCR产物进行 纯化与回收.回收后的PCR产物送至上海博尚生物 技术有限公司进行测序. 表1全长mtDNA扩增所用引物汇总 Table1PrimersusedinmtDNAamplification 1.3.3限制性内切酶消化及电泳检测选择A%IrI, HpalI,Bg/llAvaI,BamHI,PstI,EcoRI,HpaI,XhoI, 却hi,ApaI,H/ndIII,SalI,A,cm,XbaI,KpaI16种限制 性内切酶.根据厂家提供的缓冲液和推荐的方法进 行酶
10、切.体系为20L,37?消化过夜.将酶切产物 进行电泳(O.8%一2%琼脂糖凝胶,120V,1h)检测,用 溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)染色.然后观察,拍 照. 1-3.4数据分析以欧洲普通牛(Bostaurus)(Gen Bank登录号:NC001567,L27712和AY526085)和印 度瘤牛(Bosindicus)(GenBank登录号:NC005971, AY689190和L27732)的Dloop序列为对照.利用 ClustalW软件和DNASTAR软件包中的SeqMan 程序排列同源序列,并进行人工核对与校正,用 DNAStar中的NeighborJoini
11、ng(NJ)法构建分子系统 树.分析品种问的进化关系. 2结果 2.1牛的mtDNA限制性多态性和单倍型分析 PCR扩增后的片段产物(图1)经坳I等16种 限制性内切酶酶切后.发现在NlaIIIa,NlaIIIb, HpalI,PstI,AvaII,BamHI,II这7种限制性内切 酶中表现出多态性(图2,表2).将上述内切酶的酶 切结果进行汇总分析,主要可分为A,B,C,D4种单 倍型(表3). lkbH1H2I3H4 图1线粒体DNA分段PCR扩增结果 Fig.1ResultofdifferentPCRamolifieationfragmentsofmtDNA HlH2H3H4 N/aII
12、IHpallHpalIPstIAvailBmHIBg/II 100bpb+一8+一1kb+一+一一+一+一 图2线粒体DNA分段PCR扩增产物的酶切图谱 Fig.2TheprofileofPCRproductionsdesigned byrestrictionenzymes 注:+表示有特定位点的酶切片段.一表示无特定位点的酶 切片段. Note:+indicatesthenceofcleavageatparticularsite,一 indicatestileabsenceofclvageatparticularsite. 2.2实验牛的单倍型分析 共分析了560头实验牛.其中中国荷斯坦奶牛
13、 410头,鲁西黄牛150头,结果显示:4种单倍型在中 522上海交通大学(农业科学版)第26卷 限制性内切酶Endonuelease酶切片段Fragenmnt酶切类型Types切点数Noofcleavage酶切片段长度Fragementsizes/kb 表3牛的mtDNA单倍型类型 Table3HaplotypesofbovinemtDNAbasedOaRFLP 国荷斯坦奶牛和鲁西黄牛中均有分布.且均以A型 和C型为主:其中A型在群体中占25.O%.C型在群 体中占52.O%.实验牛单倍型分析结果详见表4. 表4实验牛单倍型分析结果汇总 Table4Numbersofbovtnehapaot
14、ypes 品种单倍型个体数No.ofhaplotypes Bovinebreeds_ 盘91(22.3),so09.5)b204(49.7)c28(6.8)d7(1.7)e4l0 鲁49(32蛳12(8 . 0)b87(58.o)el(0.6)dtCo.6)dl50 合计Total,%140(25.o)92(16.4)291(52.0)29(5.2)8(1.4】560 注:1).括号外的数字为个体敷,括号内的数字为百分率;2).每 行不同的小写字母a,bCde表示有显着性差异(0LO5). Note:1).Thenumbemoutofthebracketsaretheindividualsth
15、at belon8totherespectivebreedsandthenumbersinthebrackets arepercentages;2).Valueswithdifferentsuperscriptlettersat,c d,edifferwithstatisticalsignificancefP<O.05). 2.32个品种牛之间的亲缘关系以及系统进化分析 选取3头中国荷斯坦奶牛(HC1,HC2,HC3)和3 头鲁西黄牛(LCI,LC2,LC3)的D-loop全序列,其中 HC1,HC2和LC1的D-loop区全序列为910bp;HC3 和LC2,13的D-loop区全序列
16、为91lbpo分别与3 头欧洲普通牛(Bostaurus,GenBank登录号分别为 NC001567,L27712和AY526085),3头印度瘤牛03os indicus,GenBank登录号分别为NCo05971,AY689190 和L27732)的D-loop全序列进行对照,采用Neigh Ix)r-joining法构建了不同牛种的分子系统树(图3). 图3中国荷斯坦奶牛与鲁西黄牛Dloop 全序列NJ分子系统进化树 Fig.3NJtreeofChineseHosteinCOWand LuxicattlebasedOI1D-loopsequence (欧洲普通牛与印度瘸牛为对照) (B
17、oslaumaandBosindieus88contro1) 如图3所示,鲁西黄牛与中国荷斯坦奶牛均为 混合母系来源,均源于欧洲普通牛和印度瘤牛. 3讨论 随着分子生物学的迅猛发展.PCR技术与 第6期邓fJ,等:中国荷斯坦奶牛与鲁西黄午线粒体DNA多态和系统进化分析523 RFLP分析联合应用fPCRRFLP1已成为检测线粒体 DNA多态性和变异的主要方法.目前,该技术已广 泛用于研究家畜如牛,羊,鸡,猴,虎等多种动物的起 源进化,畜群遗传结构,亲缘关系及畜群的群体遗传 结构.以及考察地方品种资源等方面15,61,为物种的 准确分类提供了有力的资料. 单倍型是指使用特定限制性内切酶酶切后产生
18、 特定片段的酶切图谱格局71.mtDNA变异主要表现 在由系统发育构成的单倍型类群的分布上,因此可 利用PCRRFIY方法鉴定出各种畜群含有的单倍 型.对所需实验动物进行线粒体单倍型遗传背景的 大量初步筛选. 在人类的mtDNA单倍型分析中.有些单倍型类 群可以通过控制区,Dloop)某些区域进行划分.但其 他类群由于具有共同的突变区域以及特征位点具有 严重的回复突变现象,因此简单地根据控制区进行 分析和判别往往并不全面,甚至会导致错误结果l8】. 这样就必须结合编码区的多态性位点才可以解决单 倍型类群分析不清的问题. 本文通过聚合酶链式反应(PCR)将实验牛全长 mtDNA分为4段(H1,1
19、t4)进行扩增,随后对扩增产 物用合适的限制性内切酶va?,BamHI,11, nI,?fnIII,PstI)消化绘制限制性酶切图谱,并以 此为依据对实验牛线粒体DNA划分为A,B,C,D4 种限制性单倍.在以往大家畜的研究报道中,未 见有报道通过全长mtDNA划分区域进行单倍型的 分析研究.由表4可以看出.单倍型A和C是2种 基本的单倍型.其余单倍均可认为为由2种基本 单倍型突变而来.少数个体出现了其他的单倍型, 可能来源于几个位点发生偶然突变.但无明显的限 制性规律性.由此可以认为,2品种牛主要起源于2 个母系祖先.这一研究结论与历史考古和形态学研 究91,Y染色体101,cytb基因f1
20、11以及微卫星DNA1研究 结果相吻合. mtDNA分为控制区(Dloop区)和编码区,控制 区的多态性要远高于编码.调控区由于具有较快 的进化速率适合于种内或近缘种的系统发育分析. 而编码区相对的核苷酸保守性则适合于远缘种类或 高级阶元的系统发育研1.通过对鲁西黄牛,中国 荷斯坦奶牛及欧洲普通牛和印度瘤牛的Dloop区 序列的聚类分析表明:鲁西黄牛表现为2个母系起 源.一个是欧洲普通原牛(Bostaurus),另一个是印度 瘤牛型原牛(Bosindicus).中国荷斯坦奶牛为地方培 育品种.起源于欧洲普通牛,主要是引进纯种荷斯坦 奶牛和荷斯坦牛冻精改良本地牛产生的杂种后代. 随着这些杂种牛在
21、当地经过多次选育和培育后,受 到的选择压力较小.因此中国荷斯坦奶牛更多的表 现为混合母系起源,本文研究也证实了这一点.因 此,无论是线粒体单倍型还是Dloop序列的进化分 析研究都清楚的表明中国荷斯坦奶牛和鲁西黄牛均 为混合母系来源,即均源于欧洲普通牛和印度瘤牛. 由于线粒体的突变率.会引起不同种群间及同 一 种群不同个体问mtDNA序列的差异,形成不同的 单倍型.这种差异也可引起生理状况的不同.例如在 奶牛中引起产奶量及生育能力的差异14,151.来自体 外胚胎生产和体细胞核移植的研究均表明.不同单 倍型的线粒体DNA对胚胎的发育会产生明显的影 响.本研究所在体细胞核移植实验的研究结果中也
22、得出相似的结论【51:即利用线粒体单倍型相同的受 体卵僻细胞与供核细胞与线粒体单倍型不同的受体 卵母细胞与供核细胞进行核移植,发现前者生成的 重构胚不仅得到的囊胚数量明显多于后者.而且A 级囊胚的势量也明显优于后两者.如果由不同 mtDNA单倍型的受体卵母细胞和供体细胞形成重 构胚.这种不匹配的单倍型可能就会影响重构胚的 发育能力. 因此可以相信.通过对动物线粒体DNA多态性 及进化分析的研究.必将会对提高动物体外受精和 体细胞核移植效率等生物技术平台提供一定的价值 及理论指导意义. 参考文献: 【1】MargitMK,NassS.Fibrousshuctttreswithinthematri
23、xof developingchickembryomitochodial【J.ExpCellRes, 1962,26(2):42437. 2】冯洁,谢建云,胡建华,等.上海地区实验用兔线粒体 DNARFLP分析J.上海交通大学(农业科学版), 2007,25(6):547550. 【33BrownDR,KoehlerCM,LindbergGeta1.Molecular analysisofcytoplasmicgeneticvariationinHolsteinCOWS【J. JAnimSci,1989,67(8):1926-1932. 【4JiaoFei,YanJingBin,YangXia
24、oYu,eta1.Effectofooeyte mitochondrialDNAhaplotypeonbovinesomaticcellnuclear transferefficiencyJ】.MolecularReproductionand Development,2007,74(10):1278-1286. 【5焦飞,颜景斌,李华,等.体细胞核移植克隆牛的遗传 物质鉴定【J.上海交通大学(农业科学版),2006,24(3): 268272. f61彭华,许尚忠,昝林森.牛线粒体DNA的研究方法【J.中 国畜牧兽医,2004,31(9):2931. 【7】李建华,王继文.动物线粒体DNA在进
25、化遗传学研究中 的应用【J.生物学通报.2005,2(40):5-7.(下转第527页) 第6期王玉涛.等:利用皮特兰作父系商品猪肉品质的灰色关联度分析527 表65个组合商品猪肉质测定结果的关联度 Table6GreycorrelativedegreeResultofmeat qualityoffivecombinationcommercialpigs 5个组各通过灰色关联度分析结果表明:皮杜B 商品猪肉质综合性状最优,具有较好的配套效果.按肉 质优劣综合评价顺序依次为皮杜B>杜长大> 皮杜长大>皮杜>皮杜大.皮杜大的肉质最 差.说明皮杜公猪与大约克母猪杂交(皮杜大)
26、,不宜 用于肉猪生产;而与培育品种杂交,其肉质最优. 3讨论与结论 3.1分析肉质测定结果可知.利用皮杜公猪作配 套父系,可明显提高商品猪的瘦肉率.即使是与培 育品种华特B系杂交.生产的皮杜B胴体瘦肉率 仍达66.41%,但皮杜B的背膘较厚,还需进一步 改良,而pH,肉色,失水率,大理石纹,嫩度等指标较 理想,是一种肉质较优的品质.参试组合皮杜品 种肉质指标不理想.出现PSE肉,而皮杜大肉质 综合评定位次居最后. 3.2对各组合的肉质各性状进行灰色系统关联分 析.结果表明,引入皮特兰血的皮杜B最优,其次 是杜长大,皮杜长大与杜长大肉质接近,说 明以提高瘦肉率为目标利用皮杜公猪.皮杜长 大4系配
27、套组合和皮杜公猪与培育品种杂交肉 质较佳,但皮杜和皮杜大不宜用作商品猪生产. 3-3华特B系猪是甘肃省在九五期间利用地方 品种资源育成的新品系,其特点是瘦肉率高,肉昧浓 香.肉质良好【111.本次研究表明:华特配套系B系与 皮杜公猪具有较好的杂交效果.且肉质优于杜长 大.说明我国培育品种在优质猪肉生产过程中.是 较好的配套品种(系). 3.4灰色关联度分析法最初由邓聚龙教授创立I6. 目前已在作物育种,分类和品系鉴定等方面广泛应 用.但在动物育种方面应用报道较少,从本文结果 看,这种方法在猪肉品质的综合评定中有较强的实 践指导意义,但理想品种各项指标的确定直接影 响其综合评定的准确性.所以理想
28、品种的各项值 应根据所分析品种的不同特性并结合育种目标来确 定.以保证综合评定结果的可靠性和实用性 参考文献: 【1】赵忻红,陈润生,郭立民.皮特兰猪的特征,特性与利用【J. 黑龙江动物繁殖,1994,2(1):6. 【2】姚德标,谢丕雄,廖波,等.皮特兰猪做杂交父本利用的 研究【J.养猪,2002(2):1921. 【3】李涛.皮特兰猪的引进与科学利用【J】.吉林畜牧兽医, 2004,1:38. 4邓聚龙.农业系统灰色理论与方法【M】.济南:山东科学技术 出版社.1988:1-62. 【5陈润生.优质猪肉的指标及其度量方法【J.养猪业,2002 (3):t-5. 6】全国猪肉研究专题协作组.
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