1、该试剂盒采用特殊的吸附膜,能够有选择性地吸附核酸分子,去除反应液中的各种酶蛋白、引物、dNTP 等,得到高质量的 DNA 纯化产物,可直接用于酶切、测序等后续的分子生物学试验。本试剂盒具有以下特点:1.适用范围广,回收效率高,对于100 bp 10kb之间的DNA片段回收效率在90%以上。2.操作简单快速,整个回收过程仅须5分钟左右。3.洗脱效率高,洗脱体积最小可低至15 l。快速操作流程(快速操作流程(PCR 产物纯化)产物纯化)1.准备工作。a.检查 Wash Solution 中是否已加入乙醇。b.检查 Buffer B3 中是否已加入异丙醇。c.检查 Buffer B3 是否出现沉淀。
2、2.在PCR反应液中加入5倍体积的Buffer B3,充分混匀。3.8,000 g离心30秒。倒掉收集管中液体。4.加入500 l Wash Solution,9,000 g离心30秒,倒掉收集管中液体。5.重复步骤4一次。6.空柱于9,000 g离心1分钟。7.将吸附柱放入一个干净的1.5 ml离心管中,在吸附膜中央加入15-40 l Elution Buffer,室温静置1分钟后,离心1分钟。保存管中DNA溶液。收集 上柱 洗涤 洗脱 收集 上柱 洗涤 洗脱 试剂准备试剂准备 1.自备材料:水浴锅、小型高速离心机(最大离心力 12,000 g)、1.5 ml离心管、无水乙醇、异丙醇等。2.
3、按瓶身标签说明在Wash Solution中加入相应量的无水乙醇(乙醇终浓度为80%),混匀后在瓶身做好标记。密封于室温保存。3.按瓶身标签说明在Buffer B3中加入相应量的异丙醇(异丙醇终浓度为20%),混匀后在瓶身做好标记。4.Buffer B3在低温下可能产生沉淀,使用前请检查,如有沉淀,请于37C溶解沉淀,待冷却至室温后使用。标准纯化步骤标准纯化步骤 1.将PCR反应液或酶促反应液移至一干净的1.5 ml离心管中,加入3倍体积的Buffer B3,充分混匀。首次使用前请先检查是否已加入适量的异丙醇。若反应液体积过小,可用 TE 或水补足至 100 l,然后再加入 300 l Buf
4、fer B3。2.将混合液全部移入吸附柱,8,000 g离心30 sec。倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中。如果体系总体积大于 750 l,则每次使用 750 l,多次上柱。将滤出液再次加入吸附柱中再次过柱,可以进一步提高 DNA 回收率。3.向吸附柱中加入500 l Wash Solution,9,000 g离心30 sec。Wash Solution 首次使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇。4.重复步骤3一次。5.将空吸附柱和收集管放入离心机,9,000 g离心1 min。此步绝不可省略,否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。6.在吸附膜中央加入1540 l Eluti
5、on Buffer,室温静置12 min,9,000 g离心1 min。将所得到的DNA溶液置于-20C保存或用于后续试验。Elution Buffer 为 2.5 mM Tris-HCl,pH 8.5,可以用 TE 或水(pH 7.0)代替。将 Elution Buffer 预热至 60C 可以进一步提高得率。如果片段 4 kb,在 3760C 温浴 2 分钟可以显著提高得率。请勿使用小于 15 l 的洗脱液进行洗脱。常见问题解答常见问题解答 1.PCR产物回收效率较低或者未回收到目的片段 a.Wash Solution 中未加入正确量的无水乙醇。b.提高 Buffer B3 的相对浓度,增
6、加 DNA 与吸附膜的作用时间(静置时间),在一定程度上可以提高回收率。c.如果纯化的片段长度大于 4 kb 或者目的片段含量较少,可将洗脱液再次加入吸附柱进行洗脱,以提高回收效率。d.洗脱液加入位置不正确。洗脱液应加在硅胶膜的中心部位,以完全覆盖硅胶膜的表面,达到最大的洗脱效率。e.洗脱液不合适。洗脱缓冲液的 pH 值对洗脱效率有影响,如果使用水进行洗脱,请确保其 pH 值 7.0,pH 值过低可能导致低洗脱效率。f.洗脱时将洗脱液预热至 60C 后使用,有利于提高洗脱效率。g.洗脱时间过短。洗脱时间对回收率也有影响。洗脱时放置 1 分钟可达到较好的效果。2.回收的PCR产物进行后续酶切或者
7、连接效率低 a.若洗脱产物中含有残留的乙醇会影响酶切。可将空柱离心后的吸附柱开盖室温晾干 25 分钟,有助于残留的酒精挥发完全。b.盐份的残留。请确保使用 Wash Solution 冲洗两次,每次 500 l 沿管壁加入,有助于彻底去除管壁上的盐份。c.回收后的 PCR 产物在反复冻溶的情况下,会加速末端 A 和整个 PCR 产物的断裂,从而造成与 T 载体连接或直接酶切效率的下降。建议回收后立即进行酶切或连接实验。d.选择合适的 PCR 产物和 T 载体的分子数比例,有助于提高连接效率.e.请确保 PCR 最后 72C 510 分钟的延伸时间,这样才有足够的 PCR 产物在末段带有 A 附加碱基,保证较高的连接效率。3.回收的片段为什么电泳上样会漂起来?主要原因是纯化过程中的乙醇没有去除干净。可将离心后的吸附柱开盖室温干燥 25 分钟,有助于残留的酒精挥发完全。