1、其中，短 QT 综合征和 Brugada 综合征是由于 LTCC 的 和 亚单位的 A39V 突变而导致 LTCC 功能丧失，从而表现出高发心源性猝死，伴晕厥、房颤，心电图表现分别为短 QT 间期和 Bruga-da 波;Timothy 综合征是由于编码 LTCC 的基因中一个剪接变异体 G1216A 错义突变，使 406 位甘氨酸被精氨酸取代，结果使 LTCC 活性功能几乎消失，表现为通道“功能增强”;房颤时，亚单位表达降低与钙电流降低平行一致，而 亚单位表达降低致LTCC 功能降低。由此可见，心肌 L 型钙通道的功能调节在人体病理生理方面发挥着至关重要的作用。一、LTCC 的分子结构自从发
2、现 LTCC 以来，大量的研究表明它对Ca2+具有选择性作用，其对 Ca2+的通透性是 Na+的一千倍，是目前已知选择性最强的离子通道。LTCC是镶嵌在脂质双层膜上的大分子蛋白质构成的亲水性孔道，是糖蛋白或外侧糖基化的蛋白。LTCC 是由 1、2/、五个亚单位构成的复合物，并且由多基因编码，其分子量为 400kD（Mori 等 1996）。在 LTCC 复合物中，1是主要亚单位，分子量约为 170 240kD。1亚基镶嵌于细胞膜脂质双分子层中，为孔道组成蛋白亚基。不同类型的钙通道其 1亚单位的编码基因有所不同，因而其结构也不相同。LTCC 的 1亚基的编码基因有 1C、1D、1S、1F 四种，
3、其中只有 1C（Cav 1 2）基因在心肌高表达（Bodi 等 2005）。1亚基由四组基本相似的跨膜序列（序列 I IV）组成，它的每一个跨膜区域均由 6 个跨膜 螺旋（S1 S6）构成。在序列 I 序列 II 膜内连接链，即 I-II loop 上，有一含多个氨基酸的片段，称为 1亚基结合区域（1-interaction do-main，AID），能与多种蛋白结合。1亚基的 N-末端和 C-末端均位于胞浆内侧。C-末端存在多个重要功能结构，包括两处钙调蛋白（calmodulin，CaM）的结合 序 列:异 亮 氨 酸-谷 氨 酰 胺（isoleucine-glu-mamine，IQ）序列和
4、 pre-IQ 序列（图 1）。目前已知的 亚基有四种亚型（1 4），分子量为 55kD。其中，1又可分为 1a和 1b;2又可分为 2a、2b、2c和 2d。它们位于细胞膜的内侧，都是疏水、非糖基化的蛋白。心脏主要表达 2c，其基因位于人类染色体 10p12。亚单位主要与 1亚基的 AID 结构连接，然而 亚基也存在自身的 亚基结合区域（-interactiondomain，BID），位于1亚*国家自然科学基金（81100108）和辽宁省教育厅高校科研项目计划（L2010572）资助课题通讯作者273生理科学进展 2013 年第 44 卷第 5 期基的 N-末端（Chen 等 2004）（图
5、 1）。亚基在 1亚基装配及表达中起着重要的作用。亚基存在多处蛋白激酶的磷酸化位点，参与通道的磷酸化过程的调节，可加速 Ca2+通道激活及改变其药理性质。2/亚基分子量约 170kD，包括 2和 两部分，其中 2是位于细胞外的糖基化蛋白而 是与2相连的一个疏水跨膜的蛋白。2和 亚单位均是由 7q21 q22 基因编码，转录翻译后因蛋白水解而裂解成两个片段，而后二者又以二硫键形式相连。跨膜的 蛋白与 1亚单位相邻近，其通过二硫键将位于细胞膜外侧的 2蛋白锚定在细胞膜上。亚基分子量为 30kD，之前研究认为 亚基是由单一基因编码的，并且只存在于骨骼肌中。但是目前已有 8 种编码 亚基的基因被发现，
6、即 1 8（Kang 等 2010）。心肌 LTCC 主要表达 6亚基，但其功能尚不明确，可能是在 LTCC 的膜运输中发挥重要作用。图 1L 型钙离子通道的分子结构BID:N 末端上与 结合的序列;AID:I-II loop 上与 结合的序列;Pre-IQ，IQ 和 NSCaTE:CaM 结合序列;IQ，NSCaTE 和*:CaBP1 结合序列;IQ:calpastatin 结合序列二、LTCC 在心肌中的基本功能在心脏中，Ca2+通过 LTCC 的内流是一个多功能的信号，这一过程引发了心肌的收缩，控制动作电位的时程并且能够调控基因的表达1。少量的Ca2+通过心肌细胞膜上的 LTCC 进入心
7、肌细胞后，能够与心肌细胞中肌浆网上的雷尼丁受体（ryanod-ine recepters，ys）结合，使肌浆网上的通道开放，大量的 Ca2+从心肌细胞中的肌浆网（亦称为钙库）中释放进入胞浆，这一过程称为钙触发钙释放。这一过程使心肌细胞胞浆内的 Ca2+浓度急剧上升，从肌浆网中释放的 Ca2+与肌钙蛋白 C 结合而引起心肌的收缩，形成了心脏的每一次跳动。Ca2+通过 LTCC 的内流参与构成了心室肌细胞动作电位的基础。心室肌细胞的动作电位分为五相，分别为 0 相、1 相、2 相、3 相和 4 相。Ca2+通过LTCC 的内流能够参与其中的 0 相的末尾，并且在 2相中，Ca2+的缓慢内流和 K+
8、的外流共同形成了心室肌细胞动作电位的平台期。LTCC 是多种神经递质、激素及药物的作用靶点。LTCC 的 1C 亚 单 位 是 二 氢 吡 啶 类 药 物（DHPs）的结合位点，此外 2亚基也具有 Ca2+拮抗剂的结合位点，如苯烷胺类、DHPs 和硫氮唑酮类等。各种各样神经递质，激素和自体有效物质通过参与多重酶的反应过程，从而对 LTCC 的活性进行调节2。三、LTCC 的钙依赖性调节Ca2+在所有类型的细胞中是一个多方面的信号转导元件。在心脏中的每一个兴奋周期中，它都是参与心脏收缩的必要条件。Ca2+是兴奋-收缩（EC）耦联中的关键因素。在每个心动周期中，在动作电位期间膜的去极化能够激活位于
9、心肌细胞膜上的LTCC。Ca2+进入细胞激活了位于肌浆网上的 Ca2+释放通道，即 ys。ys 使最初的 Ca2+信号放大，因而能够提供足够的 Ca2+来激活有收缩性的肌原纤维。然而，Ca2+不仅是心脏 EC 耦联中的一个关键因素，它还能控制一些心肌细胞的重要过程，包括初始起搏点的活动、动作电位的形成、细胞与细胞之间的交流，而且它还是心脏信号转导的关键的第二信使，能够控制兴奋、代谢和转录的调控3。Ca2+能够激活 Ca2+依赖性的转录因子，这个过程叫做兴奋-转录（ET）耦联。ET 耦联和 EC 耦联有着共同的信号通路，能够调控 EC 耦联激活转录因子，从而达到调控 LTCC 的作用。此外，细胞
10、内的 Ca2+还能够调节基因的表达。有文献报道称 Ca2+能够调节大鼠成熟心室肌细胞中 Ca2+通道的表达（Davidoff 等1996）。根据上文所述，LTCC 的 1亚单位是 DHPs类药物的结合位点，因此验证在高浓度 Ca2+条件下和正常浓度的 Ca2+条件下 DHP 受体的表达多少和DHP 受体 mNA 的表达多少可以分别从转录和翻译水平上说明 Ca2+对 LTCC 表达的调控作用。Dav-idoff 等人得出这样的实验结果，大鼠心室肌细胞在高浓度 Ca2+的条件下，DHP 受体和 DHP 的 mNA表达水平都比正常浓度 Ca2+的条件下的表达水平要高（Davidoff 等 1996）
11、。因此，Ca2+能够有助于心肌 LTCC 的表达。Ca2+依赖性的机制是 LTCC 失活的主要机制。373生理科学进展 2013 年第 44 卷第 5 期对于 Ca2+依赖性的分子机制和单通道的研究揭示了 Ca2+依赖性的失活是通过 Ca2+结合于细胞内的LTCC 的 1亚单位的 EF-hand 序列引起了 LTCC 门控状态的改变。然而近年来研究表明，Ca2+从肌浆网中释放对 LTCC 的失活也具有重要的贡献作用。Ca2+从肌浆网中释放介导失活的主要机制是:当Ca2+释放发生的时候 LTCC 则关闭，目的是为了减少 Ca2+的流入并且使随后发生的 Ca2+的迁移所需要的能量减少到最小。（一）
12、钙调蛋白（calmodulin，CaM）对 L 型钙通道的钙依赖性调节CaM 是普遍存在的主要的Ca2+结合蛋白，直接或间接地调控着许多重要的生理功能，例如酶的调控，基因的表达，神经中枢的活性和肌肉的收缩（Han 等 2010）。CaM 是由两个小叶（分别称为 N-lobe 和 C-lobe）和连接二者的连接链结构（称为 interlobe）组成的蛋白多肽。每个小叶（即 N-lobe 和 C-lobe）包含两个 Ca2+结合位点（称为EF-hand 结构），每个 EF-hand 结构能够结合一个Ca2+（Han 等 2010）。N-lobe 和 C-lobe 在序列上具有高度同源性，然而它们对
13、 Ca2+的亲和力却不同4。N-lobe 的 EF-hand 结构结合 Ca2+的亲和力较低，而 C-lobe 的 Ca2+亲和力较高5。CaM 能够与 Cav1 2 1亚单位的多个部位结合，包括 Cav1 2 的 C 末端的 IQ 区域，pre-IQ 区域和Cav1 2 序列 I II loop 等，从而调节 LTCC 的活性6。CaM 主要通过参与两个相反地机制来控制Ca2+的流入:钙依赖性失活（CDI）和钙依赖性易化（CDF）5。CDI 是指通道开放后，细胞内 Ca2+的增高使通道的 Ca2+通透性反而衰减，是钙通道失活的主要机制。CDF 作用是指细胞内 Ca2+促进通道的Ca2+内流。
14、在 Cav1 2 上，与 CDI 有关的 Ca2+/CaM结合部位称为 I，与 CDF 有关的 Ca2+/CaM 结合部位称为 F，而 EF 区域是引起继发性 CDI 的内在Ca2+结合区域。在 Cav1 2 的 F 区域游离的情况下，即使在低浓度 Ca2+的情况下，通道也能处于 run-down 状态（通道关闭）。在低浓度 Ca2+或无 Ca2+，CaM 浓度适度增加的情况下，Cav1 2 易化区域 F 区域与 apoCaM 结合，而失活区域 I 区域则是游离的，此时我们称为 CaM 依赖性易化（CaMDF）。当 CaM浓度进一步上升的时候，Cav1 2 的失活区域 I 区域也同 CaM 结
15、合，此时我们称为 CaM 依赖性失活（CaMDI）。近年研究发现了一个新的 Ca2+/CaM 结合序列，即 NSCaTE（N-末端立体的钙离子转化元件）（图1），该序列仅存在于 Cav1 2 和 Cav1 3 的细胞质的氨基酸末端。研究发现 NSCaTE 在通道细胞质内的N 末端区域采取的是 螺旋的构象。该序列的这种 螺旋的构象和 CaM 结合的其他序列不一样，因为大多数的线性多肽不能以稳定的二级结构存在于水溶液中。NSCaTE 序列与 Ca2+/CaM 结合的有着不同寻常的化学计量比，为 21，因为 CaM 的每个lobe 均能与一个 NSCaTE 结合，且 N-lobe 与之的亲和性比 C
16、-lobe 更高。同能与 CaM 结合的其他序列相比，Ca2+/CaM 与该序列的结合力较弱。NSCaTE序列也能够参与 CDI 的调节过程，并且该序列对Cav1 2 和 Cav1 3 的功能上的重要性已经被在体实验所证实。静息状态下，CaM 结合于 IQ 序列，当膜去极化时 CaM 与 Ca2+结合，结合 Ca2+的 CaM 即Ca2+/CaM 与 NSCaTE 结合，导致 CDI 过程5。（二）钙结合蛋白 1（calcium-binding protein 1，CaBP1）对 L 型钙通道的钙依赖性调节CaBP1 是钙调蛋白同系物钙结合蛋白（CaBPs）家族中的一员。CaBP1 能够抑制
17、Cav1 2 由 CaM 介导的 CDI，并且能够介导 CDF7。同 CaM 结构相似，CaBP1 同样含有 C-lobe，N-lobe 和连接二者的 interlobe。每个lobe 都含有两个 EF-hands 结构，是 Ca2+的结合部位。N-lobe 的两个 EF-hands，EF1 和 EF2 是不易结合 Ca2+的，通常以载脂 apo-（即无 Ca2+结合）形式存在，而 C-lobe 的两个 EF-hands，EF3 和 EF4，每个都结合一个 Ca2+。而与 CaM 不同的是，CaBP1 的 N末端是经豆蔻酰化作用的，但经实验证实，这部分的豆蔻酰化作用并不是 CaBP1 抑制 C
18、DI 所必须的7。N-lobe 对 Ca2+相对不敏感，并且 CaBP1 连接 C-lobe和 N-lobe 的 interlobe 相对于 CaM 的更长。CaBP1的 C-lobe 与 CaM 的 C-lobe 在结构与功能上很相似，并且能够以高亲和力结合于 Cav1 2 的 IQ 区域，这一区域与 Ca2+/CaM 同 IQ 的结合区域相互重叠。而相比之下 N-lobe 和 interlobe 部分包含的元件使CaBP1 具有区别于 CaM 的特有的功能，因此对于CaBP1 来说是至关重要的。在 Cav1 2 的 N 末端不与 NSCaTE 重叠的部分，有一段序列是 CaBP1 特异性结
19、合的序列（图 1），该序列不能与 CaM 结合，但却能以 Ca2+-或 apo-的形式与 CaBP1 结合。CaBP1 与 CaM 作用的对立，可能由于它们分别作用于 Cav1 2 的 N 末端的 CaBP1 特异性结合序列和 C 末端的 IQ 序列，促进两种对立的构象变化所致。由于 CaBP1 和 CaM 的结构上很相似，所以也研究了 CaBP1 同 NSCaTE 是否能够结473生理科学进展 2013 年第 44 卷第 5 期合，结果表明仅仅 Ca2+/CaBP1 的 C-lobe 能够与NSCaTE 序列结合，并且结合力很弱。最近 CaBP1 X射线结构的这一问题的成功解决能够帮助我们理
20、解NSCaTE 这一序列在复杂的 CDI 调控网络中的可能发挥的作用，这一复杂的 CDI 调控网络包含有CaM、CaBP1、IQ 和 Cav1 2 的 N 末端（包括 NSCaTE和 CaBP1 特异性结合区域）。然而研究者们还发现Ca2+/CaBP1 能够与 IQ 结合，但是与 CaM 不同的是，IQ 与 CaBP1 的结合对于 N-lobe 和 C-lobe 是相同的。将 CaBP1 的 C-lobe 的一个或者是两个 EF-hands 都突变，将会恢复部分抑制的 CDI 效应5。（三）钙蛋白酶抑素（calpastatin，CS）对 L 型钙通道的钙依赖性调节CS 是 Ca2+活化的半胱氨
21、酸蛋白酶 calpain 的内源性抑制剂。CS 在细胞的粘附，形状的改变，迁移和凋亡等过程中起着关键的作用8。CS 分子是由 4 个重复的同源的结构域（do-mains1 4）和 N 末端的结构域（domain L，即 CSL）组成的。Domains 1 4 具有 calpain 的抑制作用，然而 CSL却没有抑制 calpain 的作用9。研究表明CSL具有恢复 LTCC 活性作用，此外 CSL是 CaM 结合部位的部分激动剂8，10。CS 能够调控 Cav1 2 通道的活性，主要通过以下两个方面:一方面 CS 的 domains1-4 能够抑制 cal-pain 的功能。Calpain 能
22、够被体内升高的 Ca2+所激活，进而导致通道蛋白的裂解，使通道呈现不可逆的run-down 状态。CS 能够抑制 calpain，因此能够阻止通道蛋白的裂解，并且直接与通道相互作用而共同调控通道的活性9。另一方面 CSL具有钙通道的活化功能10。经研究表明，CSL能够与 Cav1 2 C 末端的 IQ 区域以部分 Ca2+依赖的方式相互作用，即CSL在有 Ca2+和无 Ca2+存在的条件下均能够与 IQ结合，并且在有 Ca2+存在的条件下，CSL与 IQ 的结合更多。然而，CSL与 Cav1 2 的 C 末端的其他部位，如 EF-hand 和 N 末端、I-II、II-III loop 的结合
23、几乎是可以忽略不计的。IQ 是 CaM 发挥 CDI 和 CDF功能的主要结合区域，CSL也能与 IQ 结合，那么 CSL是同 CaM 竞争结合于 IQ 而产生对通道的调节作用，还是直接与 CaM 结合而调控通道的活性也被进一步阐述。研究发现 CSL不能直接与 CaM 结合9，而是同 CaM 竞争结合于 Cav1 2 的 C 末端的 IQ 区域而达到调控通道活性的目的。这一竞争作用被称之为 CSL是 Cav1 2 通道活化的 CaM 结合区域的部分激动剂8。关于这一竞争性作用的假说是:在低浓度 Ca2+存在的条件下，CaM 主要以 apo-CaM 形式存在，由于 apo-CaM 相对于 IQ
24、区域具有较高的亲和力，因此apo-CaM 主要结合于 IQ 区域，产生了通道的基本活性。此时，由于 apo-CaM 与 N 末端，I-II loop 和 pre-IQ 的低亲和力，所以他们之间的相互作用可以忽略不计。而 CSL此时与 apo-CaM 竞争结合于 IQ 区域，因此在 apo-CaM 存在的条件下，CSL以浓度依赖的方式部分抑制了 CaM 的通道激活作用。当 Ca2+升高的情况下，CaM 主要以 Ca2+/CaM 的形式存在。因为 Ca2+/CaM 与 IQ 的亲和力比 apo-CaM 与 IQ 的亲和力要高，因此 IQ 区域更多的被 Ca2+/CaM 所占据，进而导致通道 CDF
25、。当 Ca2+浓度进一步升高时，Ca2+/CaM 与其他部位如 N 末端，I-II loop 和pre-IQ 区域的亲和力也升高，此时引起了通道的CDI，因为 CSL不能与上述区域结合，因此在相对高浓度的 Ca2+存在的条件下 CSL不影响通道的 CDI。（四）钙 调 蛋 白 激 酶 II（Ca2+/calmodulin-de-pendent protein kinase II，CaMKII）对 L 型钙通道的钙依赖性调节钙调蛋白激酶 II，即 CaMKII 参与LTCC 的调节。聂宏光和郝丽英等在实验中应用CaM 和 CaMKII 抑制剂以观察对 LTCC 的 CDI 和CDF 的影响，发现
26、 CaM 在 Ca2+依赖性的自身调节的 CDI 和 CDF 这两种反馈中是至关重要的分子，而CaMKII 在这两个过程中仅起了辅助作用，CaM 至少不完全是通过 CaMKII 来发挥其调控作用。而之所以 CaMKII 在 CDF 和 CDI 过程中能发挥上述作用可能是因为在应用了 CaMKII 阻断剂后，ys 的磷酸化被抑制，继而 Ca2+释放减少，导致细胞内 Ca2+浓度减少，影响了 CDF 和 CDI 的时程11。CaMKII 除发挥上述的作用调控 LTCC，还能通过下游调控元件拮抗调节子（downstream regulatoryelement antagonist modulator
27、，DEAM）的易位来抑制心肌 LTCC 的 1亚单位基因（Cacna1c）的转录12。之前研究表明细胞内的 Ca2+能够调节 DEAM 的核易位，onkainen 等人对 CaMKII 是否参与了这一过程做了深入的研究。研究结果表明，DEAM 的核定位不仅需要 CaMKII 也需要 Ca2+的参与。CaMKII能够使 Ca2+介导的转录抑制剂 DEAM 易位进入到细胞核中，因而促进了 DEAM 介导的转录抑制。因此 LTCC 通过 Ca2+-CaMKII-DEAM-LTCC 级联效应导致 LTCC 表达抑制12。四、LTCC 的自我调节LTCC 除了能经上述的 Ca2+依赖性调节外，还573生
28、理科学进展 2013 年第 44 卷第 5 期能够被自身所调节。在 Ca2+调控蛋白质的表达和/或功能方面，细胞一定具有补偿性的改变以维持Ca2+平衡。LTCC 是主要的心肌细胞质 Ca2+进入途径，而 Na+-Ca2+交换体（NCX）是主要的流出途径。NCX 的缺失能够介导 Ca2+超载和致命的心律失常。然而实验中令人惊讶的是，NCX 基因敲除小鼠仍然具有活力，具有接近正常的心脏功能，并未出现想象的钙超载导致致命的心律失常而引起死亡13。Henderson 等利用膜片钳技术研究发现，NCX 敲除细胞中 ICa与正常对照组相比明显降低13。很明显Ca2+的平衡是由 Cav1 2 和 LTCC
29、电流（ICa，L）补偿性下调所维持的。相反，LTCC 基因的长期阻滞能够减弱 ICa，L，并且能够引起 NCX 补偿性下调14。LTCC 的持续阻滞能够上调 Cav1 2 的表达。有人提出这样一个假说，LTCC 能够感受到 Ca2+流入的降低，从而反应到细胞核上调 Cacna1c 基因的表达。进一步实验研究，将载有编码绿色荧光蛋白结合的 Cav1 2 的 C 末端（CCT）质粒转染到心肌细胞并追踪到 CCT 进入到了活细胞的细胞核中。染色质免疫共沉淀的实验方法证明了 CCT 与 Cav1 2 的启动子在 NKX2 5/MEF-、C/EBP-、CM1-部位相互作用，而不是在 cre-元件，并能够
30、抑制 Cav1 2 的转录15。上述实验证明了 CCT 在心肌细胞中是一个转录调控者。五、展望Ca2+参与心肌 LTCC 的调节，包括 EC 耦联，ET耦联和基因的表达等，是心脏行使正常功能功能的必要条件，LTCC 调节的失衡将会导致致命的心脏疾病，因此对 LTCC 的 Ca2+依赖性的调节的研究有助于心脏疾病的预防与治疗。随着更多学者对LTCC 研究的深入，LTCC 的调节机制也会得到进一步的完善。参考文献1Shaw M，Colecraft HM L-type calcium channel targetingand local signalling in cardiac myocytes
31、Cardiovasc es，2013，98177 1862awat DK，Hecker P，Watanabe M，et al Glucose-6-Phos-phate dehydrogenase and NADPH redox regulates cardiacmyocyte L-type calcium channel activity and myocardial con-tractile function PLoS One，2012，7e453653Dominquez-odriquez A，uiz-Hurtado G，Benitah JP，etal The other side of cardiac Ca2+signaling:transcr
