1、HEMassonVGpas免疫组化TUNEL染色步骤包埋，就是将已经经过固定，脱水，透明，浸蜡的组织块从最后的蜡浴取出置入充满熔融石蜡的包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却，这个程序称为包埋。包埋剂凝固后，进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。 一石蜡包埋法 石蜡包埋法是制作光学显微镜切片的常规方法，它有许多优点，操作简易便于掌握，可进行连续切片，包埋后的组织可以长期保存。 包埋的方法有自动包埋机包埋和手工包埋两种。手工包埋的步骤如下： 1.组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。 2.准备好包埋框，
2、将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。 3.迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。 4.待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有一层透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。 5.蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切，准备制成切片或储藏备用。 二石蜡包埋的注意事项 1.作为包埋组织使用的石蜡不仅由于气候的不同需要加以选择，而且与组织的硬度也有密切关系，过硬的组织最好用硬度较高的石蜡包埋，反之，软组织则应
3、以硬度较低的石蜡包埋。其熔点一般要求再60。C左右。 2.包埋用石蜡加温不可过高，以保持其不凝固为度，温度过高容易将组织烫坏，使得组织变硬，变脆，并发生卷曲，收缩变形而不利于切片，甚至影响诊断。另外注意埋蜡的温度和组织本身的温度，两者是否合适，温度不一致常可造成组织与周围石蜡脱裂的现象，而达不到包埋的作用。 3.包埋用石蜡应掌握用量，以组织全部包埋完毕，石蜡也恰好用完为宜。 4.包埋应注意组织病变面放在下面，并尽可能使组织放平，在不损伤组织的情况下可用镊子轻压。 5.囊壁和消化道等组织包埋时更应注意组织方位，应将组织块直立拉平，不要卷曲。 6.相同组织如包埋于一个蜡块时，除包平外，还要注意方向
4、的一致，以利切片。 7.多块组织和碎组织包埋于一个蜡块内时，组织的排列一定要密挤靠拢，以求成直线或方块行，这样有利于切片。 8.石蜡包埋后，不宜冷凝过慢，特别是室温较高时，石蜡凝固后应立即投入冷水中加速冷却可增加石蜡密度，韧性和硬度。但冷凝过速也会因为内外温差过大造成蜡块裂损。 石蜡切片的制作过程主要包括：取材，固定，脱水，透明，透蜡，包埋，切片，贴片，染色，透明，封藏等步骤取材和固定： 处死动物后立即切取组织块，并快速投入固定液中。脱水和透明： 酒精（min）酒精（min）酒精（min）无水酒精（min）无水酒精（min）二甲苯、（min）2mm45-6045-6045-6015-302-4
5、mm60-12060-12060-120304-5mm120-240120-240120-24060注意事项：1.脱水应彻底，否则材料不能透明，影响石蜡的浸入，致使难以切片。2.在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。3.在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。4.如需过夜，应停留在70%酒精中。5.使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。浸蜡和包埋：浸蜡：将透明的组织放入蜡杯（）蜡杯（）蜡杯（）。浸蜡时间视材料大小而定，一般总的浸蜡时间为小时左右。包埋：1. 组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱
6、取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。 2.准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。 3.迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。 4.待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。5.蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切，准备制成切片或储藏备用。切片制作：注意事项： 1.室温过高时，可将修好的蜡块放到冰箱中冷却一定时间。在夏季时可用冰块冷
7、却刀和组织块，减少刀与组织块在过程中产生的热时，使石蜡保持合适的硬度以利于切片。2.切片经30%的乙醇初展后，再用载玻片捞起蜡带放入展片仪水盒内（一般水温为45左右）。待蜡片带中的组织展平后，即可进行分片和捞片。3. 切片时要及时清洁刀口、除去蜡屑，否则易引起破碎。贴片：待切片在恒温水内充分摊开展平后，将载玻片垂直插入水中以毛面轻靠切片，并用毛笔将切片一边拨于玻片上，随即将玻片直立提起。一、HE染液的配制：（一）Harris苏木素：苏木素精 1g一氧化汞 0.5g硫酸铝钾 20g量取 无水乙醇 10ml蒸馏水 200ml 苏木素溶于无水乙醇，钾明矾溶于蒸馏水，二者混合后煮沸，离火，加入氧化汞，
8、用玻棒搅拌，试剂变为深紫色，立即移入冷水快速冷却，静置一夜，过滤，棕色小磨口试剂瓶密封保存。使用前加入5%冰乙酸4ml（或冰乙酸3滴）。（二）0.5%伊红(水溶性)：伊红 0.5g95%乙醇 25ml蒸馏水 75ml 先取少量蒸馏水加入伊红，用玻棒将伊红碾碎并搅溶，再加入全部蒸馏水，完全溶解后，再加入乙醇，最后加入冰乙酸1滴。白色小磨口试剂瓶密封保存。（三）1%盐酸酒精溶液：盐酸 1ml酒精 99ml 混匀，白色试剂瓶保存。（四）中性树胶封片剂：往125ml棕色滴瓶中倒入中性树胶若干，加入二甲苯适量用吸管调匀，有一定粘稠度即可。试剂 : 二甲苯 1瓶 Harris苏木素染液 无水乙醇2瓶1%盐
9、酸水溶液 95%乙醇 2瓶 0.5%伊红(水溶性)染液 二、染色步骤1、80度烤片1小时；2、二甲苯中脱蜡10分钟3次，用吸水纸吸干液体；3、100%乙醇5分钟2次，用吸水纸吸干液体；4、95%乙醇5分钟2次，用吸水纸吸干液体；5、流水2分钟，用吸水纸吸干水分；6、 Harris苏木素 染色 5分钟；7、 自来水稍洗；8、1%盐酸酒精溶液分化510秒（切片由蓝变红）；9、自来水洗返蓝25分钟；10、0.5%伊红(水溶性)染色2分11、95%乙醇脱水5分钟2次，用吸水纸吸干液体；12、100%乙醇5分钟2次，用吸水纸吸干液体；13、二甲苯中透明5分钟2次，用吸水纸吸干液体；镜下观察结果：细胞核深
10、蓝色，胞浆及纤维组织呈深浅不等的红色。三、注意事项1、苏木素染色时间应根据染液的新鲜或陈旧、及着色力决定。2、盐酸分化要恰当，分化不足，会核、浆共染，分化过度会造成核染色过浅。3、水洗蓝化时间应充分，以防褪色。4、封片后，玻片应及时贴上标签并写上编号。Masson三色法（根据Masson,1929）一、试剂配制（一） Weigert氏铁苏木素液（可用Herris苏木素代替）甲液：苏木素 1g无水酒精（或 95酒精） 100ml乙液：29三氯化铁水溶液 4ml蒸馏水 95ml （30%三氯化铁溶液则为100ml）盐酸 1ml临用时，取甲、乙液等量混合即可应用。混合时应将乙液加人甲液内，染液呈紫黑
11、色。铁苏木素不能象明矾苏木素一样配制后可放置贮存备用，因铁与染色剂的色素根会化合生成不溶性沉淀，所以铁作媒染液时，必须与染液分别配制和分别保存，染片时临时混合应用。由于这是一种铁苏木素，它将胞核染成黑色。能抵抗在对比染色液中所含分色剂的脱色作用，且不会被光线退色，因此比钾矾苏木素染色较为持久。（二） 丽春红酸性品红液丽春红（Ponceau 2R） 0.7g酸性品红（acid fuchsin） 0.3g蒸馏水 99ml冰醋酸(glacial acetic acid) 1ml（三） 1%磷钼酸水溶液磷钼酸（phosphomolybdic acid） 1g蒸馏水加至 100ml（四） 2%苯胺蓝液苯
12、胺蓝（aniline blue） 2g冰醋酸（glacial acetic acid ） 2ml蒸馏水加至 100ml（五） 亮绿液亮绿（light green） 1g蒸馏水 99ml冰醋酸（glacial acetic acid ） 1ml（六）Bouin氏液苦味酸饱和液（1.22）75ml 福尔马林25ml冰醋酸5ml 此液一般在临用时配制，对皮肤及肌腱有软化作用。二、操作方法1 组织固定于Bouin氏液，流水冲洗一晚，常规脱水包埋。2 切片脱蜡至水：（1）二甲苯中脱蜡10分钟3次，用吸水纸吸干液体；（2）100%乙醇5分钟2次，用吸水纸吸干液体；（3）95%乙醇5分钟2次，用吸水纸吸干液
13、体；（4）流水2分钟，用吸水纸吸干水分；3 Weiger氏铁苏木素染5-10分钟。4 流水稍洗。5 1%盐酸酒精分化。1min6 流水冲洗数分钟。25min7 丽春红酸性品红液染5-10分钟。7min8 蒸馏水稍冲洗。9 1%磷钼酸水溶液处理约5分钟。10不用水洗，直接用苯胺蓝液或绿液复染5分钟。111%冰醋酸处理1分钟。上下提动1295%乙醇脱水3分钟，两次；1395%乙醇脱水5分钟2次，用吸水纸吸干液体；14100%乙醇5分钟2次，用吸水纸吸干液体；15二甲苯中透明5分钟2次，用吸水纸吸干液体；结果：胶原纤维呈蓝色(用苯胶蓝液复染)或绿色(用亮绿复染)。胞质、肌纤维和红细胞红色。胞核蓝褐色
14、。注意事项:1、组织用Bouin氏液或Zenker氏液固定为佳。如已用10%甲酸液固定,切片可在脱蜡至水后.再放入Bouin氏液作用一晚或置37温箱内1-2小时,然后流水冲洗切片至黄色消失再进行染色。2、铁苏木素染核(见苦味酸一酸性品红法)。3、如没有丽春红染料,可把酸性品红加至1克来配制。4、用1%磷钼酸处理时可在镜下控制.见肌纤维呈红色,胶原纤维呈淡红色即可。Van Gieson氏法染色原理:上面介绍的胶原纤维染色如苦味酸-酸性品红法和三色染色法,都是利用两种或三种阴离子染料混合一起或先后作用而完成鉴别染色的。Van Gieson氏染色中,为什么胶原纤维呈红色(被酸性品红所染),肌纤维呈黄
15、色(被苦味酸所染).而Masson氏染色时胶原纤维呈蓝色(被苯胺蓝所染),肌纤维呈红色(被酸性品红和丽春红所染),这与阴离子染料分子的大小和组织的渗透性有关。组织的渗透性(Permeability),取决于组织的结构密度。如果细致地观察,会发现组织和细胞成分都是多孔的构造。不同的组织和细胞成分,它们的孔隙大小是不同的。孔隙的大小,决定了组织的渗透性。如孔隙小,组织结构致密,渗透性低；孔隙宽,组织结构疏松,渗透性高。如已固定的组织用一系列阴离子水溶性染料先后或混合染色,则可发现红细胞被最小分子的阴离子染料着染.肌纤维与胞质被中等大小的阴离子染料着染,而胶原纤维则被大分子的阴离子染料着染。由此说明
16、了红细胞对阴离子染料的渗透性最小,肌纤维与胞质次之,而胶原纤维具有最大的渗透性。根据组织不同的渗透性能,选择分子大小不同的阴离子染料进行染色,便可把不同组织成分显示出来.染料分子的大小,主要由其分子量来体现。小分子量者易于穿透结构致密、渗透性低的组织,而大分子最者则只能进入结构疏松,渗透性高的组织。一般来说,结构疏松,渗透性高的组织多选择大分子染料,而结构致密,渗透性低的组织多选择小分子染料。常用作胶原纤维 染色的几种阴离子染料的分子量由小到大分别是:苦味酸(黄色),分子量,229.11橙黄G(橙黄色),分子量452丽春红(红色),j女子量,480.42酸性品红(红色),分子量,585.53苯
17、胺蓝(蓝色),分子量737.72亮绿(绿色),分子量792.72甲基蓝(蓝色),分子量,799因此,在Van Gieson氏法中,苦味酸染红细胞和肌纤维,酸性品红染胶原纤维,而在Masson氏法中,酸性品红或丽春红染肌纤维,而苯胺蓝或亮绿染胶原纤维。染色反应是一个很复杂的过程,胶原纤维染色除上述两个方面外,不排除电子吸附和排斥作用。在实际染色中,两种阴离子染料的比例也是很重要的。在Van Gieson氏染色,苦味酸与酸性品红浓的比例若不恰当,如苦味酸的浓度太高,小分子量染料苦味酸占优势,则结构致密的胞浆,肌纤维和结构疏松的胶原纤维都会被苦味酸所着染。这点是要注意的。应用：胶原纤维和肌纤维的鉴别
18、染色是病理组织制片的一个重要方法,它的染色对病理诊断很有帮助。1.来源于间胚叶的肿瘤,如纤维瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、神经纤维瘤甚至它们的肉瘤等都产生一定的纤维,这些纤维在H-E染色中都染成红色而难以区别。通过用上述方法染色,一般可区分出该肿瘤组织是胶原纤维源性,还是肌源性,或者是神经纤维源性。对于后者,有时还需加染磷钨酸苏木素来协助诊断。2.在慢性炎症,机化和瘢痕形成中,可随病理过程的发展而出现胶原纤维。在早期,H-E染色切片中的这些纤维往往和纤维蛋白很难鉴别,通过胶原纤维染色则可证实。如慢性肾小球肾炎的肾小球纤维化后,V.G.染色呈红色。大叶性肺炎或血栓发生机化后,原有的纤维蛋白灶内出现胶原
19、纤维,V.G.染色呈红色。风湿性肉芽肿已静止时,阿啸夫氏(Aschoffs。巨细胞消失,病灶内的纤维被胶原纤维取代,V.G.染色也呈红色。胃、十二指肠溃疡愈复时,在渍疡底部出现胶原纤维构成的疤痕,慢性阑尾炎时阑尾壁出现的纤维化,肝硬化时胶原纤维的增生,这些用V.G。染色也都染成红色。3.血管壁的胶原纤维染色对病理诊断也很重要。良性高血压,小动脉的玻璃样变,V.G.染色阳性。恶性高血压病时,小动脉管壁为纤维素样坏死,V.G.染色阴性而纤维素染色阳性4V.G.染色对是高血压性血管疾患还是淀粉性样变血管损害的鉴别也很重要。H-E染色的玻璃样变和淀粉样变有时很难区别，用V.G.染色和淀粉样物质染色则可
20、作出区别。如高血压性肾固缩其小动脉壁V染色呈红色。而淀粉样物质沉积的小动脉壁V.G.染色呈黄色。备注一、Van Gieson氏染液A液:1%酸性品红水溶液B液：苦味酸饱和水溶液（约1.2%）A、 B两夜分瓶盛放。临用前取A液1份，B液9份混合后使用二、操作方法1、 组织固定于10%甲醛液，常规脱水包埋2、 切片脱蜡至水：（1）二甲苯中脱蜡10分钟3次，用吸水纸吸干液体；（2）100%乙醇5分钟2次，用吸水纸吸干液体；（3）95%乙醇5分钟2次，用吸水纸吸干液体；（4）流水2分钟，用吸水纸吸干水分；3、 用Weigert氏铁苏木素染液510分钟，流水稍洗4、 1%盐酸酒精迅速分化5、流水冲洗数分
21、钟6、用Van Gieson氏染液染12分钟7、倾去染液，直接用95%酒精分化和脱水（可放入温箱烤干后，直接透明封片）8、95%乙醇脱水5分钟2次，用吸水纸吸干液体；9、100%乙醇5分钟2次，用吸水纸吸干液体；10、二甲苯中透明5分钟2次，用吸水纸吸干液体；结果：肌纤维，胞质及红细胞黄色，胞核蓝褐色一、主要试剂（一）AAF固定液又称酒精醋酸福尔马林混合固定液无水乙醇 80 mL冰醋酸 5 mL甲醛 10 mL（二）过碘酸溶液0.5g过碘酸(H IO4 )溶于100mL蒸馏水或者70%酒精溶液中,或者按如下配方配制:过碘酸 0.8 g,95%乙醇 70 mL醋酸钠 0.27 g水 20 mL待
22、溶解后置于4冰箱避光保存。（三）无色品红液( Schiff氏液) 在三角烧内加入蒸馏水500 mL，煮沸后，在保持微沸的情况下，加入碱性品红2.5 g,并不断摇动约5 min (勿使之沸腾)，使碱性品红彻底溶解(溶解液为深红色) 。冷却到50时,过滤,加入1N盐酸50 mL，再待冷却至25时加入偏重亚硫酸钠2.5 g，塞住瓶口,摇动容器以充分混合(此时颜色明显变淡) ，然后避光放置或冰箱内24 h，溶液为淡黄或淡红色,再加入活性炭5 g，混合后振荡数分钟,静置1h，再用双层滤纸过滤,此时溶液应完全无色、清澈透明,为无色品红。封口,贮存于棕色瓶中(最好外包黑纸避光)存放入4冰箱备用。（四）1N盐
23、酸浓盐酸(比重1.19含量22% ) 8.5mL加蒸水91.5 mL 或者98.3 mL； 比重1.16盐酸，加入蒸馏水成1 000 mL。（五）偏重亚硫酸钠1N盐酸7.5 mL 加10%偏重亚硫酸钠(钾) 7.5 mL,再加130 mL蒸馏水混合而成。二、染色操作：1、新鲜组织编号取材后,投入AAF液固定。2、入无水酒精中脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋。3、常规切片：厚5m4、脱蜡至水：（1）二甲苯中脱蜡10分钟3次，用吸水纸吸干液体；（2）100%乙醇5分钟2次，用吸水纸吸干液体；（3）95%乙醇5分钟2次，用吸水纸吸干液体；（4）流水2分钟，用吸水纸吸干水分；5、入0.5%1%高碘酸氧化1
24、5min，环境温度以不高于20为宜，室温高时氧化时间适当缩短。6、流水冲洗5 min7、蒸馏水浸洗2次8、Schiff氏液( Schiff氏液从冰箱取出升至室温使用)避光染色1030 min; 9、0.5%偏重亚硫酸钠(钾)浸洗2次，每次12 min,以达到分化的目的;10、流水冲洗5 10 min11、蒸馏水洗12、Harris苏木精染2 5min13、自来水洗14、1%盐酸酒精分化15、再用自来水充分冲洗16、温水(或者1%氨水)返蓝,核染色稍浅为好17、流水冲洗18、95%乙醇脱水5分钟2次，用吸水纸吸干液体；19、100%乙醇5分钟2次，用吸水纸吸干液体；20、二甲苯中透明5分钟2次，
25、用吸水纸吸干液体；一、试剂配制：1冲洗缓冲液：PBS溶液；2阻断液：0.3% H2O2 甲醇溶液。30%双氧水2ml加入甲醇定容至200ml。（现用现配）3固定液：pH7.4 4% 多聚甲醛 PBS溶液。40g 多聚甲醛加入1000ml PBS 60搅拌溶解，可缓慢少量加入1M NaOH。4蛋白酶K工作液，蛋白酶K溶于pH7.4-8.0 10mM Tris-HCL中，制成终浓度为20mg/ml。510mM Tris-HCL 配制：100ml双蒸水中加入121mg Tris，先加入50ml双蒸水，Tris溶解后用1M的HCL调pH值，再加入双蒸水定容至100ml。6pH6.0 0.1M 柠檬酸缓
26、冲液溶液：用于微波修复。PH0.1M柠檬酸（ml）0.1M柠檬酸钠（ml）PH0.1M柠檬酸（ml）0.1M柠檬酸钠（ml）3.018.61.45.08.211.83.217.22.85.27.312.73.4164.05.46.413.63.614.95.15.65.514.53.8146.05.84.715.34.013.16.96.03.816.24.212.37.76.22.817.24.411.48.66.42.018.04.610.39.76.61.418.64.89.210.81水柠檬酸分子量为210.14，0.1M溶液21.01g/L;2水柠檬酸钠分子量为294.12，0.1M
27、溶液29.41g/L0.7985g 柠檬酸、4.7647g柠檬酸钠，溶于200ml蒸馏水中。二、操作步骤1、石蜡切片脱蜡至水：（1）二甲苯中脱蜡10分钟3次，用吸水纸吸干液体；（2）100%乙醇5分钟2次，用吸水纸吸干液体；（3）95%乙醇5分钟2次，用吸水纸吸干液体；（4）流水2分钟，用吸水纸吸干水分；2、3H2O2处理10分钟3、蒸馏水冲洗4、PBS浸泡5分钟 ，两次5、抗原修复：将切片放入盛有0.1M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在9298之间，高火5min， 低火10min（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足
28、以上步骤中对温度和时间的要求）。6、取出容器，室温冷却1020分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。7、PBS冲洗，5分钟3次。8、510%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。9、倾去血清，勿洗，用吸水纸吸干液体，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，4过夜。10、 PBS冲洗，5分钟3次。11、用吸水纸吸干液体，滴加二抗，室温孵育 20分钟。12、PBS冲洗，5分钟3次。13、用吸水纸吸干液体，DAB显色液显色（1ml蒸馏水中加入A、B、C液各一滴，混匀，配制成DAB显色液）。镜下观察表达位置出现染色立即自来水冲洗十分钟14、苏木素染色10s1min15
29、、自来水冲洗，镜下观察（染色不足重复14步，染色过度则褪色处理）16、自来水冲洗5-10分钟17、蒸馏水洗30秒18、80%、85%、90% 乙醇脱水各3分钟，用吸水纸吸干液体。19、95%乙醇脱水5分钟2次，用吸水纸吸干液体；20、100%乙醇5分钟2次，用吸水纸吸干液体；21、二甲苯中透明5分钟2次，用吸水纸吸干液体；22、中性树胶封片。Fluorescence staining TUNEL stainingParaffin-embedded sectionDewax,rehydrateXylene (35min)100% alcohol(35min) 70% 80% alcohol (5min,respectively)Water 5 minPBS (35min)Protease K (20g/ml in 10mM Tris/HCl), 37,15minsPBS (35min)Permeabilisation(0.1% sodium citrate, 0.1% Triton X-100)100ml water, add 0.1g sodium citrate, add 100l Triton X-100Incubate slides in permeabilisation solution for 2 min on ice(2-8)Labeling reaction w
