1、（3）其它载体： 、 。（二）基因工程的基本操作程序第一步： 1.目的基因是指： 2.获取方法：目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工的方法合成，目前常用的方法有以下几种。（1）、从基因文库中获取目的基因 、基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。把基因文库比喻成“图书馆”，每个基因就是一本“书”。若一座“图书馆”中包含了一种生物所有的基因，那么这个基因文库很大，类似于“国家图书馆”，把这种基因文库叫做 。也有一些基因文库比较小，类似于某地方或者单位“图书馆”，只包含了一种生物的一部分基因，我们把这种基因文库
2、叫做 ，如 文库。、基因文库的构建：将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的 ，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌多含有了一段不同的DNA片段。也就是说，这个群体包含了这种生物的 ，叫做生物的基因组文库。如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群叫做这种生物的 。两种基因文库的主要区别如下表所示。文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）无有基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非
3、编码DNA片段）基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种的基因交流可以部分基因可以、从基因文库中获取我么所需的目的基因：根据目的基因的有关信息来获取，如：根据基因的 、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的表达产物蛋白质特性来获取目的基因。（2）、利用PCR技术扩增目的基因1）PCR的含义：聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。2）目的：获取大量的目的基因3）原理：4）过程： 第一步：目的基因DNA受热（加热至9095）变性后解链为单链；第二步：冷却到5560，引物结合到互补DNA链；第
4、三步：加热至7075， 从引物起始进行互补链的合成。如此重复循环多次，由于延伸合成后得到的产物同样可以和引物结合，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n，其中n为 ）。上述过程可以在PCR扩增仪中自动完成。（5）特点：指数（2n）形式扩增（6）PCR扩增中需要的物质有：引物、目的基因的模板DNA、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧核苷酸。1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2.组成： （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是 的部位,能 ,最终获得所需的蛋白质。（2）终止子：
5、也是一段有特殊结构的DNA片段 ,位于基因的尾端，相当于一盏红色信号灯。（3）标记基因的作用：是为了 ,从而将含有 的细胞筛选出来，常用的标记基因是抗生素基因。将目的基因导入受体细胞1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内 。2.常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 ,其次还有 和花粉管通道法。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 。此方法的受体细胞多是 。将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是 、 、遗传物质相对较少等,最常用的原核细胞是 ,其转化方法是：先用 处理细胞,使细胞处于一种 的生理状态，这种细胞称为 。再将重组表达载体DNA
6、分子溶于缓冲液中与 混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。第四步：目的基因的检测和表达1、首先要检测：转基因生物的 上是否插入了 。这是目的基因能否在受体细胞中 的关键。检测方法是采用 。（即：将转基因生物的 提取出来，在含有 的DNA片段上用放射性同位素作标记，以此为作 ，使探针与 杂交，如果显示出 ，就表明 。）2、其次还要检测：目的基因是否 ,这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。方法是 ，与上述方法不同之处是从从转基因生物中提取的是 ，同样用 作探针，与 杂交，如果显示出 ，则表明目的基因转录出了mRNA。3、最后检测目的： 。是从转基因生物中提取蛋白质,
7、用相应的抗体进行 ，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。4、除了上述分子检测外，有时还需进行 ，如是否给转基因植物赋予了抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的 ，以确定是否具有抗性及抗性程度。（三）基因工程的应用1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物,利用转基因改良植物的品质。2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。3.基因治疗：把 导入病人体内,使该基因表达产物发挥作用。（四）蛋白质工程的概念蛋白质工程是指以 的结构规律及其生物功能的关系作为基础,通过 或基因合成,对 进行改造,或制造一种 ,以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生
8、产自然界已存在的蛋白质）专题1 基因工程 学案 答案1.“分子手术刀”限制性内切核酸酶（限制酶）主要是从原核生物中分离纯化出来的。能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,因此具有特异性性。黏性末端和平末端。2.“分子缝合针”DNA连接酶（1）两种DNA连接酶（EcoliDNA连接酶 和 T4DNA连接酶）的比较：都缝合双链DNA片段，恢复磷酸二酯键EcoliDNA连接酶来源于大肠杆菌,只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，T4DNA连接酶能缝合平末端,但连接平末端的之间的效率较
9、低。3.“分子运输车”基因进入受体细胞的载体（运载体）具有自我复制能力；一个或多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因。（2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外,并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。噬菌体的衍生物、动植物病毒。目的基因的获取 编码蛋白质的基因若一座“图书馆”中包含了一种生物所有的基因，那么这个基因文库很大，类似于“国家图书馆”，把这种基因文库叫做基因组文库。也有一些基因文库比较小，类似于某地方或者单位“图书馆”，只包含了一种生物的一部分基因，我们把这种基因文库叫做部分基因文库，如cDNA文库。将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，
10、将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌多含有了一段不同的DNA片段。也就是说，这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做生物的基因组文库。如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群叫做这种生物的cDNA。、从基因文库中获取所需的目的基因：根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的表达产物蛋白质特性来获取目的基因。DNA双链复制加热至7075，Taq酶从引物起始进行互补链的合成。如此重复
11、循环多次，由于延伸合成后得到的产物同样可以和引物结合，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。基因表达载体的构建目的基因启动子终止子标记基因是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的蛋白质。是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来，常用的标记基因是抗生素基因。是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。采用最多的方法是农杆菌转化法,其次还有基因qiang法和花粉管通道法。最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞
12、多是受精卵。原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等,最常用的原核细胞是大肠杆菌,其转化方法是：先用Ca2+处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。转基因生物的DNA上是否插入了目的基因。这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键。检测方法是采用DNA分子杂交技术。将转基因生物的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素作标记，以此为作探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，就表
13、明目的基因已插入染色体DNA中。目的基因是否目的基因是否转录出了mRNA,这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。方法是分子杂交技术，与上述方法不同之处是从从转基因生物中提取的是mRNA，同样用标记的目的基因作探针，与mRNA杂交，如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA。目的基因是否翻译成蛋白质。是从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原抗体，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。4、除了上述分子检测外，有时还需进行个体生物学水平的鉴定，如是否给转基因植物赋予了抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性及抗性程度。把正常基因导入病人体内,使该基因表
14、达产物发挥作用。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。专题2 细胞工程 学案（一）植物细胞工程1.理论基础（原理）：全能性表达的难易程度： ； 动物细胞2.植物组织培养技术 （1）过程： 的植物器官、组织或细胞 （2）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。3.植物体细胞杂交技术（1）概念：就是将不同种植物体细胞，在一定条件下融合成 ，并把杂种细胞培育成新的 的技术。由于两物种之间存在天然的 ，利用植物体细胞杂交的方法可以克服不同生物远缘杂交不
15、亲和的障碍，从而获得如白菜甘蓝等种间或属间杂种。（2）原生质融合过程：先用 和 去除 ，从而获得具有活力的 ，再利用一定的技术手段进行人工诱导融合。（3）诱导融合的方法：物理法包括 、 、 等；化学法一般是用 （PEG）作为诱导剂。（4）意义：（5）应用： 、 、 、 （选修三P3841） （二）动物细胞工程1. 动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成 ,然后，放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖。（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（ 或 的器官或组织）剪碎用 处理分散成单个细胞制成 转入培养瓶中进行 贴满瓶壁的细胞重新用 处理分散成单个细胞，制成细胞悬液转入培养液种传
16、代培养放入 中培养。（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上,称为 ；细胞数目不断增多,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖,这种现象称为细胞的 。人们通常将动物组织消化后的初次培养称为 。（4）传代培养：贴满瓶壁的细胞需要重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖。这样的培养过程通常被称为 。传代培养一般传至10代后就不易传下去了。一般细胞传至 代左右时增殖缓慢，以至于完全停止，这时部分细胞的 可能会发生变化。当继续传代培养时少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得 ，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于 的方向发展。目前使用的
17、或冷冻保存的正常细胞通常为 代以内，以保持细胞正常的 。（5）动物细胞培养需要满足以下条件无菌、无毒的环境：培养液应进行 处理。通常还要在培养液中添加一定量的 ,以防培养过程中的污染。此外,应 ,防止代谢产物积累对细胞自身造成危害；营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入 、血浆等天然成分；温度和pH：哺乳动物多是36.5或-0.5；适宜pH为7.27.4；气体环境： 的混合气体，O2是细胞代谢所必需的,CO2的主要作用是维持培养液的 。（6）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。2.动物体细胞核移植技术
18、和克隆动物高度分化的植物组织仍保持着全能性，但动物细胞与植物细胞不同，动物细胞的全能性会随着动物 的提高而逐渐受到限制，分化潜能逐渐变弱。因此目前还不能用类似植物组织培养的方法获得完整的动物个体，用动物体细胞克隆的动物，实际上通过 来实现的。（1）核移植概念：是将动物的一个细胞的 ，移入一个已经去掉细胞核的 细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个胚胎最终发育为动物个体。通过核移植方法的得到的动物称为 动物，过程为 繁殖，说明动物细胞核具有 。（2）哺乳动物核移植可以分为 （比较容易）和 （比较难）（3）选用去核卵母细胞的原因：卵母细胞 比较大,容易操作；卵母细胞 多,营养丰富；卵母细胞质内
19、存在激发 表达的物质。（4）体细胞核移植的大致过程详见选修三P48 （5）体细胞核移植技术的应用：加速家畜遗传改良进程,促进良畜群繁育；保护濒危物种,增大存活数量；生产珍贵的医用蛋白；作为异种移植的供体；用于 等。（6）体细胞核移植技术存在的问题：成功率仍然非常低；克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等；对克隆动物食品的安全性问题也存在争议。3.动物细胞融合（1）动物细胞融合概念：也称细胞杂交,是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞 的单核细胞,称为 。（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同,诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合
20、的方法类似,常用的诱导因素有聚乙二醇、 、电激等。（3）动物细胞融合的意义：细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使 成为可能（克服了远缘杂交的不亲和性），成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。4.单克隆抗体（1）单克隆抗体的制备过程详见选修三P53，大致过程如下：用羊的红细胞对小鼠进行注射，使小鼠产生 ，从产生免疫反应小鼠脾脏细胞中得到了相应的 ，证明小鼠脾脏中形成了相应的 ；将小鼠的 与脾细胞中的产生的B淋巴细胞融合，用特定的 进行筛选出融合的杂种细胞，即 ；对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选就可以获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞；将杂交瘤细胞在体外条件
21、下做大规模培养或注射到小鼠 内增殖，再从 或小鼠 中就能提取出大量的 了。（2）杂交瘤细胞的特点：既能迅速 ,又能产生 。（3）单克隆抗体的优点： , , 。（4）单克隆抗体的应用： 作为诊断试剂：准确识别各种 物质的细微差异,并跟一定抗原发生特异性结合,具有准确、高效、简易、快速的优点。 用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗 治疗,可制成“生物导弹”,也有少量用于治疗其它疾病。细胞全能性受精卵生殖细胞干细胞体细胞；植物细胞动物细胞2.植物组织培养技术离体的植物器官、组织或细胞 愈伤组织 试管苗 植物体是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序.就是将不同种植物体细胞，在一定
22、条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。由于两物种之间存在天然的生殖隔离，利用植物体细胞杂交的方法可以克服不同生物远缘杂交不亲和的障碍，从而获得如白菜甘蓝等种间或属间杂种。先用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，从而获得具有活力的原生质体，再利用一定的技术手段进行人工诱导融合。物理法包括离心、振动、电激等；化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。克服了远缘杂交不亲和的障碍。微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种（详见选修三P3841）（二）动物细胞工程就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后，放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖。取动物组织块（动物胚胎或
23、幼龄动物的器官或组织）剪碎用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞制成细胞悬液转入培养瓶中进行原代培养贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞，制成细胞悬液转入培养液种传代培养放入二氧化碳培养箱中培养悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上,称为细胞贴壁；细胞数目不断增多,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖,这种现象称为细胞的接触抑制。人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。这样的培养过程通常被称为传代培养。一般细胞传至10-50代左右时增殖缓慢，以至于完全停止，这时部分细胞的细胞核型可能会发生变化。当继续传代培养时少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，
24、获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展。目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型。培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素,以防培养过程中的污染。此外,应定期更换培养液,防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。通常需加入血清、血浆等天然成分.适宜pH为7.27.4.95%空气5%CO2的混合气体，O2是细胞代谢所必需的,CO2的主要作用是维持培养液的pH 。制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞.高度分化的植物组织仍保持着全能性，但动物细胞与植物细胞不同，动物细胞的全能性会随着动物细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能逐渐变弱。因此目前还不能用类似植物组织培养的方法获得完整的动物个
