1、兽用化学药品生物等效性研究规范兽用化学药品生物等效性试验指导原则一、概述（一）定义与目的生物等效性指药学等效的制剂或临床可替代的药品，在相同条件下以相同剂量给药，活性成分的吸收程度和速度的差异无统计学意义。生物等效性技术是一种基于生物学和统计学的质量控制方法，用以评价含相同活性成分不同制剂、相同给药途径，同一制剂不同生产厂生产的产品，相同制剂不同途径给药，能否产生相似的血药浓度或全身性药效（疗效或毒副作用），能否直接引用相同的休药期标准等。两产品只有当他们的生物利用度相等（即活性成分吸收和进入作用部位的速度与程度相等）时，才被认为是生物等效的。如果受试品活性成分以等同于参比品活性成分的速度和程
2、度进入体循环，那么受试品和参比品活性成分的局部利用度（组织浓度）相似。作用部位利用度相似是药品治疗等效的基础。药物吸收的速度和程度受诸多因素影响，如制剂工艺、药物粒径、晶型或多晶型、赋形剂、填充剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、包衣材料、溶剂、助悬剂等。生物等效性研究的临床意义在于确定药品的可处方性和药品之间的可互换性。可处方性是指医生首次开写该新用药品的处方时，对其一般性能和特征如有效性、安全性（含生物等效性）的明了程度。可互换性是指治疗过程中换用药品时，医生能肯定新用药品的安全性和有效性是能与被替换药品相比拟的。兽药生物等效性试验应在规范的实验室或期临床实验室进行。实验室应具备必需的仪器设备、动
3、物试验设施、相关技术人员。试验记录要规范、完整，能够随时接受检查或调档。研究过程应标准化，除制剂本身因素外，其他各种因素对药物体内过程的影响应减到最低程度。使用药效研究法时，要严格遵守临床试验的有关规定，并做方法学确证。生物等效性研究只是验证制剂质量的手段之一，仿制药品是上市前的最后研究阶段。要提高仿制药品的质量，尚需认真研究原创药品的文献资料，从处方筛选、生产工艺条件改进和质量研究入手，避免最后出现不等效。生物等效性不能合理地反映药物的组织残留消除规律。在生物等效性评价的浓度范围内，参比品和受试品按先导品的休药期使用，可能产生相同的血药-时间曲线，但也可能出现不同的组织处置动力学。为表明受试
4、品在休药期时刻的残留量与先导品的残留量是一致的，受试品一般须做组织残留消除研究。比较受试品和先导品的休药期，取较长者作为受试品的休药期标准。用药效研究法和临床疗效法在食品动物证明生物等效性，要同时进行组织残留消除研究。在一种靶动物做的生物等效性或组织残留消除研究，一般不得外推到另一种动物，因为药物在分布或组织结合上的种属差异能将其吸收速度或程度上的微小差异放大成靶组织中残留标示物浓度上的巨大差异。（二）适用范围生物等效性研究适用于仿制药品，活性成分相同但剂型、给药途径、制造过程发生改变的药品，含新物质或已知物质的非仿制药品。下列产品可不做生物等效性试验：静脉、皮下或肌内注射给药的溶液剂；口服溶
5、液或其他溶解的剂型；用于局部起局部治疗作用的溶液，以及用于非食品动物起局部治疗作用的其他剂型；活性成分、非活性成分以及他们的理化特点相同（浓度、溶解曲线、晶型、剂型、粒度和加工过程相同）并且参比品的生物利用度已在靶动物得到合理证实的药品；口服不吸收的产品（如抗酸剂，透视介质）；活性成分或治疗成分在相同浓度下与老产品相同，并且不含能显著影响活性成分或治疗成分吸收的非活性成分的口服溶液、糖浆或类似溶液剂；原生产厂重新组方的与老产品相同的产品，只是色素、香味剂或防腐剂不同，但这些物质并不影响药品的生物利用度；挥发性吸入麻醉溶液。一般而言，不必做生物等效性研究的仿制药品，在相同的剂型和浓度下应含有与先
6、导品相同的活性成分、无活性成分、pH和理化性质。非食品动物局部用仿制品，允许在无活性成分上与先导品有某些差别。二、试验设计（一）血药浓度法此法特别适用于药物活性成分吸收进入体循环的剂型（注射剂和大多数口服剂型）。研究一般应包含药物浓度-时间曲线的吸收、分布和消除相。1.分析方法合适、可靠的分析方法是血药浓度研究法的关键。全血、血浆、血清等样品的取样量少，药物浓度低，内源性物质(如无机盐、脂质、蛋白质、代谢物以及其他药物)干扰多，个体差异大，影响样品中活性成分含量的测定。因此，必须根据被测物的结构、性质、浓度范围和样品介质等具体情况，建立相应的分析方法。为保证方法的可靠性，还必须对方法的性能进行
7、全面验证。（1）分析方法选择 生物等效性研究应尽可能选择特异、灵敏、可靠的分析方法。大多数药物应首选色谱法，如高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）。这些方法将分离和定量同步进行，特异性好，检测器的灵敏度也能满足要求。抗生素可用微生物学法。蛋白质或多肽类物质可用免疫法，如酶免疫分析法、荧光免疫分析法、放射免疫分析法。（2）标准曲线 标准曲线(standard curve)反映被测物浓度与仪器响应值之间的定量关系，一般用回归分析（如加权最小二乘法）所得的回归方程和相关系数表示。标准曲线由低浓度到高浓度的范围为定量范围
8、，定量范围内浓度的准确度和精密度应符合“（5）准确度”和“（6）精密度”的要求。配制标准溶液应使用与待测样品相同的生物介质。不同的生物样品应制备各自的标准曲线。标准曲线的浓度个数取决于被测物可能的浓度范围和被测物/响应值关系的性质。一般至少用5个浓度，非线性的要增加浓度。标准曲线的定量范围应能覆盖全部待测样品的浓度范围。建立标准曲线时，应随行空白样品，但计算时不包括该点，仅用于评价干扰。标准曲线各浓度的实测值与标示值之间的偏差在可接受的范围内时，可判定标准曲线合格。可接受范围一般规定为最低浓度的偏差在20%以内，其余浓度的偏差在15%以内。只有合格的标准曲线才能用于定量计算。标准曲线不包括零点
9、，不得用定量范围外推法求算样品中被测物浓度。线性范围较宽时，为使低浓度得到准确计算，建议采用加权法计算偏差：偏差=（实测值标示值）/标示值100%。微生物学和免疫学分析方法的标准曲线，本质上是非线性的，应采用比化学分析法更多的浓度点建立标准曲线。（3）检测限和定量限 建立分析方法时，应测定背景信号（噪音）的标准偏差，确定方法的检测限（limit of detection, LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）。LOD为平均噪音加3倍标准差，LOQ为平均噪音加10倍标准差。LOQ一般是标准曲线的最低浓度，应能满足被测物在35个消除半衰期时刻或峰浓度（CMAX）的
10、时刻浓度的测定。LOQ的准确度和精密度应符合“（5）准确度”和“（6）精密度”的相关要求，要由至少5个标样浓度的测试结果予以证明。（4）特异性 特异性是指在干扰物存在情况下，分析方法专一、准确测定被测物的能力。建立分析方法前，应明确被测物是药物的原形还是其活性代谢物，是一个还是多个成分。内源性物质、其他代谢物或降解产物、环境因素等不得干扰测定。为证明分析方法的特异性，色谱法应提供6个不同来源的空白样品的色谱图、空白样品添加对照物的色谱图（应注明浓度）和用药样品的色谱图，质谱法则应考察介质效应。要使用每种独立的空白基质做标准曲线，并将其与在化学规定条件下所做的标准曲线进行比较，以考察在化学规定标
11、准曲线的分析误差限内的平行性和可叠加性。（5）准确度 准确度反映在确定的分析条件下，样品中被测物的测得浓度与真实浓度的接近程度(即质控样品的实测浓度与真实浓度的偏差)。重复测定已知浓度被测物的样品可获得准确度。在实际工作中，准确度通常用回收率表示。样品中被测物的响应值除以标准品的响应值，即为被测物的提取回收率。一般在空白样品中添加3个已知浓度测定回收率。一个浓度为LOQ加2倍标准差，一个为标准曲线的中间浓度，另一个为标准曲线的定量上限减2倍标准差。每个浓度平行测6次，回收率一般应在85115范围内。LOQ附近浓度的回收率可在80120范围内。（6）精密度 精密度反映在确定的分析条件下，相同介质
12、中相同浓度一系列测量值的分散程度。通常用质控样品的批内和批间相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）或变异系数（coefficient of variation, CV）表示。精密度的测定方法与回收率相同。6次重复测定的CV：浓度高于0.1g/mL时，为10；低于0.1g/mL的，为20。为获得批间精密度，应至少在不同天连续制备并测定3个分析批的样品。批间CV一般应小于15，LOQ附近浓度的CV可小于20。微生物学和免疫学分析方法的准确性和精密性，应采用6个分析批、每批4个浓度（LOQ、低、中、高浓度）的质控双份样品予以测定。（7）被测物的稳定性 在样品
13、分析周期内的不同时间，应对3个添加浓度样品、2个添加浓度各3次冻融样品、用药动物样品、储备液和样品提取液等介质中被测物在不同温度和贮存时间下的稳定性进行考察。（8）分析系统的稳定性 为确保分析系统在整个分析过程中是稳定的，要测定标准曲线的重现性，应至少在每次分析开始和结束时用标准品进样测定。（9）质量控制 分析方法只有经过严格考核后才能用于待测样品的检测。考核一般由独立的分析人员配制不同浓度的质控样品进行。质控样品是将已知量被测物添加到空白样品中配制而成。来自同一个体的生物样品最好在同一批内测定。每批样品测定时，应建立新的标准曲线，并同时测定高、中、低三个浓度的质控样品。每个浓度至少为双份，应
14、均匀分布在待测样品的分析顺序中。当一个分析批中待测样品的数量较多时，应增加各浓度质控样品的数量，使质控样品数大于待测样品总数的5%。质控样品测定结果的偏差一般应小于15%，低浓度的偏差可在20%以内。最多允许1/3质控样品（不同浓度）的偏差超限。如果质控样品的测定结果不符合上述要求，则该分析批的测定结果作废。每个待测样品一般只做单次测定，必要时（如重现性和/或准确性差时）可重复测定。复测的标准应在试验之前确定，并记载于方法的标准操作规程之中。浓度高于定量上限的样品，应使用空白样品的提取液稀释后重新测定。对于浓度低于定量下限的样品，在CMAX前采样的，以零值计；在CMAX后采样的，以无法定量（n
15、ot detectable, ND）处理，以减小零值对AUC计算的影响。整个分析过程应遵从预先制订的SOP和GLP原则。2.普通制剂单次给药（1）试验设计 多数药物的吸收和消除存在着明显的个体差异，个体间差异远大于个体内变异。因此，生物等效性研究一般要求按自身交叉对照的方法设计。交叉设计要求把受试动物随机分成几组，按一定顺序处理。例如，两种制剂（或产品）的比较，采用双处理双周期交叉设计，即将动物分成两组，一组动物先给受试品后给参比品，另一组动物先给参比品后给受试品。受试动物接受不同处理的顺序应是随机的。两顺序间应有足够长的间隔时间，称为清洗期。设定清洗期是为避免前一周期的处理对后一周期产生影响
16、。每个受试动物都连续接受两次处理，相当于自身对照，使制剂因素对药物吸收的影响与其他因素区分开来，也减少了不同试验周期和个体差异的影响。符合一室或二室开模型的药物，清洗期一般不应短于活性成分或代谢物的10个消除半衰期，以便99.9的药物已排出体外。对于动力学模型比较复杂（如组织结合时间长导致休药期也长）或具有生理学后效应潜能（如微粒体酶诱导作用）的药物，尚需延长清洗期。药物或代谢物的半衰期很长、难以按双处理双周期交叉设计实施的，应采用平行组设计。某些高变异性药物，应采用重复设计，要对同一受试动物两次接受同一制剂时可能存在的个体内差异进行测定。除22交叉外，根据受试品的个数还可分别采用33交叉、4
17、4交叉等设计。例如，三个制剂（二个受试品、一个参比品）试验时，宜采用三制剂三周期的二重33拉丁方设计。下列情形可采用单周期平行设计：药物引起的生理学改变（如肝微粒体酶的诱导作用）在药物从体内完全消除后还存在，并改变第二期所给产品的生物利用度；药物的尾段半衰期很长，在第二期给药时可能还残留着第一期的药物；双周期交叉研究的清洗期过长以致受试动物发生明显的生理发育方面的变化；药物的吸收推迟或延长,如“翻跟头”动力学。其他设计，如四处理双周期设计（受试品/受试品、参比品/参比品、受试品/参比品和参比品/受试品）或多周期设计在某些场合下也是合适的。应根据预试或文献，选择试验设计的种类。（2）药品 参比品
18、和受试品含量的差别不能超过5%。应按产品标示的而不是化验的浓度或含量给药，给药量不得按化验的结果做校正。生物等效性数据及其衍生参数也不应按参比品和受试品含量的差别做校正。受试品和参比品在试验结束后应保留足够长时间，以备受试品注册时查考。受试品 应为中试产品。应报告药名、剂型、规格、生产厂、批号、体外溶出度、稳定性、含量或效价、检验报告等数据。个别药品尚需提供多晶型及光学异构体资料。对于多种含量（或浓度）规格的口服固体制剂，要考虑不同规格产品的活性/非活性成分的比例和体外溶解曲线、药物的水溶性以及含量范围。如果多规格产品的活性/非活性成分的比例相同并且配方一样，用高含量规格产品试验即可。但还要用
19、批准的方法进行体外溶解试验，将受试品的每种规格与参比品的相应规格进行比较。参比品 一般应为先导品。如果先导品不再市售但有合格的仿制品，则应使用最早的仿制品。如最早的仿制品已不再上市，则应选择市售合格的相同的主导产品。“相同”是指该参比品所含的活性成分在化学上与受试品是相同的物质，生产工艺、剂型和剂量与受试品基本一致，标签也相同。注意：相同活性成分的不同酯应视为不同的产品。如果一种药品已有多种产品上市而每种产品的标签有所不同（如靶动物和/或使用要求不同），应选择具有相同适应症的产品。如果几个产品的活性成分相同但浓度规格不同，宜选择浓度规格相同的产品。无相同合格剂型可用的，才选用其他剂型的产品作参
20、比品。已知的一种剂型的产品可作为他种新剂型产品生物等效性试验的参比品。（3）动物 要求用先导品标签规定的靶动物。入试动物的个体间差异应减到最小。若动物的性别与药品之间无相互作用，一般选用一个均质群体内同一性别的健康成年动物，使在品种、品系、年龄、激素水平、营养状态、生产性能等方面保持一致。动物的体重要限制在一定范围，以便每个个体的总剂量基本相同。如果难以保证动物的均质性（如马），也可用非均质群体的动物，但要采用限制性随机法使每组动物在年龄、体重、性别（如相关的话）等方面一致。试验方案中应明确动物入选和剔除的条件。入试动物应经过全面的体检，证明为临床健康。根据药物的属类和安全性等，还应在试验前、
21、试验期间和试验后进行特殊的生理生化项目检查。为避免其他药物干扰，试验前至少两周内和试验期间都应禁用任何其它药物。如果药物存在遗传多态性，会导致代谢差异，则应注意慢代谢引起的毒性问题。入试动物的数量（或样本大小，N）应符合统计学要求。N由三个基本因素决定：（1）显著性水平，即值的大小，通常取5%；（2）把握度，即1-值的大小（是犯第类错误的概率，也就是把实际等效误判为不等效的概率），一般定为80%；（3）变异性（CV%）和误差（），变异性和误差越大，N越大。应避免动物数过少得出假阴性（即实为两制剂等效却误判为不等效）错误的情况。N过大可能带入其他差异。最理想的设计是采用最少的动物达到有80%把握
22、度证明两种制剂是否等效。由于试前并不知道和CV%，只能根据预试或参比品已有的参数估算N，或在生物等效性试验完成后由本试验的、CV%和把握度计算N，以检验入试动物数是否合适。入试动物应采用随机法分组，组间应具可比性。两组动物数相等时可比性最好，因此入试动物数一般为偶数。按照目前的统计方法,1824例可满足大多数药物的要求。某些变异性大的药物，要适当增加动物数。受试期间，入试动物的喂饮和活动要严格一致。入试动物在受试期间发生的任何不良反应，均应及时处理和记录，必要时中止试验。（4）给药方案 单次给药的途径应是临床或毒理学试验证明为合适的途径或参比品在有效和安全条件下使用的途径。给药剂量取决于标签的
23、规定、分析方法的灵敏度和参比品的实际应用条件。一般，没有证明线性动力学的药品应采用参比品批准的剂量。若参比品批准的剂量是几个，则应选用批准的最高剂量。安全指数大的药物，也可选用比批准剂量高23倍的剂量。受试品和参比品的剂量应相同(按标示量)。在食品动物做高于批准剂量的生物等效性研究，同时应使用先导品的最高批准剂量做组织残留消除和休药期研究。饲喂可能影响药物在胃肠道的吸收，也可能加大动物个体之间和个体自身在药物吸收速度和程度上的变异，取决于药物和制剂的特点。对要求与饲料一起给药的药品，动物应先行喂过。对饲喂可能影响吸收的药品，受试动物应禁食。对于某些药物如肠衣或口服缓释产品，由文献或预试得知饲喂
24、条件下药物的生物利用度有较大变化时，必须同时在饲喂和禁食条件下证明生物等效性。动物是否禁食，按参比品标签的规定。动物禁食时，试前应隔夜停喂10小时以上，于次日早晨空腹服用受试品或参比品，用足量饮水或溶剂送服。服药2小时后方可再饮水，4小时后统一喂料。受试动物给药后应避免剧烈运动，亦不得长时间静卧，避免造成对给药局部血流量的影响。（5）取样 取样点数取决于血药浓度曲线的特点以及与生物利用度相关数据的变异幅度（包括药动学变异性、分析误差和吸收动力学在产品之间的差别），要依据预试或国内外文献进行设计。一般应兼顾吸收相、分布相和消除相，在各时相及达峰时间前后应有足够的采样点。给药前应先取空白样。取样应
25、持续到活性成分的35个半衰期之后或CMAX的之后，以满足大于80%的要求（式中：为从给药到最后采样时间点血药浓度算得的药-时曲线下面积，为从0时到无穷时间的药-时曲线下面积）。对于血药无分析方法或方法灵敏度达不到要求而活性成分主要经肾脏排泄的药物，可采尿样，用尿中药物的累积排泄量反映其摄入量。尿样应分段收集，采集频度、间隔时间应满足估算活性成分经尿排泄的程度。该法不能反映药物的吸收速度。对于在乳腺(或肠道)起局部作用的药物，应采乳汁(或肠液)样品。采集的样品应立即冷藏或冷冻备测。（6）样品分析 分析对象一般为原形药物。对于潜药(prodrug，或称前药)或主要以代谢物起作用的药物，应以活性代谢
26、物为分析对象。要求测定被测物的总浓度，包括游离浓度和结合浓度。如果结合浓度对治疗浓度有影响，如由文献或预试得知药物在治疗浓度范围内存在着非线性蛋白结合，则应分别测定受试品和参比品的总浓度和游离浓度。相似地，若知药物能进入红细胞，研究方案应考虑在规定的剂量范围内红细胞非线性摄入的可能性。（7）生物等效性参数及评价标准 生物等效性评价参数，吸收程度用AUC，吸收速度常用CMAX和tMAX。AUC的90可信区间一般要求在80120（AUC未做对数转换）或80125（AUC做过对数转换）范围内。安全范围较大的药物可超出此限，量效反应曲线陡峭的药物应缩小范围。CMAX在很大程度上依赖于采样点的安排，差异
27、较大，可信范围为70130（未做对数转换）或70143（做过对数转换）。TMAX是时间依赖性参数，它的应用有限。只有当药物的释放速度与临床疗效（或安全性）密切相关时，Tmax才需做统计，用于评价。由于Tmax为10min的20变异与其为120min的20变异的意义不同，所以该参数的等效性范围应根据临床要求事先做认真的定义和证明。CMAX和tMAX只有当峰浓度能准确获得时才有意义。（8）数据处理与统计分析 过失或操作错误造成的数字应剔除。对不明原因造成的异常数字，应在统计学检验（如Dixon检验）后做取舍。AUC是AUC0t与AUCt之和。AUCt是最后一次采样到无穷时间药-时曲线下面积,按下式
28、计算：式中t为最后一次采样的时间，Ct为最后一次样品测得的浓度，为消除速率常数，系对数血药浓度-时间曲线末端直线部分的斜率。AUC0t采用线性曲边梯形法计算。如采用其他方法，应附参考文献。如果采样时间落在消除相，则可考虑用对数曲边梯形法或其他方法。AUC要尽量避免外推，如AUC0t在AUC中低于80，则AUC不可靠，此时应采用多次给药研究法，用稳态下的AUC0-代替时间从零到无穷的AUC。AUC、CMAX和tMAX一般用实测值而不用理论值。AUC和CMAX应经对数转换后用多因素方差分析法（ANOVA）进行显著性检验，然后再用双单侧t检验法和90可信区间法判断药品的生物等效性。方差分析可提示误差
29、来源，为双单侧t检验提供误差值（MSE）。为能做出生物等效性的结论，由ANOVA表中发现的估计误差算得的置信区间的上限和下限应与事先确定的范围如0.81.25或0.71.43（对数转换后范围）或0.81.2或0.71.3（未做对数转换的范围）进行比较。时间依赖性参数不必进行对数转换，最好使用非参数法进行分析。当等效性参数不是正态分布或对数-常态分布时，应采用非参数法做等效性分析，如Mann-Whiteney-Wilcoxon方法。药品、周期、试验顺序的影响要做方差分析，性别及其与产品的相互作用在必要时也要做方差分析。如果试验顺序有影响，则交叉设计的第一期应视为平行设计而做相应的统计分析。用几个
30、参数证明生物等效性时，只有当非等效的无效假设在所有参数被拒绝后才能最后得出生物等效的结论。鉴于房室法估算的药动学参数受具体方法或软件的影响较大，建议采用非房室分析法。研究者可根据具体情况选择符合统计学要求的相应软件，并在报告中加以说明。3.普通制剂多次给药(1)适用范围 在药物的作用取决于血中被测物的稳态浓度，活性成分是非线性和/或时间依赖性动力学，生物利用度个体差异大，吸收程度相差不大但吸收速度相差大，单次给药后被测物浓度过低、分析方法不能准确测得，治疗指数小，吸收延长或推迟，吸收速度小于消除速度，控、缓释制剂，分析方法的灵敏度不够、不能定量测得峰浓度后3个消除半衰期以后的浓度等情况下，可做
31、多次给药的生物等效性研究。对于标签规定的在较大的剂量范围内具有不同药理作用（如治疗和改善生产性能）的药品，用批准的最高剂量进行单次给药生物等效性研究通常是合适的。但若药物遵循非线性动力学，则应使用不同的剂量做多次给药的生物等效性研究。(2)研究要求 多次给药生物等效性研究的参比品、试验设计、实验条件、数据处理、等效性评价标准、研究报告要求等与单次给药生物等效性研究相同，但也存在一些特殊要求。清洗期必须包含活性成分被完全清除之后的药理作用消失期。线性动力学的药品，应选择合适的给药方案（剂量、给药间隔、给药次数）以获得稳态浓度。要测定连续的3个峰浓度（CMAX）或谷浓度（CMIN），或者通过在一个
32、给药间隔内收集大约10份样品（包括刚好在下次给药之前采集的样品）以证明达稳态。达稳态后，应由末次给药的药-时曲线计算AUC和感兴趣的药动学参数。对于受昼夜节律影响的药物，应连续24小时取样。以恒定间隔多次给药达稳态后，一个剂量间隔内的药时曲线下面积（AUC0-）是药物吸收程度的特征，是评价多次给药生物等效性的主要参数。平均稳态浓度（CSS）是另一评价吸收程度的重要指标，用下式计算：式中系稳态条件下用药间隔期0内的AUC，是给药间隔时间。药物浓度在CMAX和CMIN之间的波动范围（DF），也可用于评价多次给药的生物等效性，但要结合临床做具体分析。DF计算如下： 4.口服缓、控释制剂缓、控释制剂改变了药物释放和吸收的过程，这些制剂的生物等效性试验与普通制剂有所不同。一般要求同时进行单次给药和多次给药研究，必要时还应考虑饲喂的影响。(1)单次给药 旨在比较受试动物在空腹状态下服用受试品与参比品的吸收速度和程度，确认受试品缓、控释的
