1、基于硫酸介质中曲克芦丁与高锰酸钾反应产生强的化学发光，且甲醛的存在能使这一反应的化学发光强度大大增强。结合流动注射技术，建立了流动注射化学发光法测定曲克芦丁的新方法。在优化的实验条件下，曲克芦丁的物质量浓度在3.010-5-1.810-4mol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为8.010-7mol/L。对1.010-4mol/L的曲克芦丁平行测定11次，其相对标准偏差为1.6%，回收率为95-110%.关键字：曲克芦丁；化学发光；流动注射分析Flow-injection chemiluminescence detection of Troxerutin contentAbstract:Tro
2、xerutin has strong chemiluminescence reaction with potassium permanganate in sulfuric acid medium,and the existence of formaldehyde can make the intensity of chemiluminescence reaction enhanced greatly. Combination of flow-injection analysis,establish a new method of flow-injection chemiluminescence
3、 detection of troxerutin content. A detection limit of 8.010-7mol/L troxerutin with a linear range of 3.010-4mol/L for its theoretical troxerutin was obtained under the optimized experimental conditions. The relative standard deviation was 1.6% for 1.010-4mol/L troxerutin （n = 11）,the recovery rates
4、 were 95-110%.Keywords: troxerutin; Chemiluminescence；Flow- Injection 1前言1.1 检测曲克芦丁的意义曲克芦丁（troxerutin）是羟基芦丁中最重要的有效成分，具有抑制红细胞和血小板凝聚作用，防止血栓形成，同时能增加血中氧的含量，改善微循环，促进新血管生成以增进侧支循环。它对内皮细胞有保护作用，能对抗5-羟色胺和缓激肽引起的血管损伤，增加毛细血管的抵抗力，降低毛细血管的通透性，有防止因血管通透性升高而引起的水肿的作用，并有抗放射性损伤、抗炎症、抗过敏、抗溃疡等作用1。自1960年开始，欧洲已将羟基芦丁（oxerutin）
5、用于治疗静脉曲张，此时这类药在北美却尚未应用。oxerutiu不是单一物质，是天然存在的称为芦丁的生物黄酮类衍生的一组化学成分。目前国内产品是芦丁经羟乙基化得到的以曲克芦丁为主的羟乙基芦丁的混合物，为黄色，黄绿色或浅棕黄色粉末，无臭味微咸，有引湿性，曲克芦丁含量不低于80%（国家药品标准一2002）。是维脑路通的主要有效成分，化学名称为3，4，7-三0-（2-羟乙基）-5 羟基黄酮-3-芸香苷2。曲克芦丁结构式如图1所示。 图1 曲克芦丁的化学结构Fig.1 The chemical structure of Troxerutin1.2 目前检测曲克芦丁的方法目前测定曲克芦丁的方法主要有紫外分
6、光光度法3-4、红外光谱法5、毛细管电泳法6、薄层色谱法7、电化学伏安法8和高效液相色谱法9-10等，随着药物分析的发展，要求分析方法灵敏、快速、准确、自动化。原有的一些灵敏度低、操作烦琐的化学分析法将被逐步淘汰，有些大型仪器由于过于昂贵而难以推广，而化学发光技术具有灵敏度高（检测限可达10-12mol/L）、线性范围宽（3-6个数量级）、不需光源，可避免瑞利和拉曼散射等干扰，结合流动注射分析技术后可大大提高信噪比，加快分析速度，并且具有仪器设备简单，易于实现自动化等特点，是当前分析化学研究的热点。1.3 化学发光光谱法的原理1.3.1 概述最早发现的化学发光现象发生在生物体内，现在称为生物发
7、光。1877年Radziszewski在研究洛粉碱（2，4，5一三苯基咪哇）与过氧化氢反应时，发现洛粉碱与氧发生化学反应产生一种绿色的光，这是人们首次利用合成化合物观察到的化学发光现象11。随后在1928年，Albrecht观察到鲁米诺在碱性介质中的化学发光行为，这一试剂的合成和发光现象的发现，对于化学发光发展成一种分析化学手段起到重要的作用12。1.3.2 化学发光的基本原理化学发光（Chemiluminescence, CL）是指在一些特殊的化学反应中，反应中间体或反应产物由于吸收了反应释放的化学能而处于价电子激发态，再由激发态回至基态过程中产生的一种光辐射。化学发光分析是一种分子光谱分析
8、法，它依据某一时刻化学发光强度（如峰值）或化学发光总量确定反应中相应组分含量。化学发光反应所以能用于分析测定，是因为化学发光强度与化学反应速度相关联，因而一切影响反应速度的因素都可以作为建立测定方法的依据。化学发光分析不需要外源性激发光源，避免了背景光和杂散光的干扰，降低了噪声，大大提高了信嗓比，因而化学发光分析具有很高的灵敏度。由于化学发光有灵敏度高、线性范围宽、设备简单、操作方便、易于实现自动化、分析快速的特点，在生物工程学、药物学、分子生物学、临床和环境化学等各个领域正显示出它蓬勃的生机。近年来，各种技术在化学发光中的运用，比如: 药物分析、分离技术、生物技术、传感器技术、芯片技术、免疫
9、技术等，使化学发光的选择性、灵敏度得到很大提高，更显出其作为一种痕量分析方法的优越性13。化学发光的最新发展主要在原有发光试剂及体系的基础上，研究合成新的发光试剂，建立新的发光体系，与其它技术，如流动注射技术（FIA）、高效液相色谱（HPLC）、固定化试剂技术、毛细管电泳技术、传感器技术以及生化免疫技术等联用。药物分析在临床、药代动力学及药物开发研究中具有重要地位，将化学发光用于药物分析不仅具有理论意义，而且还有重要的实用价值。1.4 流动注射分析法的原理1.4.1 概述流动注射技术（Flow Injection Analysis，简称FIA）的出现是科学技术发展过程中对化学信息的质量与数量要
10、求不断提高的结果，FIA是从实验室操作中的最基础部分入手来提高整个化学分析过程的效率及改善提供信息的能力。1988年，Ruzicka和Hanen在他们的第二部专著中，FIA定义为:“从注入一定体积并在无空气分隔的连续载流中得到分散的试样区带形成的浓度梯度中收集信息的技术”。流动注射技术可以以较简单的实验设备在广泛的领域中实现分析的自动化与高效率，能够通过单次测定提供有关试样不同稀释，试样与试剂不同混合比例的多维信息，因此在现代分析化学及其正在发生的第三次变革中占有非常重要的地位14。1.4.2 流动注射分析的原理15如图2所示，基本的FIA系统是由载流（carrier）驱动系统如蠕动泵，注射器
11、,反应器，流动式检测器和信号检测装置组成。它是将一定体积的试样溶液注入到以一定流速连续流动的载流试剂中，在流经反应器管道时试样与试剂之间相互渗透而形成一个个分散带，同时发生化学反应，在流经检测器时被检测，记录仪读出为一组峰形信号，即物理分散状态和化学反应状态的综合反应。虽然样品与载流试剂的混合总是不会完全的，然而，对一个固定的实验装置来说，只要流速不变，在一定的留存时间内，分散状态都是高度重现的，因此可以得到重现良好的分析结果。所以，与传统的化学分析操作相比，既不需要均匀混合，也不需要达到化学平衡，这不仅在幅度上提高了分析速度而且有效地提高了分析方法的选择性和灵敏度，为实现连续自动化分析奠定了
12、基础。图2 流动注射分析系统Fig.2 Flow Injection Analysis System1.3 流动注射化学发光法的优点流动注射（FIA）作为一种强有力的样品处理技术，只有同特定的检测技术相结合才能形成一个完整的分析体系，但也正因此它才有极为广泛的适用性。而化学发光分析法（CL），由于通常所使用的发光反应速度很快，所以必须保证样品与发光试剂能够快速、有效，高度重现的混合，流动注射技术满足了这一要求，将化学发光与流动注射相结合，兼有分析速度快，仪器设备简单，操作方便，灵敏度高、线性响应范围宽，不存在空白等显著优点。而随着药物分析的不断发展，它不但要求分析结果准确可靠，且要分析方法简单
13、快速，尤其是对痕量和微量药物分析，流动注射化学发光法显得更为重要。本文建立了一种用流动注射化学发光法测定曲克芦丁药物的新方法。该方法是在酸性介质中，高锰酸钾氧化曲克芦丁药物产生化学发光，甲醛显著增强该体系的发光强度，据此建立了一种简单、快速测定曲克芦丁药物的流动注射化学发光新方法。2.实验部分2.1 仪器与试剂BPCL微弱发光测量仪（中国科学院生物物理研究所）；HL-2 恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）；六通注射阀；BPCL 数据获取和处理软件，实验数据的采集、处理在Windows XP界面下的BPCL软件来完成。KMnO4 4 10-4 mol/L, H2SO4 0.1 mol/L,体积分数0.
14、3%的HCHO，使用时浓度逐级增加。曲克芦丁210-4 mol/L。二次蒸馏水；所用试剂均为分析纯。实验装置如图3所示。图3 流动注射化学发光法测定曲克芦丁流路图Fig.3 Schematic diagram of the flow-injection CL determinationof TroxerutinP - 蠕动泵；F - 流通池；D - 检测器；PC - 计算机；S - 样品溶液；A高锰酸钾; B甲醛+硫酸; W - 废液2.2 实验方法 按图3所示流路，将各输液管插入相应溶液，开启蠕动泵，分别将曲克芦丁，KMnO4与H2SO4和HCHO溶液以一定的流速通过相应的管道输入分析系统，
15、在流通池中产生化学发光，记录发光信号强度I，以此进行定量分析。3结果与讨论3.1 动力学曲线将2.010 -4 mol/L曲克芦丁溶液, 4.0mol/LH2SO4和4.0%的HCHO溶液在烧杯中混合后，将烧杯至于化学分析仪的暗盒中，打开分析系统，即可检测到很强的化学发光信号;待反应进行40s后,向上述混合液中注入1 .010 -3 mol/L的高锰酸钾溶液，相对化学发光强度迅速升高，大约70s后化学发光信号开始回落至基线。图4给出了相对化学发光强度一时间曲线图。图4 相对化学发光强度一时间曲线Fig.4 The relative chemiluminescence intensity-tim
16、e curve3.2 反应介质的选择当曲克芦丁的质量浓度为210-4 mol/L，以相同浓度的H2SO4、HCl、HNO3和H3 PO4为反应介质，考察了曲克芦丁对化学发光强度的影响，结果表明.在H2SO4介质中化学发光强度大且稳定（见图5）,所以实验中选择了H2SO4作为反应介质。图5 介质浓度对化学发光强度的影响Fig.5 Effect of the medium concentration on CL intensity实验中发现，随着硫酸浓度的增大，化学发光强度逐渐增大，同时基线也随之升高。实验表明:当硫酸浓度在1 .0-4.0mol/L范围内变化时，化学发光强度随浓度增大而加强；当硫
17、酸浓度达到4.0mol/L时,浓度增加化学发光强度保持一定（见图6），故选择浓度为4.0mol/L的硫酸溶液。 图6 硫酸浓度对化学发光强度的影响Fig.6 Effect of H2SO4 concentration on CL intensity3.3 高锰酸钾浓度的影响高锰酸钾在此化学发光反应中是氧化剂，对化学发光强度影响很大。在高锰酸钾的浓度为1.0-10.010-4mol/L范围内试验了高锰酸钾的浓度对化学发光强度的影响（见图7）。在实验中发现，随着高锰酸钾浓度的增大，化学发光强度逐渐增大，同时基线也随之升高。当高锰酸钾浓度在1.0-8.010-4mol/L范围内变化时，化学发光强度随
18、浓度增大而加强；当高锰酸钾浓度达到8.010-4mol/L时,浓度增加化学发光强度保持一定，故选择浓度为8.010-4mol/L的高锰酸钾溶液。 图7 高锰酸钾浓度对化学发光强度的影响 Fig.7 Effect of KMnO4 concentration on CL intensity3.4 甲醛浓度的影响在甲醛的体积分数为0-5.0%范围内试验了甲醛的浓度对化学发光强度的影响（见图8）。当甲醛体积分数在0-3.5%范围内变化时，化学发光强度随浓度增大而加强；当甲醛体积分数达到3.5%时,浓度增加但化学发光强度保持一定，故选择体积分数为4.0%的甲醛溶液。图8 甲醛浓度对化学发光强度的影响F
19、ig.8 Effect of HCHO concentration on CL intensity3.5 工作曲线、精密度与检出限在选定的最佳实验条件下，曲克芦丁浓度在3.010-4mol/L范围内与相对化学发光强度呈良好的线性关系（见图9），其回归方程为I=33.83710-5c+285.04（n=11，r=0.9948, c-曲克芦丁浓度（mol/L）, I为相对化学发光强度）。对浓度为1.010-4mol/L的曲克芦丁溶液进行11次平行测定，得相对标准偏差为1.6%,根据IUPAC建议，计算出方法的检出限为8.0图9 曲克芦丁的标准曲线Fig.93.6 共存物质的影响研究了曲克芦丁中可能
20、存在的无机离子与有机物对本方法的干扰。结果表明，对1.010-4mol/L的曲克芦丁，以测定相对误差不超过5%计，1000倍的K+、Ca2 +、NH4+、Cl-、Mg2 +、NO3-、SO42 -，10倍量的Co2 +、Ni2 +、Fe3 + 等常见无机离子对测定不干扰；200倍的淀粉、糊精、葡萄糖均不干扰测定;100倍的Vc,尿酸有干扰。3.7 样品分析准确称取10片曲克芦丁片（每片标示量60mg，江苏 药业有限公司）于研钵中研细混匀，然后准确称取0.10g药片粉末于烧杯中，用水溶解，定容于100 ml容量瓶中。测定时从100ml容量瓶中取出1ml定容于100ml容量瓶，作为样品溶液（10m
21、g/L），进行标准加入回收试验，用标准曲线法测定曲克芦丁针剂中曲克芦丁的量,测得回收率，结果见表1。表1 曲克芦丁的药物分析结果Tab.1 Determination results of troxerutin in pharmaceutical perparations样品序号曲克芦丁含量（mol/L）加入曲克芦丁回收曲克芦丁回收率（%） 14.410-51.05.5110 24.610-498 34.59.01.39541.1 1.6 1043.8 机理讨论4.结论参考文献:1 陈新谦,金有豫.新编药物学.北京:人民卫生出版社,2000,4082 周昌奎,吴晓华.曲克芦丁临床研究新进展J.
22、中国生化药物杂志, 2005,26（05）3 于素华，龚爱琴,嵇正平,马正军，朱霞石.曲克芦丁的紫外-可见分光光度法测定J.扬州大学学报（自然科学版）,2006,9（1）:284 余穗萍，王金陵.分光光度法测定维脑路通注射液的含量J.江苏药学与临床研究，2003,11（12）: 25-265 杜德国,孙素琴,周群等.光谱学与光谱分析,2000,20（4）:474.6 李向军,熊辉,袁悼斌.分析实验室,2001,20（5）:417 何丽一,李宝明.维脑路通的组分分析J,药物分析杂志,1987,7（4）: 251-253 8 赫春香，张淑敏.维脑路通的伏安法行为及其二阶导数卷积伏安法测定J.分析实
23、验室,2001,20（2）:23-26 9 岑志芳,林琼.高效液相色谱法测定曲克芦丁氯化钠注射液中曲克芦丁的含量J.药物研究,2005,8（2）:1110 刘同华，卢来春.高效液相色谱法测定曲克芦丁注射剂的含量J.中国药房，2004,15（6）:365-36611 RadziszewskiB.,Chem.Ber,1877,10,70.12 AlbreehtH.0.,Z.Phys.Chem.,1928,136,321.13 M.Yamaguchi,H.Yoshida,H.Nohta,J.Chromatogr.A 2002,950,1.14 Ruzacka J.,Hansen E.H.,Flow
24、Injection Analysis.,M.（Second edition）.NewYork:John Wileysons（1998）:19115 方肇伦,流动注射分析法,科学出版社,199916 翻译：化学发光法检测鲁米诺-高锰酸钾反应中高锰酸盐的（CODMn）指数一种新型的化学发光（CL）系统结合流动注射分析测定高锰酸盐（CODMn）指数在本文中已被提出。在此基础上的鲁米诺-高锰酸钾化学发光反应，是由光电倍增管检测到鲁米诺-高锰酸钾系统造成发光的，样品消解后高锰酸钾的外观所决定的其强度与CODMn成反比。影响CODMn确定，如pH值，浓度和干扰进行了详细的调查。在优化的实验条件下，CODM
25、n的质量浓度在0.3-200 mg / L范围内有良好的线性关系，检出限为0.3 mg / L。对5.0 mg / L的CODMn进行11次平行测定，其相对标准偏差为4.3%。这种流动化学发光系统确定CODMn简单，快速，适用于自动分析。获得的数据的方法相当吻合这些标准得到的滴定法。它已被用于确定实际样品，结果令人满意。关键词：流动注射;化学发光;高锰酸盐CODMn指数;鲁米诺-高锰酸钾介绍：截至目前，化学需氧量（COD），它可以表明水受还原性污染物的污染程度，是有机污染水系统的主要评估因素，也是个最重要的水质监测参数（APHA,，1989年）。标准反滴定法（APHA,1992）化学需氧量决定
26、有机物样品的组成，加入已知量的氧化剂，在高温的开放式容器中反应和滴定过剩的氧化剂。在此基础上氧化剂的使用，标准COD的方法可分为重铬酸钾法或高锰酸钾的方法。由于它的较高的退化程度趋向于较广泛的有机污染，标准重铬酸钾法相对于后者广泛使用和普及。但是，标准重铬酸钾法有几个缺点：即回流过程费时（2-4h），昂贵的和有剧毒的试剂等。因此，标准重铬酸钾法在日本已被抛弃。在中国，标准重铬酸钾法指定作为化学需氧量（GB11914-89,1990），和高锰酸盐法是指定为高锰酸盐指数（CODMn） （GB11892-89, 1990）。前者主要用于分配有机污染物的需氧量在重污染水体中有机污染30mg/L的需氧量
27、，如工业废水。后者是检测地表水的有机污染物（GB 3838-2002,2002）和地下水（GB/T 14848-93,1994）在1.0 到15.0 mg/L范围内的有机污染物的需氧量。然而，传统的方法有一系列的弊端：（1）分析时间过长，包括消化时间和滴定时间；（2）操作也是相当大，从而增加了错误的概率和可重复性的结果取决于操作技巧；（3）相当高消费的化学品（4）一些无机物种造成干扰；（5）样品消解后反滴定法是一个敏感的方法检测。因此，有必要开发低成本，操作简便，自动化，易于维持更高的灵敏度和线性范围更广泛的质量控制的CODCr和CODMn分析仪器。这些成就主要集中于改进消化和分析方法。例如，
28、有些报告已经出版关于微波辐射作为CODCr的热源的测定应用，这些方法可能大幅降低加热时间（Cuesta et al., 1996; Balconi et al., 1992）。另一方面，一些新的分析方法报导，测定COD，包括光度法（Jirka and Carter, 1975; Jones et al., 1985）, 原子吸收光谱法（Cuesta et al., 1998）, 光催化降解法（Kim et al., 2001） 和光电化学法（Zhao et al., 2004; Zhang et al., 2006）, 等等。在这些分析方法中, 光度法是最在化学需氧量测定中最普遍使用的方法. 尽管如此,一些固有的问题在这些分光光度计测量系统中还是呈现出来: （1）为了增加试剂的氧化能力和降低消化时间, 这些系统加热以便沸腾，而由于泡沫形成，沸腾的信号经常不稳定 （Balconi et al., 1992）; （2）样本显示，由于严重干扰，高浊度不适合这种方法 （Jirka and Carter, 1
