1、具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。（2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DN之外，并具有自我复制能力的双链环状DA分子。（3）其它载体： 入噬菌体的衍生物、动植物病毒 （二）基因工程的基本操作程序第一步:目的基因的获取1.目的基因是指: 编码蛋白质的结构基因 。目的基因获取方法:从基因文库中获取;CR技术扩增目的基因;人工化学直接合成2.原核基因采取直接分离获得,真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法_。3.CR技术扩增目的基因（）原理：A双链复制（2）过程:第一步：（变性）加热至9095DA解链；第二步:（复性）冷却到560，
2、引物结合到互补DNA链;第三步：（延伸）加热至7075,热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。基因表达载体的构建（核心）目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。.组成：目的基因+启动子终止子+标记基因（复制原点）（）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRA,最终获得所需的蛋白质。（2）终止子:也是一段有特殊结构的DNA片段 ,位于基因的尾端。（）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。将目的基因导入
3、受体细胞1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。常用的转化方法:将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和花粉管通道法等。农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染力;Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。转化：目的基因插人i质粒的TDA农杆菌导入植物细胞目的基因整合到植物细胞染色体上目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。 其次还有基因枪法是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高花粉管通道法这是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便经济的方法。（我国的转基因抗
4、虫棉就是用此种方法获得的）将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。方法的受体细胞多是受精卵。操作程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵） 显微注射注射了目的基因的受精卵移植到雌性动物的输卵管或子宫内发育新性状动物。将目的基因导入微生物细胞:原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ,最常用的原核细胞是 大肠杆菌 ,其转化方法是：先用 a2+ 处理细胞，使其成为 感受态细胞 ,再将 重组表达载体DNA分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基
5、因是否表达。第四步:目的基因的检测和表达1.首先要检测 转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用NA分子杂交（DNANA）技术。.其次还要检测目的基因是否转录出了A,方法是采用分子杂交（DARA）技术即用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。3.最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质,用相应的 抗体进行抗原-抗体杂交。.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如抗虫或抗病接种实验。（三）基因工程的应用1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物,利用转基因改良植物的品质。.动物基因工程:提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。.基因治疗:把
6、正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。分为体外基因治疗和体内基因治疗（四）蛋白质工程的概念蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）转录 翻译蛋白质工程与基因工程区别蛋白质工程基因工程实质通过改造基因,以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋白质将目的基因从供体转移到受体细胞,并在受体细胞中表达结果合成自然界不存在的蛋白质只能生产自然界已存在的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程基础上,延伸出的第二代基因工程专
7、题2 细胞工程植物细胞工程1.理论基础（原理）：细胞全能性（1） 内因:每个细胞都含有该物种全部遗传信息 （2）外因：离体（植物器官、组织、细胞），人工配制的培养基（植物激素和有机营养和无机营养）、无菌和人工控制的适宜培养条件（如:适宜的温度、P值、光照）。（3）细胞分化是指在个体发育中,由一个或一种细胞增殖产生的后代,在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。原因是在个体发育过程中，不同的细胞中遗传信息执行情况不同（或基因选择性表达）（）在理论上，生物的任何一个细胞都具有发育成完整个体的潜能,但在生物的生长发育过程中,细胞并不表现全能性,而是分化成各种组织和器官。原因是特定的时间和空间条
8、件下，细胞中的基因会有选择性地表达出各种蛋白质,分化形成不同的细胞，从而构成生物体的不同组织和器官。2.植物组织培养技术 （1）过程:离体植物的植物器官、组织、细胞（外植体） 愈伤组织幼根和芽或胚状体 完整植株。（2）用途:微型繁殖：（1）概念:植物的快速繁殖技术就是利用组织培养的方法将植物体某一部分的组织小块进行培养并诱导分化成大量的小植株,从而达到快速无性繁殖的目的,也称快速繁殖技术。（2）微型繁殖技术：快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。（3）特点：保持优良品种的遗传特性。高效快速地实现种苗大量繁殖。作物脱毒:（1）材料：无病毒的植物分生组织（茎尖）。 （2）脱毒苗：切取一定大小的茎尖进
9、行组织培养获得的。制造人工种子:（1）特点:后代不会发生性状分离。不受季节、气候和地域限制。（2）结构：人工薄膜和或胚状体或不定芽或顶芽或腋芽。（）人工种子的制备,如图人工种子主要由三部分组成，一是胚状体（分生组织）,它相当于天然种子的胚,是有生命的物质结构;二是供胚状体维持生命力和保证其在适宜的环境条件下生长发育的人工胚乳;三是具有保护作用的“人工种皮”。（）人工种子的优越性 可以保持杂种优势。 快捷高效的繁殖方式;节约了大量土留种地。 可人为控制植物的生长发育与抗逆性:人工胚乳除了含有供胚状体发育成植株所必需的营养物质外,还可以在其中加入除草剂、弱病毒、杀菌剂、农药、抑制休眠的物质及对植物
10、生长有益的细菌等，使其具备抗逆性和耐贮性等优良特性,也可添加激素类物质以调节植物的生长发育。与试管苗技术比较,人工种子技术具有成本低、贮藏运输方便、减少了移栽驯化过程和生产周期短等优点。单倍体育种 （）方法:花药离体培养法。 （2）优点:后代稳定遗传，都是纯合子。明显缩短了育种年限。突变体的利用（1）产生:植物组织培养过程中，由于培养细胞一直处于不断的分生状态，因此容易受到培养条件和外界压力（如：射线、化学物质等）的影响而产生突变。 （）利用:筛选对人们有用的突变体，进而培育新品种。细胞产物的工厂化生产（1）种类：蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱等。 （2）技术：植物植物组织培养技术。（
11、）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。.植物体细胞杂交技术（）过程:如图在此过程中需要注意的问题有:物体细胞杂交过程中,植物细胞融合所依据的生物学原理是细胞膜的流动性;植物组 织培养的理论基础是植物细胞的全能性。体细胞融合成功以后，既有AB型杂种细胞,还能形成AA型和BB型两种融合细胞，但只有A型细胞是植物体细胞杂交所形成的杂种细胞,因此在杂种细胞形成后还应有一个筛选过程。目前常用的去除细胞壁的方法是酶解法,保证了原生质体活性。植物体细胞杂交完成的标志是新细胞壁的形成。植物体细胞杂交过程仍以植物组织培养为前提，通过植物组织培养完成杂种植株的培育过程。植物体细胞杂
12、交的最大突破是克服远缘杂交不亲和的障碍，但是目前仍有许多理论和技术问题没有解决,离推广应用仍有一定距离。（2）诱导融合的方法:物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PG）作为诱导剂。（3）意义:克服了远缘杂交不亲和的障碍。（二）动物细胞工程 动物细胞培养动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）剪碎用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞制成细胞悬液转入培养瓶中进行原代培养贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。（3）
13、细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖,这种现象称为细胞的接触抑制。（4）动物细胞培养需要满足以下条件无菌、无毒的环境:培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素,以防培养过程中的污染。此外,应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。营养:合成培养基成分:糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。温度:适宜温度:哺乳动物多是36.50.5;:7.2.。气体环境：9空气5%CO。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液
14、的H。（5）动物细胞培养技术的应用:制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。50代以后的细胞为细胞系，遗传物质发生了改变；保存的细胞通常为0代以内的细胞,以保持正常的二倍体核型2动物体细胞核移植技术和克隆动物（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。（2）选用去核卵（母）细胞的原因：卵（母）细胞比较大，容易操作；卵（母）细胞细胞质多,营养丰富。（）克隆原理：动物细胞核的全能性（）体细胞核移植的大致过程是：核移植技术动物细胞培养技术胚胎移植技术（5）体细胞核移植技术的应用:加速家畜遗传改良进程,促进良畜群繁育； 保护濒危物种,增大
15、存活数量；生产珍贵的医用蛋白； 作为异种移植的供体；用于组织器官的移植等。（6）体细胞核移植技术存在的问题:克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。3动物细胞融合（1）动物细胞融合也称细胞杂交,是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似,常用的诱导因素是灭活的病毒。（3）动物细胞融合的意义:克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。（4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的
16、比较：比较项目细胞融合的原理细胞融合的方法诱导手段用法植物体细胞杂交细胞膜的流动性去除细胞壁后诱导原生质体融合离心、电刺激、振动，聚乙二醇等试剂诱导克服了远缘杂交的不亲和性，获得杂种植株动物细胞融合使细胞分散后诱导细胞融合除应用植物细胞杂交手段外,再加灭活的病毒诱导制备单克隆抗体的技术之一.单克隆抗体（1）抗体：一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。（）单克隆抗体的制备过程: （3）杂交瘤细胞的特点:既能大量繁殖,又能产生专一的抗体。两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出既能大量繁殖，又能产生专一的抗体的杂交瘤细胞,还要进行克隆化培养和抗体检测
17、。（）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高,并能大量制备。（5）单克隆抗体的作用: 作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异,并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。 用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗,可制成“生物导弹”,也有少量用于治疗其它疾病。专题 胚胎工程. 体内受精和早期胚胎发育胚胎工程的建立场所：睾丸的曲细精管时间:从初情期开始，到生殖机能衰退精子的发生 1）精原细胞多个初级精母细胞（通过数次有丝分裂）过程 2）1个初级精母细胞2个次级精母细胞个精子细胞（通过减数分裂,即MI和MI）3）精子细胞精子（通过变形）高尔基体顶体中心体尾部 线粒体线粒体
18、鞘 其它物质原生质滴 场所:卵巢 时间：从胎儿时期开始（胎儿时期完成了卵泡的形成和在卵巢内的储备）卵子的发生 1）卵原细胞初级卵母细胞过程 2）1个初级卵母细胞个次级卵母细胞+第一极体（M排卵前后完成）3）个次级卵母细胞个卵子+第二极体（MI精子和卵子结合过程中完成） 概念：精子和卵子结合成合子（受精卵）的过程。 受精 场所:雌性的输卵管内 卵子受精的标志:卵黄膜与透明带之间有两个极体1）受精前的准备阶段1：精子获能 过程 2）受惊前的准备阶段2：卵子的准备（发育到II中期才具备受精能力）.精子穿越放射冠和透明带：顶体反应,透明带反应3）受精阶段 .进入卵黄膜:卵黄膜反应c.原核形成和配子结合
19、:雌原核小于雄原核 卵裂期:细胞在透明带中进行有丝分裂,胚胎的总体积并不增加或略有缩小早期胚胎发育 桑椹胚:胚胎细胞达32个左右,每一个细胞都具全能性囊胚:有囊胚腔,出现了囊胚从透明带中伸展出来的孵化过程。出现了内细胞团（发育成胎儿各种组织）和滋养层原肠胚：内细胞团细胞形成外胚层和内胚层,滋养层发育成胎膜和胎盘,内胚层包围着原肠腔3.2 体外受精和早期胚胎培养试管动物技术:通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育为早期胚胎后，再经移植产生后代的技术。 方法一:用促性腺激素处理，使其超数排卵,从输卵管中冲取卵子（针对卵母细胞的采集 实验动物,家畜猪、羊等） 方法二:从屠宰母
20、畜卵巢中采集方法三:借助超声波探测仪、内窥镜、腹腔镜等工具直接从活体母畜 卵巢中吸取（针对大家畜或大型动物,如牛） 体外受精 卵母细胞的培养：在体外人工培养成熟（发育到II中期才具备受精能力） 精子的采集：方法有假阴道法、手握法和电刺激法等精子的获能：方法有培养法（通过获能培养液）、化学诱导法（通过肝素或钙离子载体A387） 获能溶液或专用的受精溶液受精：获能的精子 培养成熟的卵子 完成受精 培养液小滴内胚胎早期培养 条件:受精卵在发育培养液中培养 培养液成分：无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸、血清等试管婴儿与设计试管婴儿的区别是后者比前者多了胚胎移植前的遗传学诊断。3. 胚胎工程
21、的应用及前景概念：是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体叫供体，接受胚胎的个体叫受体。应用:胚胎移植是转基因、核移植、或体外受精等技术的最后一道“工序”现状：在牛的胚胎移植中，技术方法更为简便、实用。意义:大大缩短了供体本身的繁殖周期,可充分发挥雌性优良个体繁殖潜力。供体主要职能只是产生优良特性的胚胎，缩短繁殖周期胚胎移植成功与否关系到:供体和受体的生理状况胚胎移植 ）供、受体生殖器官的生理变化相同，为胚胎提供相同的生理环境生理学基础 ）早期胚胎没有与母体子宫建立组织联系,为
22、胚胎收集提供可能3）受体对外来胚胎基本不发生免疫排斥反应,为胚胎的存活提供可能4）胚胎能与受体子宫建立正常的生理和组织联系,但其遗传物质不受影响）供、受体的选择和处理（使用激素进行同期发情处理、促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理）2）配种或人工受精基本程序 3）胚胎收集（冲卵）、检查（胚胎发育到桑椹胚或囊胚）、培养或保存（-96的液氮）胚胎移植:手术法（引出子宫和卵巢将其注入）;非手术法（用移植管将其送入子宫）5）移植后的检查（是否妊娠）等 概念:指采用机械方法将早期胚胎切割成2、4或8等份等,经移植获得同卵双胎或多胎的技术。 仪器设备:实体显微镜和显微操作仪操作程序 1）选择发育良好、形态正
23、常的桑椹胚或囊胚，移入盛有操作液的培养皿胚胎分割 2）用分割针或分割刀切开胚胎,吸出半个，注入空透明带或直接将裸半胚移植给受体。分割囊胚时要将内细胞团均等分割,否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育,此时还可用分割针分割滋养层，做胚胎N分析及性别鉴定。局限:刚出生的动物体重偏低，毛色和斑纹上存在差异,同卵多胎的可能性有限。概念:由早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞。简称或EK细胞。特点 形态上：体积小、细胞核大、核仁明显 功能上:具有发育的全能性，即可分化为成年动物体任何一种组织细胞;在体外可胚胎干细胞 增殖而不发生分化;可冷冻保存;可进行遗传改造 1）移植ES细胞修复坏死或退化部位，治愈
24、糖尿病、肝（心）衰竭、成骨不良等病症 意义 2）ES细胞体外诱导分化,可培育人造组织器官 3）ES细胞在牛黄酸、丁酰环腺苷酸等分化诱导因子作用下可向不同类型组织细胞分化专题4 生物技术的安全性和伦理问题（一）转基因生物的安全性争论 :（1）基因生物与食物安全:反方观点：反对“实质性等同”、出现滞后效应、出现新的过敏原、营养成分改变正方观点:有安全性评价、科学家负责的态度、无实例无证据（2）转基因生物与生物安全：对生物多样性的影响扩散到种植区之外变成野生种类、成为入侵外来物种、重组出有害的病原体、成为超级杂草、有可能造成“基因污染”生命力有限、存在生殖隔离、花粉传播距离有限、花粉存活时间有限（3
25、）转基因生物与环境安全：对生态系统稳定性的影响反方观点:打破物种界限、二次污染、重组出有害的病原微生物、毒蛋白等可能通过食物链进入人体不改变生物原有的分类地位、减少农药使用、保护农田土壤环境（二）生物技术的伦理问题（1）克隆人：两种不同观点，多数人持否定态度。否定的理由:克隆人严重违反了人类伦理道德,是克隆技术的滥用；克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的伦理道德观念；克隆人是在人为的制造在心理上和社会地位上都不健全的人。肯定的理由：技术性问题可以通过胚胎分级、基因诊断和染色体检查等方法解决。不成熟的技术也只有通过实践才能使之成熟。中国政府的态度：禁止生殖性克隆,不反对治疗性克隆。四不
26、原则:不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人的实验。（2）试管婴儿:两种目的试管婴儿的区别两种。不同观点,多数人持认可态度。把试管婴儿当作人体零配件工厂，是对生命的不尊重；早期生命也有活下去的权利,抛弃或杀死多余胚胎,无异于“谋杀”。肯定的理由:解决了不育问题，提供骨髓中造血干细胞救治患者最好、最快捷的方法,提供骨髓造血干细胞并不会对试管婴儿造成损伤。（3）基因身份证：个人基因资讯的泄漏造成基因歧视,势必造成遗传学失业大军、造成个人婚姻困难、人际关系疏远等严重后果。通过基因检测可以及早采取预防措施，适时进行治疗,达到挽救患者生命的目的。（三）生物武器 （1）种类：致病菌、病毒、生化毒剂
27、,以及经过基因重组的致病菌。（2）散布方式：吸入、误食、接触带菌物品、被带菌昆虫叮咬等。致病力强、多数具传染性、传染途径多、污染面广、有潜伏期、不易被发现、危害时间长等。（4）禁止生物武器公约及中国政府的态度专题5生态工程. 生态工程的基本原理生态工程建设目的：遵循自然界物质循环的规律，充分发挥资源的生产潜力,防止环境污染，达到经济效益和生态效益的同步发展。（少消耗、多效益、可持续）生态经济:主要是通过实行“循环经济”原则,使一个系统产生出的污染物,能够成为本系统或者另一个系统的生产原料,从而实现废弃物的资源化,而实现循环经济最重要的手段之一是生态工程。 1）物质循环再生原理:物质能在生态系统中循环往复,分层分级利用 2）物种多样性原理:物种繁多复杂的生态系统具有较高的
