1、这类染料电离后染料离子带负电荷、如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等,可与碱性物质 结合成盐。（2碱性染料这类染料电离后染料离子带正电荷、可与酸性物质结合成盐。微生物实验室一般常用的碱性染料有 碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等,在一般的情况下,细菌易被碱性染料染 色。（3中性（复合染料酸性染料与碱性的结合物叫做中性（复合染料,如伊红、美兰等,瑞脱氏（Wright染料和基姆 萨氏（Gimasa染料等,后者常用于细胞核的染色。（4单纯染料这类染料的化学亲和力低,不能和被染的物质生成盐,其染色能力视其是否溶于被染物而定,因为 它们大多数都属于偶氮化合物,不溶于水,但溶于脂肪
2、溶剂中,如苏丹类（Sudan b的染料。微生物染色常用的染料如表2-l所示。表 2-1 各种染料的特性与用途 三、实验材料1. 涂片染色用的细菌培养物（1大肠杆菌（Escherichia coli24h的斜面培养物。（2枯草杆菌（Bacillus subtilis12-16h的斜面培养物。2. 载玻片、接种环、镊子、酒精灯、各种染色液、火柴、无菌牙签、玻璃铅笔、蒸馏水。3. 显微镜、镜头油、擦镜纸、吸水纸、二甲苯等。4. 示范片（1苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis的芽孢;（2胶质芽孢杆菌（Bacillius mucillaginosus的荚膜;（3枯草芽孢杆菌的鞭毛
3、四、实验程序（一细菌染色的方法染色的方法一般分为单染色法（又称一般染色法和复染色法（又称特殊染色法两种。简单染色 法是用一种染色液染色菌体后,就可以观察微生物的大小、形状和细胞排列状况,但不能鉴别微生物以 及它的特殊构造等。复染色法是用两种或两种以上染色液进行染色,有协助鉴别微生物的作用,故也称 鉴别染色法。常用的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法,还有鉴别细胞各部结构的如芽孢子染色 法、荚膜染色法、鞭毛染色法、细胞核染色法等的特殊染色法。（二细菌染色的方法和步骤微生物染色技术的一般过程如下:涂片干燥 固定 染色媒染脱色复染水洗干燥镜检。l. 简单染色法（一般染色法（1菌种:牙垢细菌。（2涂
4、片:取洁净无油污的载玻片一块,在玻片中心加一小滴蒸馏水,用无菌牙签取牙垢少许, 涂于玻片的水滴中,并涂成直径约为10mm的均匀薄层,用过的牙签的立即投入废物桶。（3干燥:让涂片自然气干或将涂面朝上在酒精灯上高处微微加热,使水分蒸发但切勿紧靠火焰 或加热时间过长,以防标本烤焦而变形。（4固定:将已干燥的涂片,涂面朝上,在酒精灯火焰外层尽快的来回通过23次,杀死微生物, 固定细胞结构便于染色。待玻片冷却后再加染色液。（5染色:将涂片置于水平位置上,在整个涂面上滴加齐氏石碳酸复红染色液,染色1min左右。 通常染色时间的长短取决于菌体、染色液的种类和它的浓度。（6水洗染色时间一到,倾去染色液、并用自
5、来水细流冲洗涂片,洗至流下的水中无染料颜色为 止。（7干燥:在空气中自然干燥,也可用吸水纸吸去载玻片上的水,但应注意不能将滤纸在涂面上 拖擦。（8镜检:干燥后的载片标本可用显微镜观察、从低倍到油镜,在油镜下观察牙垢中的各种细菌 形态,并绘出典型的视野图。2. 革兰氏（Gram染色法革兰氏染色法是复（特殊染色法中一种最重要的鉴别性染色法之一。于1984年由丹麦病理学家 Gram所创立,最初是作为观察组织切片中细胞之用,后因其可将所有的细菌区分为差别明显的革兰氏阳 性和革兰氏阴性菌两大类,从而成为检验细菌中最常用的鉴别染色方法。该染色法是先将细菌用结晶紫染色,再加媒染剂碘液媒染以增加染料和细菌细胞
6、的亲和力,使它和 结晶紫在菌体细胞壁部位形成分子量较大的紫碘复合物,而后用脱色剂酒精或丙酮脱色,最后再用复染 剂番红复杂。如果细菌经脱色剂酒精或丙酮处理后不被脱色而保存初染颜色即紫色,即为“革兰氏阳性 菌”;若初染被脱色而染上复染剂番红颜色即淡红色,则为“革兰氏阴性菌”。革兰氏阳性细菌紫色,也写作G+;革兰氏阴性细菌红色,也写作G-。革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤,但在具体操作方法上有多种做法。 （1涂片取一块洁净的载玻片,用特种铅笔在载片的左右侧,注上菌号,并在载片两端各滴一滴蒸馏水。将 接种环在火焰上灼烧灭菌,以无菌操作法（见图2-l在（1号菌（见实验材料菌苔上挑取菌
7、体少 许,注意不要挑起培养基。放在载玻片一端的水滴中,涂成均匀的薄层、接种环使用后必须立即经再次 火焰灭菌,才可放下。再用经火焰灭菌过的接种环取（2号菌苔涂片、并按照简单染色法的操作进行 干燥固定。（2染色初染将涂片置于水平位置上,在做好的左右涂面上滴加草酸铵结晶紫染色液,染色1min。然后倾去染色 液用自来水细流冲洗至洗出液中无紫色。媒染先用新配的路哥氏碘液冲去涂片面上的残水,再用路哥氏碘液覆盖涂面媒染1min,然后水洗。 脱色除去残余水后滴加 95%酒精进行脱色至玻片上流下的酒精液中紫色接近消失为止,约30sec。并立即用自来水细流冲洗,终止酒精的作用。 复染滴加番红染色液染色1min。水
8、洗后用吸水纸吸干各步骤见图2-2。（3镜检在油镜下观察染色后的大肠杆菌和枯草杆菌加以鉴别,并绘图说明染色的结果。图2-1 涂片过程的无菌操作图2-2 革兰氏染色程序3. 芽孢染色法（示范芽孢染色法是为了观察细菌芽孢时使用的一种特殊染色法。细菌的芽孢含水量少脂肪含 量较高,芽孢壁较厚对染料的透性差,不易着色。但是一旦着色后又难以脱色。通常,芽孢染色采用弱碱性染料孔雀绿在加热的条件下进行,染色完毕,用自来水冲洗。因孔雀绿 是弱碱性染料,与菌体结合较差,因此易被水冲洗掉,而芽孢中的孔雀绿却难于溶出。水洗后,再用一 种呈红色的碱性染料加以复染。结果菌体即被染成红色,芽孢呈绿色。（1涂片:取在牛肉膏蛋白
9、胨琼脂外面上培养24-28h的苏云金芽孢杆菌涂片、固定,操作方法与 简单染色法相同。（2染色:在涂片面上铺一层滤纸片,在滤纸片上滴加孔雀绿染色液,使滤纸片湿润再放在水浴 锅上以蒸汽加热至冒蒸汽（或其它热源上加热也可,在涂片处不断添加孔雀绿染色液。勿使干涸,勿 使沸腾,又冒蒸汽,维持5-10min,冷却后水洗至流出水无绿色为止,再用番红染色液复杂1min,水 洗、用吸水纸吸干、镜检。（3油镜下观察,并绘图。芽孢呈绿色,菌体呈红色。4. 荚膜染色法（示范荚膜是细菌在新陈代谢过程中形成的并分泌于细胞壁外的粘液状物质。主要化学成分是多糖类物质。荚膜的折光性低,与染料的亲和力差,不易着色,但荚膜的通透性
10、较好,某些染料可 透过荚膜而使菌体着色,因此染色后在菌体周围有一浅色或无色的透明圈,即为荚膜。荚膜染色常用背景衬托染色法,即用有色的背景来衬托出无色（没有染上颜色的荚膜。有时也可 用单染色来进行染色。荚膜薄,易变形,因此在涂片过程中不能用加热来固定。（1制片取在细菌斜面上培养72h 左右的胶质芽孢杆菌涂片,涂片方法同简单染色法,自然干 燥,自然固定。在已自然晾干的涂面上,滴加 l%结晶紫染色液染色2min,以 20%硫酸铜冲洗数次。 再用自来水冲洗1次,晾干。（3镜检:油镜观察荚膜示范镜并绘图。菌体呈红色,荚膜则无色。5. 鞭毛染色法（示范细菌的鞭毛极细,直径约 0.01m0.02m,在普通光
11、学显微镜的辨晰度以外。首先用媒染剂染色,使其吸附在鞭毛上再用石碳酸复红液等复染,使鞭毛加粗,达到普通光学显微 镜的辨晰限度以内。有鞭毛的细菌只有在一定的个体发育阶段才产生鞭毛。一般在外界条件适宜时,幼 龄培养体易生鞭毛,尤其是在短期内经过多次反复移种的培养体,更易产生鞭毛。染色时,还必须采用 新鲜的染色液和非常洁净的载玻片,才能保证染色的质量。（1菌液的制备及涂片用于染色的菌种应预先连续移接56代。染色前用于接种的培养基应用新鲜配制的细菌加富培养基,表面较湿润。接种:先在斜面底部加入0.5-lmL 无菌水,取经活化的枯草杆菌以无菌操作法取 l至2环菌苔, 接种于斜面底部的无菌水中,在30?C温
12、度下培养15-18h,让生长旺盛的枯草杆菌由水面向上“爬行”生 长。制备菌液:用接种环轻轻挑取斜面底部近水面处“自行爬上”的菌苔数环,小心而又轻微地移入 盛有l mL与菌种同温的无菌水中,不要搅动,让有活动能力的菌体游入水中,使菌液呈轻度混浊、并在 28?C箱中保温10min,让老菌体及其它杂质下沉,使幼龄菌体在无菌水中自由运动以松散鞭毛。无标题文档 页码，6/8 鞭毛涂片：涂片之前，用悬滴法观察其运动性，若运动性很强，即可涂片。用接种环（或用毛细 管）在液面上挑取或吸取菌液数滴，置于载玻片的一端，稍稍倾斜玻片，使菌液缓慢地流向玻片的另一 端在载片表面形成菌液带，置玻片于空气中自然干燥、固定。
13、也可取菌液点样，占成梅花形，自然干 燥、固定。注意不能用加热干燥方法固定。 （2）染色 染色液必须新配制的。涂片必须充分晾干才能染色。 先用刚过滤的鞭毛染色液A染色7.5至8min左右。 倾去A液，再加鞭毛染色液B染色3-5min，水洗，自然干燥。 用C滚石碳酸复红复染2min，水洗晾干，镜检。 菌体与鞭毛都呈红色。 （3）油镜下观察鞭毛的数目及着生情况（周生鞭毛示范镜）并绘图。 思考题 1. 简单染色法中各步骤的注意事项是什么？ 2. 要得到正确的革兰氏染色结果必须注意那些操作？关键在哪几步？为什么？ 附录本实验中几种染色液的配制方法 1吕氏（Loeffler）美兰染色液 A液：美兰（Met
14、hylene blue） 0.3g 95%酒精30mL B液：氢氧化钾（KOH）0.01g 蒸馏水100mL 分别配制A液体和B液然后混合即成。 2. 齐氏（Ziehil）石碳酸复红染色液 A液：碱性复红（Basic fuchisin） 0.3g 95%酒精10.0mL B液：石碳酸（酚）5.0g 蒸馏水95mL 将碱性复红溶于95酒清中配成A液 将石碳酸溶于蒸馏水中，配成B液。 A和B两液混合即成。 3. 革兰氏染色液 （1）草酸错结晶紫液 A液：结晶紫（Crystal violet） 2.5g B液草酸铵（NH42C2O4H2O1.0g 蒸馏水100mL 2011-3-8 无标题文档 页码
15、，7/8 95酒精25.0 mL 将结晶紫研细后，加入95酒精，使之溶解配成 A液。 将草酸铵溶于蒸馏水。配成B液。 A、B两液混合即成。 （2）路哥氏（Lugol）碘液 碘1.0g 碘化钾2.0g 蒸馏水300mL 先将碘化钾溶于5mL左右的水中再将碘溶于碘化钾溶液中，溶时可稍加热，待碘片完全溶解后，再 加水补足至300mL。 （3）95酒精 （4）0.5番红（Safranine）液 蕃红酒精液（2.5）20mL 蒸馏水80mL 将2.5的番红酒精液作为母液，保存在棕色瓶中，使用时再稀释。 4. 芽孢染色液 （1）孔雀绿染色液 孔雀绿（Malachite green）5.0g 蒸馏水100m
16、L 先将孔雀绿研细，加入少许 95酒精溶解，再加入蒸馏水、静止 0.5h过滤待用。 5. 荚膜染色液 （1）l结晶紫水溶液 结晶紫1g 蒸馏水100mL （2）20硫酸铜水溶液 硫酸铜20g 蒸馏水100mL 6. 鞭毛染色液 费氏及康氏（Fisher和Cohn）液 原液I： 单宁（鞣酸）3.6g 原液II： 三氯化铁0.75g 蒸馏水50mL 2011-3-8 无标题文档 页码，8/8 95乙醇10mL 应用液：A液原液I B液： 原液I 27mL 37甲醛15mL 染色前用滤纸过滤后，取清液备用。 C液：齐氏（Zeihi）石碳酸复红液。 原液II 4mL 碱性复红0.05g 浓盐酸4mL 2011-3-8
