1、沙门菌多重耐药基因岛研究进展沙门菌多重耐药基因岛研究进展王 芳（综述），涂显春（审校）【摘 要】摘要:多药耐药基因组岛是指细菌染色体上一段具有典型特征的基因簇，携带有多种耐药基因，决定细菌的多药耐药性;多药耐药基因组岛具有移动元件的特征，如G+C百分比和密码子使用与宿主菌不同，常含移动基因，可以在同种甚至于不同种菌株间水平转移，加速了临床上多药耐药菌株的产生。目前已发现在沙门菌属和其他菌属的细菌中携带沙门菌多重耐药基因岛。由于沙门菌多重耐药基因岛1上的耐药基因具有可移动性，使其在细菌多重耐药获得与传播机制的研究中具有重要意义。【期刊名称】医学综述【年(卷),期】2011(017)010【总页数
2、】5【关键词】关键词:沙门菌多重耐药基因岛1;多重耐药;移动原件细菌的耐药性由耐药基因决定，耐药基因可以由染色体上一些特殊的位点编码，也可以由质粒携带。近年来，在细菌多重耐药机制的研究中出现了一个新概念:“耐药基因岛或耐药岛1”。耐药基因岛是指编码细菌耐药基因簇的较大的染色体DNA片段（10 kb），其特点是岛两侧一般具有重复序列和插入元件，不稳定，岛内含有潜在的可移动元件（如整合子、转座子等），编码细菌多种耐药的基因位于该基因岛上。研究表明，耐药基因岛的G+C含量与宿主菌染色体G+C含量有明显差异，说明它是细菌在进化过程中获得的2。发现及研究多重耐药基因岛为人们了解细菌多重耐药性获得和传播的
3、机制提供了有效途径。目前已经发现在沙门菌属中的许多菌株存在一个较大的耐药基因岛沙门菌多重耐药基因岛1（salmonella genomic island 1，SGI1），该多重耐药基因岛上携带有 blaPSE-1、floR、aadA、sul、tet等耐药基因，分别编码对氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、磺胺类药物、四环素等药物的耐药性1。目前在沙门菌以外的其他细菌中也发现存在该耐药基因岛，提示SGI1在细菌多重耐药基因传播和转移过程中发挥重要的作用，现对SGI1的研究进展综述如下。1 SGI1的发现沙门菌主要引起人类食源性传染病，在美国估计每年有400万人因此感染发病，600人死亡。这些感染中，大约
4、10%需要抗生素治疗3。噬菌体DT104型鼠伤寒沙门菌是最常见的一种致肠炎沙门菌，1989年首次从人体内分离鉴定该菌，到20世纪90年代初很快呈现全球流行，成为引起人类沙门菌感染的主要噬菌体型4，5。尽管在 20 世纪60年代对该菌已有描述，但直到80年代初，在英国分离出一株对氨苄青霉素（ampicillin）、氯霉素（chloramphenicol）、链霉素（streptomycin）、磺胺类药物（sulfonamides）、四环素（tetracycline）（五种抗生素简写为ACSSuT）同时耐药的DT104型菌，才发现该菌有多重耐药性5。进一步的研究发现，DT104型菌株的多重耐药决定区
5、是位于染色体上的一个较大区域，该区域被命名为SGI16。发现多重耐药基因定位于染色体引起很大关注，因为这表明即使无抗生素选择性压力，耐药性也会稳定持续存在。然而，引起更大关注的是在其他11种血清型的沙门菌中也发现了该耐药基因岛存在7-12，其他菌株一旦获得该耐药基因岛，即表现和DT104菌株相同的多重耐药性。20002002年对法国分离的所有肠炎沙门菌的一项研究表明，该国有83%的菌株携带有SGI1或其变异体13。Chiu等14对台湾流行的 22 株伤寒沙门菌Derby株进行SGI1多重耐药基因岛的检测，发现有13株沙门菌携带有SGI1抗性基因岛。2 SGI1的结构特征SGI1是一段长43 k
6、b的基因岛，有44个开放读码框，许多读码框与已知基因具有同源性，也有一些基因功能未知。抗生素抗性基因集中在SGI1上一段13 kb的区段上，该区段称为多重耐药基因区6，7，15。目前还不清楚 DT104 型沙门菌最初是从哪里、如何获得SGI1的，但该基因岛上的floR基因（介导氯霉素抗性）与已知位于铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）结合型质粒上的氯霉素抗性基因cmlA有53%的核苷酸是一致的15，同时发现介导四环素抗性的区域与鳗弧菌（Vibrio anguillarum）的抗性质粒高度相似，这些抗性基因中G+C的含量不同于沙门菌染色体，表明这些基因通过水平转移获得6。
7、其他抗性基因位于岛上的类整合子内，类整合子可以在许多G细菌中进行水平转移7。在研究DT104型沙门菌株形成多重耐药的分子机制时，Sandvang等16最先发现至少两个抗性基因存在于类整合子内，类整合子与许多G细菌的耐药性有关，其结构特征是5保守区内（5-CS）含有整合酶基因intI1，3保守区内含有qacE1和sul1基因，中央 attI整合位点内可能含有12个基因盒17。设计多重耐药DT104菌株类整合子保守区引物进聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，对扩增产物进行序列分析，发现了2个基因盒14，第一个基因盒长1.0 kb，与位于铜绿假单胞菌（Ps
8、eudomonas aeruginosa）耐药质粒携带的InC整合子上的aadA2基因盒同源18，第二个基因盒携带blaP1基因（也称为 blaPSE-1或 blaCARB-2基因，介导 -内酰胺类药物抗性），这是首次报道的整合子内带有-内酰胺酶基因（blaP1）盒，该整合子被命名为InD16。使用p22噬菌体进行转导试验结果表明，DT104菌株的ACSSuT耐药表型可以被转导，说明这些耐药基因簇集于染色体上19。Brigg等15通过克隆和测序，证明多重耐药DT104型沙门菌（耐药表型ACSSuT）的全部耐药基因与一个13 kb的Xbal片段有关系（图1）。整合子InC和InD分别位于片段的5
9、末端和3末端，序列分析表明整合子InC上的sul1基因部分缺失，可能没有功能。但整合子InD上的sul1基因是完整的。整合子InC下游区基因有53%与铜绿假单胞菌携带的氯霉素抗性基因cmlA一致。另外一项研究表明ACSSuT耐药型DT104株携带一个floR基因，该基因属于12-TMS（跨膜区段）外排家族20。在毗邻介导氯霉素抗性的floR基因下游区，鉴定到介导四环素抗性的tetR和tet（G）基因。有趣的是，对整合子InD上的整合酶基因序列分析表明，5部分区段到3末端被一个大约350 bp的groEL基因替代15。位于整合子InC和InD之间区域的序列显示与鳗弧菌（V.anguillarum
10、）所携带R质粒的序列高度同源（序列号分别为:D37826和 S52437）15。随后，在加拿大分离的一组人源和非人源DT104株确认了该区域的基因组成和结构21。2000年，Boyd等6从加拿大分离的一株人源DT104株中鉴定出抗性基因元件的大小及染色体插入位点。SGI1一词从此用来描述一段插入到染色体thdF基因3末端、两侧为18 bp不完整的正向重复序列、长43 kb的基因岛。在DT104分离株中，发现SGI1岛位于一个隐藏的逆转录噬菌体元件上游区，这个逆转录噬菌体元件位于染色体上yidY基因上游区。2001年，Boyd等7对这个基因岛的全部基因序列进行注释。SGI1由44个开放读码框组成
11、（标记为S001-S044，图1）。根据与已知基因的同源性，开放读码框可被分为7个主群:DNA 结合群（S001、S002、S020、S027、S028、S036、S037和S043）;DNA复制群（S003）;接合转移群（S005、S011-12、S023、S024 和 S026）;调控群（S004、S006、S007、S033 和 S035）;耐药群（S029-32、S034和S038-40）;其他功能群（S025和S026）和未知功能基因群或假定的开放读码框（S008-10、S013-19、S021-22、S041-42和 S044）。接合转移相关基因的存在说明这个元件可能来源于或至少部
12、分来源于质粒，很多与接合转移相关的基因可能与SGI1的可移动性相关。许多开放读码框与调节基因同源，因此有可能影响SGI1上其他基因或DT104基因组中其他基因的表达。序列分析表明基因岛上多重耐药区的两侧为反向重复序列，分别标记为IRi和IRt（图1）。这些反向重复序列限定了一个名为In104的复杂整合子的界限11。整合子In104与整合子In4结构相似，但有2个attI1位点，这2个位点分别来自整合子InC和InD，通过它们可以插入基因盒。整合子In104两侧为5 bp正向重复序列，表明它是SGI1通过转座事件得到的22。3 SGI1的变异体及变异机制大部分多重耐药DT104菌株携带SGI1，
13、耐药表型为ACSSuT。但是，许多DT104菌株和Agona菌株表现出不同的耐药表型，人们开始关注SGI1是否存在变异体23。利用 DNA杂交、PCR、序列分析等分子生物学技术分别研究耐药表型分别为为ACSSuTTm（Tm:甲氧苄氨嘧啶）、ASSuTm、Asu、ASSuT 菌株携带的耐药基因，结果表明每种不同表型的菌株都携带一个SGI1的变异体，PCR检测SGI1接合区域左侧的thdF基因和右侧的逆转录子或yidY基因均为阳性。研究发现在非鼠伤寒沙门菌中没有隐藏的逆转录子噬菌体，SGI1位于yidY基因的上游。研究还发现一株携带 SGI1、耐药表型为ACSSuTTm的伤寒沙门菌Agona菌株，
14、在sul1基因的下游插入一个长度4.1 kb的DNA片段，片段上包含了一个编码甲氧苄氨嘧啶抗性的dfrA10基因和3-CS的另外一个拷贝，该区域还包括含有orf513假定基因的2.1 kb的共同区段（common region，CR1），SGI1的这个变异体命名为SGI1-A。一株耐药表型为Asu的菌株的SGI1上携带有完整的类整合子，这个整合子中包含一个blaP1基因盒，这个变异体命名为SGI1-B。在耐药表型为Ssu的DT104菌株和Agona菌株中发现一个类似的结构，只是在整合子基因盒中带有aadA2基因，这个变异体称为SGI1-C。一株耐药表型为ASSuTm的 Agona株携带一个 S
15、GI1-C型结构，但在CR1/dfrA10区又与SGI1-A相同，这个变异体命名为SGI1-D。此外，还有一株耐药表型为 ASSuT的DT104株有一个IS6100的拷贝插入到floR基因并使该基因失活，IS6100拷贝之间的同源重组使整合子中间区域的方向颠倒，SGI1的这个变异体成为SGI1-E。另外，Carattoli等24从意大利分离的 DT104型和相关噬菌体型沙门菌株中，发现了 SGI1和SGI1-C，这个研究小组也注意到一株DT104株携带In104整合子，但在SGI1的左侧有缺失，由于这个SGI1变异体左侧末端结构还没有完全研究清楚，该变异体尚为命名。Weill等13对法国 20
16、002003年分离的多重耐药Paratyphi B株的一项研究表明，77%菌株带有SGI1，4%带有SGI1-C，2%带有SGI1-B。另外一项收集了比利时19922002年至少对一种抗生素耐药的Agona株的研究发现，55% 的菌株带有SGI1或其变体25，其中 85% 为 SGI1-A，2.3% 为 SGI1，2.3% 为SGI1-C，还有2.3% 带有一个称为SGI1-G的新的变异体，其耐药表型为ASSuTm。SGI1-G在结构上与SGI1-B相似，也带有在SGI1-A和SGI1-D中发现的CR1/dfrA10区域。在这项研究中，有7株耐药表型ACSSuT的菌株没有检测到右侧的结合位点基
17、因yidY，对这些菌株中的3株菌进行序列分析，结果表明，这些菌株带有一个与SGI1-A相似的结构，只是在SGI1-A的3末端毗邻染色体DNA处出现各种缺失。这些缺失在CR1右侧末端27 bp处即开始，扩展到与染色体 DNA连接处，由此产生3种变异株，分别是SGI1-AD1R（缺失7.1 kb）、SGI1-AD2R（缺失7.7 kb）、SGI1-AD3R（缺失8.5 kb）。另一株耐药表型为ACSSuTTm的Albany株，带有一个与SGI1结构相似的变异体，但aadA2基因被一个基因盒替代，该基因盒带有一个甲氧苄氨嘧啶抗性基因dfrA1和一个未知功能的orfC基因9，这个变体标记为 SGI1-
18、F。2株耐药表型为 ACSSuTGm（Gm:庆大霉素）的 Newport株11，分子特征显示它们携带与SGI1相似的结构，但aadA2基因分别被两个不同的基因盒取代，第一个被带有aac（3）-Id基因的基因盒取代，第二个被带有aadA7的基因的基因盒取代。这两个变异岛被标记为SGI1-H。另外一项研究涉及澳大利亚分离的几个血清型的菌株，在Paratyphi B型菌株中发现SGI1，Kiambu型菌株中发现SGI1-A，Infantis型菌株中发现 SGI1-D，Cerro和 Dusseldorf菌株中发现SGI1-F，Derby菌株中发现SGI1-I，Emek 菌株中发现 SGI1-J12。S
19、GI1-I（耐药表型为CSSuTTm）结构与SGI1相似，只是blaP1基因被dfrA1/orfC基因盒取代。SGI1-J（耐药表型CSuT）与SGI1-F结构相似，只是缺失了带blaP1的完整基因盒、qacE1和一些毗邻的序列。Levings等26研究发现在一株多重耐药肠炎沙门菌Kentucky菌株中存在SGI1的另一个变异体，命名为SGI1-K，该变体由一个携带aacA5-aadA7基因盒的In4型类整合子和一个汞抗性组件组成，汞抗性基因替代了SGI1的骨架部分，汞抗性区域和另一个未命名的10 kb左右的片段整合于反向重复序列Irt和SG1的3保守区段之间，这项研究表明SGI上的多重耐药区
20、与质粒上的多重耐药区一样，能够整合新的DNA片段。Cloeckaert等27报道了肠炎沙门菌Newport株携带的SGI1的另一个变异体SGI1-L，该变异体上携带一个含有dfrA15基因对甲氧苄氨嘧啶耐药的基因盒。荷兰科学家从马体内分离到携带SGI1变异体的伤寒沙门菌，经分析发现，该变体为一种新型变体，命名为SGI1-M，在该变异体中，SGI1中的 aadA2基因被 aadB基因替代28。迄今为止，已经发现在许多多重耐药沙门菌中存在SGI1及其变异体，根据变异体发现时间先后和抗性基因簇的不同将SGI1的变异体从SGI1-A命名到SGI-M26-28。SGI1通过染色体重组事件和在attI位点
21、上发生的抗性基因的替换形成这些变异体26。随着研究的不断深入，还将有更多的SGI1变异体被发现。无论SGI1从哪里起源，产生耐药性变异的最可能的机制是相同DNA片段之间同源重组导致的。重组可以发生在复制后的3-CS或5-CS、SGI1元件内部、SGI1元件和共生质粒携带的类整合子之间9，12，22，24。比如，重组发生在 SGI1 的5-CS 之间会产生 SGI1-B，而重组发生在3-CS会产生 SGI1-C。并且，质粒上的类整合子可以通过和 SGI1的5-CS和3-CS区域重组交换基因盒，在SGI1-C和质粒上携带blaP1基因盒的整合子之间以这种方式交换而形成SGI1-B。试验已证明，一个
22、由CR1/dfrA10/sul1衍生的环状结构可以通过sul1序列整合到到类整合子中23。并且，在没有甲氧苄氨嘧啶条件下，插入区域丢失的频率很低。来自质粒或SGI1变体的携带这些区域的类整合子元件可以在菌体内形成环状结构，通过正向重复sul1区域分子内的同源重组，重组到SGI1的3-CS区域形成SGI1-A，或SGI1-C的3-CS区域形成SGI1-D。4 SGI1的移动性在许多血清型的肠炎沙门菌中发现SGI1，在鼠伤寒沙门菌基因组内该岛位于隐藏的逆转录噬菌体上游区thdF基因的3末端，其他血清型伤寒菌中该岛位于yidY基因的上游区。在所有血清型伤寒沙门菌中，SGI1左侧均为不完整的18 bp
23、正向重复序列，右侧接点整合在沙门菌染色体上7-9，11。右侧接点处的正向重复序列（DR-R）与不携带SGI1的肠炎沙门菌thdF基因的最后18 bp完全相同。在所有血清型的沙门菌中左侧接点处的正向重复序列（DR-L）完全相同，说明这些序列均来自SGI1的供体菌。在不同血清型肠炎沙门菌染色体上鉴定出SGI1、染色体上SGI1两侧不完整的重复序列、SGI1携带整合酶、切割酶和接合功能区均表明该基因岛能进行水平转移。2005年，Doublet等报道SGI1从肠炎沙门供体菌接合转移给不携带 SGI1的肠炎沙门菌和大肠杆菌受体菌，并以位点特异重组方式整合到受体菌染色体上25。第一步，待整合的SGI1的左
24、右末端特异性接合形成环状SGI1，PCR检测染色体外环型的SGI1，研究发现精确切除染色体上SGI1需要SGI1编码的整合酶（图2），该酶与“人”字型整合酶家族相似。第二步，接合转移 SGI1需要辅助质粒存在。SGI1由供体菌向受体菌转移时，接合型IncC质粒R55因此穿过SGI1移动，以这种方式，SGI1的接合转移以每个供体菌有106105个转接合子的频率发生。如果缺乏Int整合酶基因，SGI1供体则不能形成SGI1转接合子。第三步，在环状SGI1（attP）的18 bp序列与肠炎沙门菌和大肠杆菌染色体thdF基因（attB）3末端相似的18 bp序列之间通过位点特异重组将SGI1整合到染色
25、体上。SGI1为不能自身转座的可移动元件，因此可被分类到整合型移动元件中24。通过接合转移传递SGI1有助于耐药基因在不同血清型的肠炎沙门菌之间传播。推测SGI1可以通过水平转移传播到其他携带保守thdF基因的肠道病原菌如大肠杆菌、志贺菌属或弧菌属中23。5 其他细菌携带的SGI1日本广岛大学的一项研究报道，在奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）临床分离株中发现一个携带多重耐药基因的新的SGI1变体，该临床分离株分离自一位糖尿病足患者的感染部位。这株奇异变形杆菌具有典型的SGI1多重耐药表型，除对甲氧苄氨嘧啶和萘啶酸耐药外，还对氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、磺胺类药物和四环素表现多
26、重耐药。对耐药基因的分子结构研究表明，这株奇异变形杆菌带有一个与SGI1相似的结构，除了编码对链霉素和大观霉素耐药的aadA2基因被编码甲氧苄氨嘧啶的dfrA15基因取代外，这个SGI1样结构与典型的SGI1无差别。并且，奇异变形杆菌染色体外的环型SGI1的核苷酸序列与DT104型鼠伤寒沙门菌完全相同。但是，PCR结果却发现，在奇异变形杆菌SGI1样结构的左侧和右侧均没有检测到代表SGI1整合到肠炎沙门菌染色体上的整合位点。因此，这个SGI1的新的变体可能通过不同位点整合在奇异变形杆菌的染色体上。在该菌株中还鉴定出一个Tn1826衍生的仅仅携带2个基因盒（sat2和aadA1）的2类整合子。该
27、研究首次报道了在沙门菌属以外的细菌中发现SGI129。Boyd等30对来自中国的30株奇异变形杆菌进行了SGI1的筛查，这些变形杆菌分别从患者粪便、食品和环境中分离到。PCR和DNA序列分析表明。一株携带SGI1;一株携带SGI1的变体SGI1-I;另外三株携带SGI1的一个新的变异体命名为SGI1-O。该项研究表明，SGI1作为携带耐药基因的可移动原件已在不同地域、不同生物之间传播扩散。6 研究SGI1的意义SGI1的发现使人们在认识细菌的多重耐药性方面更进了一步，SGI1在携带和传播细菌耐药性方面发挥着重要作用，给细菌耐药性的控制带来了困难。目前对于SGI1的研究还很有限，许多问题有待回答
28、，如SGI1是从哪里起源，如何形成;在其他种属的多重耐药菌中是否普遍存在;SGI1内部是否有一些可以单独转移的基因或基因盒;SGI1是否可以整合新的耐药基因;SGI1是否可以作为其他细菌耐药的来源以及如何控制细菌SGI1上基因的表达等，回答这些问题，有必要进行更全面和深入的研究。参考文献1Mulvey MR，Boyed DA，Olson AB，et al.The genetics of Salmonella genomic island 1 J.MicrobesInfection，2006，8（7）:1915-1922.2Georgios S，Vernikos，Parkhill J.Inter
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