1、关键字：碱性蛋白酶；酿酒酵母；酒精发酵；表面呈现表达ABSTRACTAs the reserves of petroleum decrease, ethanol, which is renewable, has become the focus of many countries as an alternative liquid fuels to gasoline. Bioethanol production by saccharomyces cerevisiae is currently by volume, the single lagest fermentation process in
2、 industrial biotechnology. Therefore the development of cost-effective technologies for fuel ethanol production is a priority for many researchers. Improvement of the fermentation competence of yeast strain by gene engineering and metabolic engineering will decrease the costs of ethanol production.A
3、lthough the materials used for ethanol production contain relatively high protein content （corn: feeding barley: 15-18 %）, the yeasts used in fuel ethanol manufacture are unable to metabolize soluble proteins. To improve the substrate utilization and ethanol yield, the Apr E gene ,encoding alkali pr
4、otease Bacillus subtilis 168, was cloned and expressed in industrial ethanol yeast by means of many expressing techniques. In this experiment,we used the signal peptide secretion and wine yeast surface display technology as well as wine yeast independent copy and homologous recombination of the two
5、different ways to expresse the Apr E gene.We obtained four recombinant strains S.C.pMD1 （pMD-PGK1-factor-AG1）,S.C.pYX1（PYX212-KAN-factor-AG1）、S.C.PMD2 （PMD-PGK1-factor）、S.C.PYX2 （PYX212-KAN-factor）.In the experiment of the activity of alkaline protease , the recombinant strains express a certain amo
6、unt of enzymatic activity. And S.C.pMD1 and S.C.pYX1 have higher enzymatic activity than S.C.PMD2 and S.C.PYX2 . For the time being, not yet to analysis the activity that signal peptide secretion expression and surface display express .Keywords: Alkali protease; Wine yeast; recombinant plasmid;surfa
7、ce display systems第1章 绪论1.1 碱性蛋白酶与酒精发酵碱性蛋白酶（ alkaline protease） 是一类在碱性pH范围具有活性和稳定性的酶类, 最早发现于猪胰脏中。它是一类非常重要的工业用酶，在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途1。近年来，随着高浓酿造技术的发展，碱性蛋白酶在发酵工程中的作用以及在酿酒酵母生长和发酵酒精方面越来越受到重视9。淀粉质原料是目前发酵生产酒精的主要原料，含有一定浓度的蛋白质。在酒精发酵过程中加入的糖化酶虽具有较高的糖化能力，但它不具有蛋白酶活力，而目前用于生产酒精的酿酒酵母又没有外分泌蛋白酶，糖化醪中的可溶性蛋白又无法进入酵母细胞，所
8、以在酒精发酵过程中，酿酒酵母无法充分利用这部分的原料，造成了发酵液中氮源的极大浪费。 在现实的酒精发酵生产中，往往需要添加硫酸铵、尿素等无机氮源。研究表明，虽然添加无机氮源可以为酵母提供可吸收性氮，加强氨基酸等物质的合成，有效促进酵母的新陈代谢和生长繁殖，提高产酒精速率，但由于无机氮源并不能减少菌体用于合成氨基酸所需要的碳源，也不能降低糖代谢的能耗，因此并不能增加酒精的产量。相比之下，碱性蛋白酶可以对原料中蛋白质进行有效的降解，提高醪液中氨基酸的含量。酵母菌则可以直接利用醪液中的氨基酸合成其他必需氨基酸和蛋白质，加快酵母菌的生长繁殖，减少了合成代谢的能耗，提高酒精产率9。1.2 酿酒酵母表达系
9、统酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型（即游离型）和整合型两种。自主复制型质粒通常有30个或更多的拷贝，含有自动复制序列（automaticreplicating sequence，ARS），能够独立于酵母染色体外进行复制，如果没有选择压力，这些质粒往往不稳定。整合型质粒不含ARS，必需整合到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数很低15。酵母的rDNA基因序列是提高外源基因拷贝数的最佳整合位点之一。早在1989年Lopes等就构建了以rDNA为整合位点的质粒pMIRY2，大大提高了外源基因的稳定性和拷贝数，研究者还对这类质粒的高拷贝数整合的机制进行了研究。
10、，人们设计了pMIRY2质粒，旨在将目的基因靶向整合到rDNA簇上（rDNA簇为酵母基因组中串联存在的150个重复序列），因此利用pMIRY2质粒可以得到100个以上的拷贝9。1.2.1 酿酒酵母的游离型表达游离型表达即常见的质粒表达，如2质粒。此类载体可以自主复制，但需要在选择压力存在下以维持其在酵母细胞中的拷贝数，所以容易丢失，难以实现外源基因的稳定高效表达。ARS为酵母菌中的自主复制序列，大小在0.8-1.5Kb,染色体上每30-40bp就有一个ARS元件。由染色体ARS构成的质粒称为Yrp，而由2质粒构建的杂合质粒为Yep9。1.2.2 酿酒酵母的整合型表达 在以2质粒为基础的自主复制
11、质粒在多倍体和二倍体菌株中的稳定性高于单倍体，但他们在非选择条件下被认为是不稳定的7。一般的，可利用无酵母复制起点的但含有与酵母基因组某些序列同源的DNA序列的载体来进行整合。通过重组，同源序列整入酿酒酵母染色体相应位点。在转化前，在酵母来源的序列区域将载体线性化可提高整合率。由于整合会破坏染色体上的位点，基因通常会插入非必要位点如 rRNA 位点（在基因组上有一百个以上的拷贝）。但整合到必需位点如LEV2，ILV2 或 PGK1 或 ADC1，因为菌株的染色体组的多拷贝是他们的等位基因仍保持完整15。 整合是有益的，不仅因为整合DNA的稳定性而且因为通过整合可以获得隐含少量外源DNA的菌株。
12、通常使用的载体含有在 E.coli 中扩增所需的细菌序列。在酵母表达系统中，一般采用 YIp 型载体进行整合。这是一种整合型载体。它不含酵母的 DNA 复制起始区，因此不能在酵母中自主复制；但它可以与酵母染色体进行同源重组，以低频率整合到酵母细胞染色体上。整合位点取决于载体中的互补基因序列数。这种同源重组的过程主要有两种形式：单交换整合与双交换整合。酵母整合型载体因其转化子的高度稳定性被广泛应用。但它也有不足之处，转化率低、整合拷贝数很少，因而酿酒酵母转化子对外源基因的表达量相对较低。用在酵母染色体上以多拷贝形式存在的DNA 片段，如：rDNA、Ty序列等作为整合介导序列构建载体，就可以大大提
13、高整合的拷贝数和外源基因的表达水平。这类整合载体被称为YMIp 型载体16。为获得有效表达，外源基因必须在酵母调控序列的启动子和终止子控制下，转化的选择性标记为非酵母来源的，也必须如此。在某些情况下，为获得更有效的表达或其表达需受新的方式调控，可以用另一酵母启动子来代替该同源启动子。最有效的启动子一部分来自酵母糖酵解途径的酶，如编码磷酸甘油酸激酶的 PGK1 基因、编码烯醇化酶的ENO1 基因和编码醇脱氢酶的ADC1 基因等。这些调控序列使构建能增强和调控同源或医院基因表达新菌株的方法更多样化16。1.2.3酿酒酵母信号肽分泌酵母本身分泌的内源蛋白质较少，利用信号肽序列引导外源蛋白质的分泌可简
14、便纯化步骤。但是信号肽对外源蛋白的分泌也会产生影响。信号肽是存在于分泌蛋白质N末端的特异氨基酸序列，引导新生肽穿越原核生物的质膜和真核生物的内质网膜，并使其转移到细胞的靶部位。完成该过程信号肽就被信号肽酶降解，因此成熟蛋白质的N端并无信号肽序列。信号肽由1040个氨基酸残基组成，分为3个区段。N端为带正电荷的氨基酸，如赖氨酸和精氨酸，称为碱性氨基末端；中间段为由20个氨基酸（以中性氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸为主）组成的疏水核心区，形成L螺旋结构；C端又称为加工区，由极性、小分子氨基酸如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，为信号肽酶（signal pepfidase）的裂解部位。一般认为疏水区长度越长、疏
15、水性越强的蛋白质其分泌效率越高，因此疏水区的长度和疏水性对蛋白分泌十分重要。在新生肽链中，除N端有信号肽外，C端一些肽段也对肽链穿越粗面内质网膜有作用，可以终止肽链穿越，因此该部分肽段被称为终止转运序列，在某种意义上也是一种信号肽。如果该肽段完全或部分缺失将严重削弱酶在内质网膜上的集合装配，影响酶的正常功能14。酵母信号肽有a因子信号肽（mating factoml，MFal），酸性磷酸脂酶（phosphatasel，PH01），蔗糖酶（sucrase2，SUC2）和 Killer 毒素等中的内源性信号肽，其中以a因子信号肽应用最广。a因子信号肽来源于啤酒酵母，其结构中起主要作用的是前导肽和间
16、隔肽；前导肽由83个氨基酸残基组成，间隔肽为 Lys-Ars（Glu-Ala）1-2 或 Lys-ArgGlu-AlaAsp-Ala氨基酸序列。前导肽和间隔肽对蛋白的正确切割和分泌至关重要，有时由于上述两种基因产物的切割活力不同，会在外源蛋白的N 端产生不同的切割位点，使一些蛋白在分泌中会在N端带有 （Glu-Ala）1-2 融合序列，即产生所谓的酵母信号肽切割不完全现象。其中最常用的a因子信号肽有 Ppic9k,Ppicz ,pGAPZ系列。本实验用的a因子信号肽为 Ppic9k。a因子信号肽，它可以引导小分子质量蛋白的分泌，但是对一些分子质量较大的外源蛋白作用不明显。且如果对信号肽本身进行
17、适当改造，也将会显著提高外源蛋白的表达量14。1.2.4 酿酒酵母表面呈现技术酿酒酵母细胞壁厚约200 nm，主要由外层的甘露糖蛋白和内层的葡聚糖骨架组成，两者通过共价健相连。目前已报道的酿酒酵母表面展示系统有2类，分别以或a-凝集素为融合骨架。它们都是通过 或a-凝集素基因与目的蛋白共同连接在表达载体上，转入细胞从而实现外源基因的锚定表达5。-凝集素由AG1 基因编码的650个氨基酸组成；a-凝集素由AGA1 基因编码的核心亚基和AGA2 基因编码的结合亚基以二硫键连接组成。-凝集素和a-凝集素均以O-糖基化的形式存在，其核心亚基包括分泌信号区、活性区、富含Ser/Thr 的支撑区和糖基磷脂
18、酰肌醇（GPI）锚定蛋白附着信号区5。内层的葡聚糖是维持细胞壁强度的主要物质。外层甘露糖蛋白有两种类型，一种足通过共价健与酵母细胞松散相连并能被 SDS 提取出来的低分子量蛋白；另一种是必须被葡聚糖酶解细胞壁的-1，3-和-l，6-葡聚糖层后才能被 SDS 抽提的高分子量蛋白，包括凝集素、絮凝素等。后者的结构中大多都含有GPI锚定区域。GPI锚定区域与细胞蛋白的C-端共价相连，为蛋白与细胞膜提供稳定的连接6。在凝集素的定位过程中，合成的前体蛋白首先通过其疏水的羧基端序列吸附到内质网膜上，随后疏水的羧基端被糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定序列所替换，该锚定蛋白被运输到质膜并与质膜相连。最后，在特异性
19、磷脂酰肌醇磷脂酶的作用下，锚定蛋白被释放并运送至细胞壁最外层，与葡聚糖连接而完成附着6。1.3 本课题的研究目的与意义酒精是目前世界上产量最大的发酵产品之一，酒精产量的提高，能有效的帮助社会改善能源的利用率以及空气中环境污染的严重。然而目前用于酒精生产的酿酒酵母无外分泌蛋白酶，传统的糖化酶虽然具有高糖化力的特性，但该酶不具有蛋白酶活力，无法有效利用原料中的蛋白质，提供氮源，这就造成了原料的极大浪费，降低了原料的利用率。就成本而言，酒精发酵过程中就必须添加一定的酵母可利用的无机氮源，增加了成本的浪费。在同步糖化发酵过程中，由于蛋白酶对原料颗粒具有溶解作用，可以促进淀粉酶的糖化作用。碱性蛋白酶对蛋
20、白质的降解会增加醪液中的游离氨基酸，酵母菌可以直接利用这些氨基酸合成菌体，从而促进酵母菌生长繁殖，提高酒精发酵速率和原料的出酒率。因此，使酵母具有分解外源蛋白质的能力是最为经济和简便的提高原料利用率的方式。利用基因工程及代谢工程技术对酿酒酵母进行改造，可提高菌种的发酵性能，降低酒精的生产成本。1.4 本课题的研究内容本课题以枯草芽孢杆菌中的碱性蛋白酶的基因作为目的基因，以PCR的方式获取碱性蛋白酶基因序列，以pPIC9K 质粒作为信号肽的供载体，将碱性蛋白酶基因和信号肽以及展示蛋白基因转入大肠杆菌感受态中，再将大肠杆菌重组质粒通过电转和醋酸锂转化的方法将大肠杆菌重组质粒转入酿酒酵母细胞中。最终
21、使转化酿酒酵母以信号肽和细胞表面呈现的方式分泌出蛋白酶并呈现酶活。第2章 材料与方法2.1 材料2.1.1 菌株与质粒工业酒精酵母 （S. cerevisiae CICIMY0086），E. coli JM109 recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thi （Lac-proAB） FtraD36 proAB+ lacIq lacZM15，枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis168，经过师兄、师姐们的改良），质粒pPIC9K、PYX212保藏于江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心（http:/cicim-2.1.2 工具酶和试剂氨苄青霉
22、素（Amp）、卡那霉素（Kan）上海生工生物工程公司Taq DNA聚合酶、Rnase、限制性内切酶、T4 DNA连接酶Fermentas公司G418Sigma公司质粒提取试剂盒美国Axygen公司PCR产物纯化试剂盒Pfu，EX-Taq高保真DNA聚合酶宝生物工程有限公司Yeast Extract、TryptoneOXOID公司其他试剂药品国产或进口分析纯2.1.3 引物Primer namesSequence （5-3） Restriction sits are italic/underlinedRestriction sitesBSapr1TAGGAATTCAGGAGAGGGTAAAGAA
23、TGAGAAGCEcoRIBSapr2AATGTCGACCAGGTATGGAGGAACCTGCTTSalIAG1ACGCGTCGACGCTAGCGCCAAAAGCTCAG2CGCGTCGACTTAGAATAGCAGGTACGACAAAAAG3CGCGATATCTTAGAATAGCAGGTACGACAAAAEcoRV-factor1CGCGGATCCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGBamHI-factor 2CCGGAATTCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTG-factor3TAGGGAATTCTACGTAAGCTTCA（自身带的两个酶切位点）HindIIIKa
24、n 1GGGGTACCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGCCCAGTAGTAGGTTGAGGKan 2GGGGTACCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATT-TGAAGTCGGACAGTGAGT2.1.4 酿酒酵母染色体提取试剂山梨醇（1 mol/L）-0.1 mol/L EDTA（PH 7.5）缓冲液、蜗牛酶（30 mg/mL）、50 mmol/L Tris-HCL（PH 7.4）-20 mol/L Na2EDTA溶液、10% SDS（十二烷基磺酸钠）、5 mol/L 醋酸钾、无水异丙醇、TE 缓冲液（PH 7.4）、Rna
25、se2.1.5 枯草芽孢杆菌染色体提取试剂溶菌酶（10 mg/mL）、蛋白酶（20 mg/mL）、20% SDS、酚和氯仿、醋酸钾2.1.6 pPIC9K、PYX212-Kan质粒提取试剂溶液I：ddH2O，Rnase；溶液II：1% SDS，0.2 mol/L NaOH；溶液III：乙酸 11.5 mL，5 mol/L醋酸钾 60 mL，ddH2O 28.5 mL；RNA酶溶液：称取5 mg 的RNA 酶，于1 mL无菌水中充分溶解，90 C水浴10 min，缓慢冷却，于-20 C保藏。2.1.7 测定碱性蛋白酶活试剂（1）作用底物：1 %酪蛋白溶液，称取1 g酪蛋白溶于100 mL pH
26、3.0的硼酸-氢氧化钠缓冲液中，用前配制；（2）0.4 mol/L的三氯乙酸溶液；（3）0.4 mol/L的碳酸钠溶液；（4）福林试剂：与2 L磨口回流装置内，加入100 g钨酸钠， 25 g钼酸钠，700 mL 去离子水，50 mL 85 %磷酸，100 mL浓盐酸，文火回流10 h后，加入150 g硫酸锂， 50mL去离子水，混匀后加入几滴液溴，煮沸15 min，冷却后，定容至1, 000 mL，最后用细口漏斗45号过滤，置于棕色瓶中保存。使用时加2倍去离子水稀释，即为福林工作液；（5）pH 11硼砂溶液-氢氧化钠缓冲溶液：甲液（0.05mol/L硼砂溶液）：取硼砂（Na2B4O710H2
27、O）19 g，用蒸馏水溶解并定容至1,000 mL。乙液：0.2 mol/L氢氧化钠溶液。将乙液加一倍水后与等量的甲液混合；（6）100 g/mL 酪氨酸溶液：精确称取0.1 g在105 C烘箱中烘至恒重的酪氨酸，加入适量的0.1 mol/L 盐酸溶液，使之溶解，加去离子水定容至1,000 mL，即配成100 g/mL酪氨酸溶液，-4 C保存。2.1.8 培养基和培养条件重组质粒构建过程中均采用 LB 液体培养基（Tryptone 10 g/L，Yeast Extract 5 g/L，NaCl 10 g/L），LB固体培养基需另加1.5 %的琼脂粉。培养温度37 C; 氨苄青霉素、卡那霉素在培
28、养基中的工作浓度分别为100 g/mL、30 g/mL; 酵母培养采用 YEPD 培养基（Tryptone 20 g/L，Yeast Extract10 g/L，葡萄糖 20 g/L）。必要时加入G418用于转化子的筛选，终浓度为350 g/mL。培养温度为30 枯草芽孢杆菌培养用 LB 培养基，在37 C下培养。2.1.9 醋酸锂转化法试剂TE（pH 8.0）、1.0 mol/L 醋酸锂溶液、0.1 mol/L 醋酸锂溶液（1 体积 10 TE，1 体积 10 1.0 mol/L 醋酸锂溶液、8 体积无菌超纯水）2.1.10 主要仪器和设备电热恒温水浴锅上海医用恒温设备厂迴转式恒温调速摇瓶柜
29、上海欣蕊自动化设备有限公司隔水式电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂生化培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂，型号BSP-100FreeZone 4.5L冷冻干燥机美国Labconco 公司UV2100 紫外可见分光光度计美国UNICO 公司超净工作台苏净集团安泰公司荧光显微镜日本Nikon eclipse 50ipH计德国WTW公司，型号pH537超声波细胞破碎仪美国Sonics公司，型号VC750电子分析天平瑞士梅特勒-托利多公司产品，型号AL104PCR仪BIO-RAD公司产品琼脂糖凝胶水平电泳系统北京六一厂产品凝胶成像系统美国Alpha Innotech公司产品电击转化系统BTX HARVARD APPARATUS，型号ECM399台式高速离心机美国Sigma公司产品
