1、硅化玻片（载片、盖片均可）。【方法2】将经过洗净的玻璃盖片分散开放在一金属网中，并将该网放入一接有真空泵的干燥器中。同时，在干燥器中放一盛有约1m二甲二氯硅浣（dimethyldiorosilane,DMDC）的小烧杯。盖好干燥器（确保密闭），抽真空约5min，然后让空气冲入。取出盛有盖片的金属网架，用锡箔纸包埋，于250以上烘烤4h以上，最好过夜。冷却后备用。本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于60烧干。【方法3】APES（氨丙基三乙氧基硅浣）法【方法4】（1）49ml氯仿与1mg二甲二氯硅浣（DMDC）配液；（2）倒入每个拟硅化的试管或离心管中，浸泡5min后用乙醇或重蒸水冲洗；
2、（3）玻璃器皿使用前位于180以上烘烤2h以上，塑料器皿应于60烘烤过夜。DMDC有毒且高度挥发，应于通风环境操作并戴口罩、手套，避免接触皮肤或吸入。（四）载片的包被（粘贴）沾附剂（1）多聚赖氨酸（poly-L-Lycine,PLL）储备液（05%）按上述剂量充分混合，即为浓度为5mg/ml（0.5%）的PLL液。常分装成1ml的包装，-20存放。该液为储备液，可反复冻融，无明显影响。用前充分混合。工作液（0.01%）：充分混合，静止待气泡消失。（2）明胶液配法：先称取明胶溶于500800ml DEPC水中，加热搅拌助溶，待明胶完全溶解以后，加入甲明矾溶解后即可使用。注意，包被玻片时，明胶液温
3、度最好保持在60左右，效果最佳。方法同PLL包被玻片。2多聚赖氨酸包被玻片的制备方法（其它包被剂相同）（1）将事先准备好的经160以上烘烤，并冷却至室温的玻片（载片或盖片），在0.05%（也有用0.1%）的PLL液中上下浸蘸几下，分散开竖放在架子上，于空气中自然干燥，4备用。注意：浸蘸时，务必使整个玻片完全浸于液体中，否则，包被不完全会产生标本脱落现象；干燥过程中注意避免尘埃污染；按上法处理的玻片通常可存放在一定时间（室温1月以上，4更长），但仍建议尽早使用。（2）多聚赖氨酸1mg溶于10ml灭菌的去离子水或1mmol/L的Tris-HCl缓冲液中（pH7.0），将其涂布于玻片上，待干燥后即可
4、使用。该法包被的玻片可用于细胞涂片和切片。（3）将PLL工作液滴至盖玻片上5l/片，用另一盖玻片以推血涂片方法推片，或用另一盖玻片紧贴于其上，相互磨擦以使两盖玻片相对的一面涂布上PLL。该法制备的玻片，只有一面是包被有PLL，故制备时，待其晾干后，应作好记号，然后保存后备用。多聚赖氨酸可用于多种核酸杂交，方法简单，结果可靠，有许多其它方法不可比拟的优点。配制好的液体可存放于4或室温，但时间过长会解聚而失效，故建议使用时尽量新鲜配制。（4）Vectabond粘附剂该试剂是Vector公司新近推出的一种新型粘附剂。它与其它粘附剂的主要区别是：一般的粘附剂是通过物理性覆盖在玻片表面，天长日久，可能由
5、于包被不完全或局部脱落而致切片等标本易于脱落。而Vectabond试剂是通过化学性作用，改变玻璃表面的分子结构，使标本贴附牢固，不易脱落，且保持时间长久，耗量小，价格便宜，一个包装7ml可配成350ml工作液使用。操作程序：标本（铺片、切片等）丙酮（5min）Vectabond试剂工作液（5min）dH2O（25min）干燥（温箱，数小时过夜）用铝箔包好，室温备用。制备和保存过程中避免污染。经上述处理的载玻片一般可存放半年以上（4可更长）。（五）硅鱼精子DNA的制备（1）在50ml灭菌聚乙烯管中加入1g鲑精DNA，加入15ml DEPC水使其浸泡5min至2h；（2）加入2.5ml 2mol/
6、L HCl，室温放置，DNA形成白色沉淀，充分振摇至沉淀物相互缠绕在一起，用吸头尖端使之形成一球团状（23min）；（3）加入5.0ml 2mol/L的NaOH。摇动小管使DNA悬浮、溶解，将小管置5015min助溶；（4）用DEPC水将混合物稀释至175ml（总体积），充分混合，注意确保管内已无颗粒状；（5）加入20ml/l 1mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH7.4）；（6）用2mol/L的HCl滴定至DNA溶解pH为7.07.5；（7）用无菌微孔滤膜过滤液体，去除颗粒。260nm测定溶液的OD值，方法是：取20l DNA液混合于980l水中，混匀后测定，吸收值乘以50即为DNA浓度
7、（g/ml）；（8）制备好的DNA液储于-20备用，用前取出冻融后煮沸。二、关于探针的标记（一）cRNA探针的同位素标记1标记液（转录标记）2转录缓冲液：用地高辛或生物素标记时，用UTP替代。3标记终止液4标记探针水解液先用dH2O悬浮探针，再加入后两种试剂，轻轻振摇混合，于60条件下反应。5探针水解时间注：LO探针初始长度（kb）Lf探针的终长度（kb）K0.11kb/min6探针水解终止液每次加入充分混合，临用前配。7探针沉淀液每次加入，充分混合，新鲜配制。（二）寡聚核苷酸3端标记（cRNA探针）1标记反应液2终止液：0.2mol/L EDTA3.探针沉淀液（三）cRNA探针非同位素标记（
8、地高辛及生物素）1标记液：生物素标记时为10mmol/L的生物素-11-UTP为检测标记率而加。2转录标记终止液（1）0.2mol/L EDTA：用于地高辛标记法（2）生物素标记终止液：（四）DNA探针标记常用试剂的配制（1）10 缺口平移缓冲液：200mmol/l Tris-HCl,pH7.4含50mmol/L MgCl2;100mmol/L-巯基乙醇、1mg/ml BSA。（2）缺口平移反应终止液：200mmol/L NaCl;10mmol/l Tris-HCl,pH7.4; 11mmol/L EDTA; 0.5% SDS。（3）DNase:干粉状DNase（20003000u/mg）溶于
9、20mmol/l Tris-HCl, pH7.5中（1mg/ml）,10l分装，-20保存一年。（4）10DNA聚合酶（Klenow片段）缓冲液：500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/L DTT;0.5mg BSA。（5）10激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl2;20mmol/L DTT; 1.0mmol/L亚精胺。（6）10随机引物标记缓冲液；100mmol/L MgCl2;10mmol/L -巯基乙醇；500g/ml BSA。（7）1加尾缓冲液：100mmol/L二甲胂化钾，pH
10、7.0,1mmol/l CoCl2 0.2mmol/L DTT。（8）1mol/L MgCl2:MgCl2 47.60g溶于500ml水中，100ml分装，高压灭菌，室温保存。（9）0.25mol/L EDTA（Ph8.0）:EDTA 52.02g溶于400ml水中，调pH至8.0，加水至500ml，100ml分装，高压灭菌，室温保存。（10）4mol/L醋酸钠：取无水醋酸钠82g溶于200ml水中，用醋酸调pH至6.5，加水至250ml，高压灭菌，或0.45m膜过滤，室温保存。（11）10% SDS：10g SDS（十二烷基硫酸钠）溶于50ml水中，加水至100ml，分装后室温保存。（12）
11、20SSC：取NaCl 175.3g;柠檬酸钠88.2g;加水至1000ml，用10mol/l NaOH调pH至7.0；高压灭菌，室温保存。（13）无菌水：100ml去离子水或双蒸水，分装，高压灭菌，室温保存，开瓶后仅限一周使用。（14）10500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;50mmol/l DTT;10mmol/L亚精胺（非必需）。（15）T4多聚核苷酸激酶：10u/l，保存在甘油中，-20。（16）TE缓冲液（Tris/EDTA）：Tris,10mmol/l pH7.4（0.5ml 2mol/L贮存液），1.0mmol/l EDTA,pH8.0（20l 0.5mol/L）贮
12、存液，加水至100ml，室温保存。（17）2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g溶于850ml，加浓HCl 75ml ,边加边缓慢搅动，至pH7.4,于加水至1000ml。（18）1mol/L DTT（二硫苏糖醇）：3.0g DTT溶于20ml水中，分装，于-20贮存。（19）0.5mol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）：在烧杯中先加入300ml水，加入93.5g EDTANa22H2O,充分混匀，加10mol/l NaOH调pH至8.0,加水至500ml。（20）10mol/L NaOH：200g NaOH溶于450ml水中，混匀，再加水至500ml。（21）5
13、mol/L NaCl：292.25g NaCl,加水至1000ml。（22）1mol/L HCl：加86.2ml浓盐酸至913.8ml水中。（23）1mol/L CaCl2：147g CaCl2：2H2O,溶于1000ml水中,高压灭菌,室温保存。三、固定剂进行原位杂交的组织或细胞标本常需经固定处理。尽管许多化学物质对组织/细胞有固定作用，但核酸原位杂交的理想固定液应具备如下特点：能很好地保持组织细胞的状态；对核酸无抽提、修饰及降解作用；不改变被检核酸分子在组织细胞内的定位；对核酸及探针的杂交过程无阻碍作用；固定液本身对杂交信号无遮蔽、掩盖作用，如不使本底增加等；理化性质稳定、价格低廉。14%
14、多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA）称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至6065，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml 2PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4保存备用。配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因PFA有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用；加热时，温度不宜过高，常为6065，否则，PFA降解失效；配制好的PFA虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下
15、降，建议尽早使用。固定液用PBS的配制：按上述比例称取试剂，溶于DEPC水（也可用蒸馏水加DEPC）500800ml中，过滤后，加水定容至1000ml，高压灭菌。通常配制成10PBS的储备液，2PBS和1PBS可用DEPC水稀释获得。除用DEPC水配制PFA外，也有用灭菌蒸馏水或经DEPC处理的0.010.1mol/L的PBS配制的，方法及注意事项同上。4% PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保持组织及细胞内的RNA，同时对形态保持也较好。通常组织块固定412h，载片固定时间在1015min以内，RNA含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影
16、响探针的穿透力，降低杂交效率。2甲醛10%甲醛（Formaldehyde,FA）量取二者充分混合而可。较适于检测RNA的组织及细胞固定，也可用于新鲜冰片切片后固定。10%福尔马林试剂：较适于固定细胞。10%中性福尔马林市售甲醛100mlNa2HPO44gNaH2PO46.5gDEPC水1000ml常用于石蜡样品切片的固定。10%的甲醛由于有促进DNA双链分子交联的作用，干扰DNA变性，故不适于DNA杂交。在组织或细胞原位杂交中，可通过使用含50%甲酰胺的杂交液使DNA变性解链而解决。这类固定液在DNA/RNA杂交中有较好的效果。34%戊二醛效果较40%差。40.1%戊二醛常用于固定组织，适于新
17、鲜组织冰冻切片及石蜡切片的后固定，常用于检测DNA的原位组织杂交方法。5乙醇/醋酸（或冰醋酸）将乙醇与醋酸按3：1的体积比充分混合即可。该液较适于固定细胞的原位杂交，尤其检测DNA时。乙醇/醋酸虽广泛应用于原位杂交中，但RNA保留较差，可本底很低，即背景染色淡。6甲醇/醋酸（3：1）用前按体积比3：1比例充分混合即可。7甲醇/丙酮（1：1）适于培养细胞的原位杂交技术。84%多聚甲醇-0.5%1%戊二醛溶液在pH7.4磷酸缓冲液中，用于免疫电镜样品固定。四、LB培养基（一）液体LB培养基（Luria-Bertani培养基）取一1000ml的烧杯，将事先称取好的试剂加入杯内，加H2O约500800
18、ml搅拌使其溶解完全。用5N的NaOH调pH至7.0,加入H2O定容至1000ml。15磅高压灭20min。（二）琼脂糖平板培养基细菌培养用琼脂（或琼脂糖）15g液体培养基（如LB）1000ml按浓度比例，将琼脂加入液体培养基（如LB）中，稍加搅拌，用纱布或纸封好瓶口，15磅高压灭菌20min。五、小量质粒提取主要液体1溶液2溶液3溶液（3mol/L醋酸钠）加热溶解后，再用冰醋酸（约40ml）调pH至4.8，补足H2O至200ml。六、杂交前处理1蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K） 蛋白酶K主要用于杂交前标本处理，其作用是使组织达到一定消化，利于检测分子的穿透，从而提高检测方法的
19、敏感性，但各种组织在不同条件下消化程度不一，因此，具体应用时，应根据组织种类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏，核酸分子也会受到影响。通常是将其配成储备液（1mg/ml），临用前，再配成工作液（约0.025mg/ml）。配制方法：精心称药，将二者充分混合后，分装成小份，-20存放，用时再取出冻融，余者弃去。（2）工作液（临用前配）：取储备液（1mg/ml）按1：40稀释，充分混合，即得约含Pro.K为25mg/ml的工作液。（3）关于P-K缓冲液的配制：称取上述试剂，充分混合即可。1mol/L 的Tris-HCl（pH8.0）：先将Tris于800ml ddH2
20、O中溶解，用HCl将pH调至8.0,ddH2O定溶于1000ml，高压灭菌，室温备用即可。0.5mol/L的EDTA：称取EDTA溶于约600ml ddH2O中，常需60持续搅拌以助溶，滴加NaOH至pH接近8.0时，EDTA才开始溶解。待完全溶解后，冷却至室温，NaOH调pH至8.0,ddH2O定溶至1000ml，高压灭菌，室温备用。2甘氨酸（1）1mol/L甘氨酸：称取甘氨酸75g溶于ddH2O或DEPC水中，最后补足ddH2O定容至1000ml，高压灭菌备用。该液为储备液，-20储存。（2）甘氨酸工作液（0.1mol/L）：将二者按1：10比例稀释，即得甘氨酸工作液。一般要求临用前新鲜配
21、制。甘氨酸有终止蛋白酶K作用的作用，以防过度消化。30.25%醋酸-0.25%醋酸酐按上述配方，先以少许DEPC水溶解NaCl，然后加入三乙醇胺及浓HCl。DEPC水定容至约1000ml（997.5ml），临用前，一边摇动溶液一边加入醋酸酐，充分混合。注意操作时避免浓HCl 溅出，最好在通风条件下进行。生物体内有些组织，如神经组织中的蛋白质，对带负电荷的核酸探针较易吸附。经该液乙酰化处理后，可使切片标本表现带上负电荷，有排斥带负电的核酸探针，减少非特异吸附，降低反应背景的作用。4RNA酶溶液取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中，分装成小份（1ml,10mg/ml），-20储存。临用前，取
22、RNA酶A储备液，用2SSC溶解配成工作液（0.01mg/ml）.5.0.2%取2ml Triton X-100加入998ml PBS中，充分振荡使其充分混合。七、杂交用液1SSC（Standard Saline Citrate, SSC）通常配成10，20，50的储备液，如下：先称取上述两种试剂，溶于约800ml ddH2O中，滴加10N的NaOH，将pH值调至7.0，补足ddH2O至1000ml，加入终浓度为0.1%0.2%的DEPC，分装后高压灭菌，可室温保存。该液主要用于配制予杂交液及杂交后的各种洗脱液，以保持一定的离子强度。此外，在用于杂交的湿盒内也常用5的SSC以保持一定湿度。2D
23、enhardts液或100的储备液称取上述试剂，溶于800ml左右灭菌ddH2O中，定容至1000ml后，过滤后于-20保存备用。该液用于配制杂交液及予杂交液等。3杂交液及予杂交液临用前加；予杂交液不加先以去离子甲酰胺与SSC于室温混合，加入硫酸葡聚糖于50促溶，依次加入其它成份。硫酸葡聚糖在室温常需数小时才能完全溶解。有时需旋涡振荡。定容后充分混合。根据使用方便可分装（最好用铝箔将瓶子包好）存于4，可达数月。注意，杂交缓冲液在使用前切忌污染。变性被打断的无关DNA（常为鲑精DNA或鲱精DNA）可在予杂交及杂交前加入。此外，有许多物质如肝素、多聚腺甘酸、醋酸钠等多种成份，可根据需要加入杂交液中
24、，上述配方所列只是不可缺少的基本成份。配制好的杂交液不宜反复冻融，否则易产生硫酸葡聚糖沉淀现象。使用前最好加热至50，使其充分溶解后再加入探针分子。至于探针的浓度视实验目的、探针类型及标记方法而异。通常RNA探针分子浓度为0.52g/ml，DNA探针浓度为1g/ml,此外，如使用35S标记的探针，还需加入终浓度为100mmol/L的二硫苏糖醇（Dithiothreitol,DTT）至杂交液及杂交后的洗脱液中。八、杂交后漂洗溶液无论用何种标记方法及何种信号显示方法，在杂交后洗脱则是大同小异。在此，归纳几种带有共同性及常用的洗脱液。该液常用于杂交后的初次洗脱，故离子强度（张力）较高。该液常用于杂交
25、后的第二次洗脱，离子强度较低，经过上述两套洗脱液洗后，有的还可用2SSC，10%（0.1%）SDS洗脱。主要是洗去残留的RNA，降低背景。用于以RNA为探针的原位杂交方法中。4Dig标记探针杂交后处理液用ddH2O溶液并定容至1000ml。用ddH2O溶解并定容至1000ml。配制同上。左旋咪唑有消除内源性磷酸酶的作用。九、原位杂交信号显示目前应用原位杂交方法中，信号的显示主要有放射自显影，酶底物及免疫金银等方法，在此归纳有关的主要试剂。1A-B显影液称取上述试剂，按配方分别溶于50ml ddH2O中，于显影前，在室温将两者（A液及B液）按1：1混合，稍加摇动促进混合，即可将贴有切片标本的切片
26、放入显影液，于室温避光（可暗室）反应515min。显影时间和温度相关，需自己根据情况摸索。终止反应只需将显影液倒出，自来水冲洗即可。倒出的AB显影液可暂时不扔，光镜下观察，若明显显影不够，还可重新或继续显影。AB显影液要求临用前配制，在显影时才将AB二液混合。否则，A液过久会产生黄色沉淀，增加背景。AB液用于免疫金银法中，使金标记颗粒信号放大，形成棕黑色沉淀。2DAB-H2O显色液配制方法见附录一。该液用于标本被标记上辣根过氧化物酶（HRP）的方法。产物为棕黄色。3NBT-BCIP显色液配制方法，详见附录一。该液用于有碱性磷酸酶标记物的方法中。产物为紫蓝色。4Kodak D-19显影液先将500ml水中加温50，按上述配方顺序加药，同时充分搅拌，每加一种药完全溶解后，再加另一
