1、总体积 15 L 注：如果有必要，可用1 L nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。（10）将反响体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。可用酶切或测序进展检测。2 质粒转化酵母细胞，生成Bait-Reporter酵母菌株图图3 Bait-Reporter酵母菌株生成原理示意图（1）用BstB I或者Bbs I酶切2 L pBait-AbAi，pMutant-AbAi，p53-AbAi质粒，使其在URA3基因处断开，纯化酶切产物。（2）按Matchmaker Yeast Transformation System2的步骤用1 l酶切后的质粒转化
2、Y1HGold酵母。（3）稀释每个转化体系至1/10、1/100、1/1000，分别取每个稀释物均匀涂于SD/-Ura琼脂平板上。3 d后挑取5个单克隆，用Matchmaker Insert Check PCR Mix1进展PCR检测阳性克隆，用Y1HGold的单克隆做阴性对照。（4）在PCR管中加25 l PCR-grade H2O。（5）用干净的枪头轻轻接触酵母单克隆，以获得非常少量的酵母细胞。将枪头伸进PCR-grade H2O中搅拌，使酵母细胞散开。切忌挑取整个酵母单克隆，因为细胞过多会阻止PCR反响的进展。如果参加细胞后水变浑浊，证明参加了过多的酵母细胞。（6）向每个管中参加25 l
3、 Matchmaker Insert Check PCR Mix，混匀，离心。每个PCR管中现已含有如下反响物：Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 lH2O/yeast 25 l总体积 50 l（7）按下述程序进展PCR反响；95C 1 min98C 10 s55C30 s 30 cycles68C 2 min（8）取5 l PCR产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳分析。引物与AbA基因以及URA3下游的Y1HGold基因组结合，扩增片段长约1.4 kb。图4 PCR检测pBait-AbAi的插入情况正确的PCR检测结果应是：阳性对照：1.4 kb阴性对照：无条带诱
4、饵菌株：1.35 kb+insert size（9）分别挑取PCR检测呈阳性的诱饵克隆和p53-AbAi对照克隆，在SD/-Ura平板上划线培养。30C孵育3 d后，将平板置于4C保存，即为新构建的Y1HGoldBait/AbAi菌株和p53/AbAi对照菌株。（10）经过长期放置后，挑取单克隆在YPDA液体培养基中过夜培养，离心收集菌体，用 1 mL预冷培养基100 ml灭菌的YPDA与50 ml灭菌的75%甘油混合重悬菌体，速冻后与-70C保存。3 检测诱饵菌株AbAr基因的表达在不存在捕获物的情况下，由于克隆到pAbAi载体中的诱饵序列不同，诱饵菌株报告基因的本底表达水平也不一样。例如：
5、p53-AbAi对照的最低aureobasidin A抑制浓度为100 ng/ml。酵母单杂交实验成功的前提是没有源转录因子能够与目的序列结合或者结合能力非常弱。因此在进展文库筛选之前，检测所构建的诱饵菌株AbAr基因的表达情况十分重要。所以需要进展实验以确定进展文库筛选时抑制诱饵菌株报告基因本底表达所需的AbA浓度。（1）分别挑取诱饵克隆和对照克隆，用0.9% NaCl重悬细胞，调节A600到0.002大约2000个细胞/100 l。（2）在下述培养基上分别涂布100 l重悬后的菌液，30C培养2-3 d。SD/-UraSD/-Ura with AbA 100 ng/mLSD/-Ura wi
6、th AbA 150 ng/mLSD/-Ura with AbA 200 ng/mL预期结果如下所示：表1AbAr基因预期本底表达结果AbA/ng/mLY1HGoldp53-AbAi克隆数Y1HGoldpBait-AbAi克隆数约2000100Bait dependent150200（3）在进展文库筛选时，使用AbA的浓度应为最低抑制浓度，或使用比最低抑制浓度稍高的AbA浓度高约50-100 ng/mL，以彻底抑制诱饵菌株的生长。如果200 ng/mL AbA不能抑制本底表达，可以尝试提高AbA浓度至500-1000 ng/mL。然而，在不存在捕获物的情况下，如果1000 ng/mL的AbA浓
7、度仍无法抑制AbAr基因的表达，那么很可能存在能够识别并与目的序列结合的源调控因子，因而该目的序列无法用来进展酵母单杂交筛选。4 文库cDNA的合成提取试材总RNA，进展反转录合成cDNA。合成的cDNA末端具有与pGADT7-Rec一样的酶切位点。（1）cDNA第一链的合成准备高质量的poly A和/或总RNA，用human placenta poly A+RNA作为阳性对照。RNA的质量决定文库的质量，RNA应为所要研究的特定时期和特定组织的RNA。在微量离心管中参加如下反响物： RNA模板0.025-1.0 g poly A和/或0.10-2.0 g总RNA 1-2 l CDS IIIo
8、ligo-dTor CDS III/6random引物 1.0 l Deionized H2O 使总体积到达4.0 l 1-2 l 总体积 4.0 l 在另外一支管中参加对照cDNA反响物，即RNA使用1 l1 gcontrol poly A+RNA。72C孵育2 min。冰上放置2 min，轻轻混匀，立即参加步骤中的试剂。每一个反响参加如下试剂，轻轻混匀离心。 5first-strand buffer 2.0 l DTT100 mmol/L 1.0 l dNTP mixture10 mmol/L 1.0 l SMART M-MLV RT 1.0 l 总体积 5.0 l步骤中的试剂可在步骤之前
9、加好置于冰上。此步是cDNA合成的起始关键步骤，变性后的RNA/引物mix冰上放置的时间不应超过2 min。如果用的是CDS III/6随机引物，25-30C保温10 min。如果用的是CDS III引物，省略此步，进展步骤。42C保温10 min。参加1 l SMART III oligo，充分混合，42C保温1 h。75C保温10 min终止第一链的合成。降至室温，参加1 l RNase H2 U。11 37C保温20 min。12 cDNA第一链合成产物应于-20C保存，可用3个月。2long distance PCR LD-PCR合成cDNA 第二链根据合成cDNA第一链时使用的RNA
10、量，下表给出了进展LD-PCR时最正确的热循环数。使用的热循环数越少，非特异性PCR产物越少。表2 RNA量与最正确热循环数总RNA/gPoly A+RNA/g循环数1.0-2.00.5-1.015-200.25-0.520-220.125-0.2522-240.05-0.250.025-0.12524-26LD-PCR反响混合物中参加如下物质每个样品做2个100 l体系，对照做1个100 l体系：First-strand cDNA from protocol A 2 lDeionized H2O 70 ladvantage 2 PCR buffer 10 l50dNTP mix 2 l5RA
11、CE引物 2 l3RACE引物 2 lMelting solution 10 ladvantage 2 polymerase mix 2 l总体积 100 l按照以下程序进展PCR反响： 1个循环 95C 30 s X个循环 95C 10 s68C 6 min 1个循环 68C 5 min取7 l PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶检测，检测时使用1 kb DNA ladder。（2）使用CHROMA SPIN+TE-400柱纯化ds cDNA为每一个要纯化的cDNA样品准备一个CHROMA SPIN+TE-400柱。将纯化柱翻转几次，充分悬浮gel matrix。移去柱的顶盖和底盖，将柱放入2
12、 ml收集管中。将柱放入离心机，700 g离心5 min以消除平衡缓冲液，弃掉收集管中的液体。将柱放入新的收集管中，把cDNA加到gel matrix的中央，切勿使样品沿柱的壁流下。加到边上易使样品沿柱壁流下，易混有小片段cDNA。700 g离心5 min，纯化的cDNA收集到管中。将两个纯化的cDNA样品合并到一管，测量体积。参加1/10体积3 mol/L醋酸钠pH5.3，混匀。参加2.5倍体积无水乙醇。-20C冰冻1 h。室温，14000 r/min离心20 min。小心弃去上清液，切勿碰到沉淀。14000 r/min瞬时离心，去除残留上清液。沉淀于空气中枯燥10 min。一般枯燥至无乙醇
13、味，不可过度枯燥，否那么很难溶解。用20 l灭菌去离子水溶解沉淀，此cDNA可用来进展同源重组构建文库。纯化后的cDNA用1%的琼脂糖电泳检测。5 构建并筛选酵母单杂交文库cDNA融合表达文库的构建及筛选（1）构建并在SD/-Leu/AbA培养基上检测Y1HGoldBait/AbAi菌株。AbA的浓度根据构建诱饵载体时转入酵母抑制本底表达时的浓度而定。（2）按SMART technology步骤合成ds cDNA，其浓度为2-5 g/20 L。（3）用Yeast Transformation System 2的方法转化酵母，在转化体系中参加如下物质：cDNA文库转化Y1HGoldBait/Ab
14、Ai菌株20 l SMART-amplified ds cDNA 2-5 g6 l pGADT7-Rec，Sma I-linearized3 gY1HGold 53/AbAi的转化5 l p53 fragment 125 g2 l pGADT7-Rec，SmaI-linearized1 g将转化体系分别稀释至1/10、1/100、1/1000、1/10000后，各取100 l涂100 mm平板。文库转化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA平板，对照p53转化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200平板。（4）将剩余的所有文库转化混合物约15 ml涂在150 mm SD/-Leu/Ab
15、A平板上，每板涂150 l。（5）倒置培养3-5 d。（6）3-5 d后，通过统计SD/-Leu 100 mm平板上的克隆数目来计算筛选的克隆数。所筛选的克隆数至少应该到达1百万，否那么会降低筛选到目的产物的可能性。筛选的克隆数=cfu/ml on SD/-Leudilution factorresuspension volume15mlresuspension volume=15 mlPlating volume=100 l250 colonies grew on the 1/100 dilution on SD/-Leu platesThe number of clones screene
16、d=250 cfu/0.1 ml10015 ml=3.75 million（7）预期结果阳性对照试验：SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200培养基上的克隆数相近。文库筛选试验：根据SD/-Leu平板上的克隆数计算所筛选的克隆数，其结果应大于1百万且SD/-Leu/AbA平板上的克隆数远远少于1百万，阳性克隆数目取决于诱饵序列。6 阳性克隆的鉴定及cDNA质粒的别离（1）阳性克隆重新划线培养，进展表型确认将阳性克隆在SD/-Leu/AbA培养基上重新划线，产生新的单克隆。2-4 d后，选择能够正常生长的克隆进展后续分析。（2）酵母克隆PCR消除重复克隆用Matchmaker Insert
17、Check PCR Mix 2 Cat.No.630497进展PCR，对插入到pGADT7载体中的cDNA片段进展扩增。PCR管中参加以下反响物： Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 l H2O/Yeast 25 l 总体积 50 l按下述程序进展PCR反响：94C 1 min68C 3 minPCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进展电泳分析。产物不是单一的条带很正常，这说明在同一酵母细胞不存在一种捕获载体为了确认大小相近的条带是否是同一种插入片段，用Alu I或Hae III或者其它常用的限制性切酶消化PCR产物，产物用2%的琼脂糖凝胶进展电泳分析。如果大量的克隆
18、含有同一插入片段，那么另取50个克隆进展PCR分析。为了快速验证克隆，PCR产物可经过纯化后用T7引物测序。（3）阳性cDNA质粒的别离获取酵母中文库质粒的分开。与转化的大肠杆菌不同，转化的酵母细胞可以含多种相关质粒，这就意味着阳性克隆里不只含有能激活AbAr报告基因的质粒，还可能含有一种或多种不表达相互作用蛋白的cDNA质粒。如果不事先将非互作质粒分开出去而直接通过转化大肠杆菌获取质粒，那么很有可能获取到非相互作用的质粒。为了增加获取阳性克隆捕获质粒的几率，可以将阳性克隆在SD/-Leu/AbA培养基上重复涂布2-3次，每次都挑取单一的克隆进展下一步涂布。从酵母中获取阳性cDNA质粒 为了鉴
19、定阳性互作相关的基因，用Easy Yeast Plasmid Isolation Kit Cat.No.630467从酵母中获取阳性质粒。转化E coli并别离阳性cDNA质粒 用常用的克隆菌株对阳性cDNA质粒进展克隆，用LB加100 g/ml ampicillin进展选择。（4）鉴别阳性和假阳性互作酵母单杂交筛选可能会检测到假阳性，用以下标准可以区分阳性和假阳性阳性：正确的诱饵序列和捕获物都是激活AbAr报告基因所必需的。假阳性：在诱饵序列突变的情况下，诱饵仍可以激活AbAr报告基因。用下述程序在选择培养基上对阳性和假阳性相互作用进展确认：用Yeastmaker Transformatio
20、n System 2的试剂和small-scale转化程序将100 ng获取的捕获质粒转化到Y1HGoldBait/AbAi和Y1HGoldMutant/AbAi菌株中。阳性对照和阴性对照实验应该一起进展。在SD/-Leu和SD/-Leu/AbA培养基上涂100 l转化混合物1/10和1/100的稀释物。30C恒温培养3-5 d后，预期结果如表所示。表3 阳性和假阳性相互作用验证结果A 阳性样品选择培养基2 mm清晰的克隆酵母菌SD/-Leu有Y1HGold诱饵/AbAi+靶SD/-Leu/AbAY1HGold突变/AbAi+靶无或者很小B 假阳性（5）阳性克隆的测序分析一旦相互作用被验证为阳性，就可以测序鉴定捕获载体的插入cDNA片段，验证与GAL4 AD序列融合的开放阅读框ORF序列，并与GenBank、EMBL或其他数据库中的序列进展比拟。
