1、然后将菌体放入适宜的培养基中培养，以促进细胞的愈合恢复。4.阳性转化的培养基筛选方法。普通的大肠杆菌难以在含有Kana的LB培养基上存活繁殖，但由于载体质粒含有Kana霉素的抗性基因，所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有Kana的LB培养基上形成菌落，即转化阳性，但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因，所以可能会出现伪阳性，故需要进行PCR鉴定。5.菌落PCR的原理 通过目的基因的引物进行菌落PCR，如果菌体成功导入了目的基因，则能够通过PCR获取大量目的基因片段，而不含有目的基因的菌落不会扩增出目的基因片段。从而将阳性与伪阳性菌落区分开。三 实验材料及设备1. 实验材料：（1）已完成
2、酶切的载体与目的基因片段。DNA连接酶，缓冲液等。（2）冰冻的感受态DH5a大肠杆菌。2. 实验仪器：（1）恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000L取液器各一支，台式高速离心机，制冰机，漩涡器；（2）电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。（3）PCR仪3. 实验试剂：（1）质粒的转化与转化导入a.DNA连接酶b.10Xbuffer;c.卡那霉素；d.酶切后的pET28a、目的基因片段等。e.LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，NaCl5g，琼脂（固体培养基）15g，用1
3、N NaOH调pH7.5;（2）DNA琼脂糖凝胶电泳检测a. Gold view（DNA染料）b.1TAE缓冲液c.上样缓冲液（6buffer）（3）PCRa. loading bufferb.四种脱氧核糖核苷酸原料、Taq酶、 上下游引物c.ddH2O四 实验方法及步骤实验流程图载体质粒与目的基因连接转化1. 质粒的连接转化a） 在EP管中分别配置下列的体系： 0.2ml EP管10buffer2.5 L酶切后的pET-28a7.5 L酶切后的目的基因片段13 LT4DNA连接酶（考虑连接效率）2 LX ： Y = 1 : 1030，总体积25 L。b） EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养
4、箱22反应30min， -20下保存备用。2. 转化质粒的导入a） 取出感受态细胞DH5a让其在冰上自然解冻，每100L解冻的感受态细胞加入整管连接产物，混匀后冰浴30min。b） 42热冲击45秒，立即置于冰浴5min。c） 热激法：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA想粘附并在细胞表面形成脱氧核糖酸酶的羟基-磷酸钙复合物。此时，将该体系转移到420C下做短暂的热刺激，细胞膜的液晶结构会发生剧烈运动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收；d） 冰浴过程中不要摇动EP管；（使破裂的菌体自然恢复）e） 再在感受态细胞混合物中加入0.8mL
5、的LB培养基，于37摇床中培养1h。目的：使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；f） 涂布于含有kana的LB固定培养基表面，37培养过夜。3. PCR鉴定假阳性反应物体积（L）ddH2O18.510 Buffer2.5MgCl21.54 dNTP1引物10.5引物2Taq酶菌落挑1个1.在0.2mL EP管内配制25L PCR反应体系 1个：实验室没有MgCl2，但是Buffer中含有Mg2+,所以实际添加18.5+1.5=20L的ddH2O;PCR单管加样时，对于非常微量的样品一定将样品加于管壁上或者液体中，防止漏样；加样的顺序：先加ddH2O，其次是缓冲液和菌落，最后加
6、酶，且要把样品加到液面下，酶从-200C冰箱中拿出后放在冰中待用，加酶时枪尖不要伸进酶液过深，加样时在溶液中缓慢吹吸几次，保证足够的酶量；2、用灭菌枪头挑单菌落（在培养皿背面做好标记）接触EP管内，混匀瞬时离心,每组可做5个体系。由于反应体系体积太小，引起的误差较大，可以一次配置多个（比所需反应体系个数多一个）反应体系，然后分开；3、放入PCR仪中，设置反应程序： 94 预变性 5min； 94 变性30S；使双链的DNA模板解旋为单链； 55 退火30S；引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 72 延伸60S；Taq酶以4种dNTP为原料，引物为复制起点，按53方向，复制模板的互补链；
7、重复步骤30次；（1）新合成的DNA分子可以作为模板，参与后续的扩增反应，使目的分子呈指数增长。（2）一般进行30个循环，因为此时目的分子的扩增进入平台期； 72 延伸10min；最后4保藏。4. 跑胶验证：胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1TAE缓冲液淹没过胶板5mm，用取液器将PCR产物5L与1L上样缓冲液（ 6 ）混匀，加入胶板的样品小槽内。将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约12cm处，停止电泳。将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。五 实验结果菌落
8、生长情况：可以看到，左侧的工程菌形成较多菌落，而右侧几乎没有生长，两组工程菌的差异主要在于热激时长（受错误实验操作步骤影响，右侧实验组2只热激了20s，而左侧为正常的45s）菌落较小，且分布密集，说明菌液浓度过高或者没有摇匀。图 1平板工程菌生长情况（左实验组1 右实验组2）Marker:DL2000PCR实验结果C带750bp图 2菌落PCR凝胶电泳紫外荧光检测结果说明：泳道编号依次为：1红色荧光蛋白工程菌 2 绿色荧光蛋白工程菌3绿色荧光蛋白工程菌（老师提供）， 4 DL2000Maker所得条带较为清晰，部分呈现“U型”，可能是电压过高，胶板温度过高。泳道123都产生了长度约800bp的
9、条带，与预期结果较为接近，且GFP组的分子量大于RFP组，与事实一致。证明所验证的三个菌落均为阳性菌落。老师所提供GFP工程菌由于菌体较多，可见大肠杆菌基因组条带（3条带1000bp到2000bp之间）。泳道1的下方还出现了一条约300bp的清晰条带，可能是引物因为巧合而PCR扩增出的杂带。六 结果讨论与结论：1. 实验结论：通过DNA连接酶，我们将目的基因片段与载体质粒混合，再通过热激发，我们成功将转化质粒导入DH5，并用含有Kana霉素的固体LB培养基验证，证明所检测的三个菌落都不是假阳性。2. 讨论一：PCR一般循环重复2530次，重复次数过多会怎样？答：溶重复次数过多，虽然在一定程度上
10、能够提高产物量，但是由于反应时间过长，有一些非特异产物的扩增和碱基错配数也会相应增加；而且随着酶的扩增能力下降，合成目标片段的能力也会随之下降,也可能引起其他的非特异性扩增；此外还可能会导致PCR反应“平台效应”的出现3. 讨论二：挑取单菌落的注意事项有哪些？（1）培养皿底部朝上，在酒精灯火焰20cm内操作；（2）操作时不要讲话，在无风处操作；（3）挑斑器具要求无菌；（4）挑选远离群菌落的单菌落，菌落不要过大；4. 讨论三：2. Taq DNA聚合酶的特性和菌落PCR的原理。Taq DNA聚合酶的特性：Taq DNA pol具有53聚合酶活性和35外切酶活性，但体外使用的Taq酶无35外切校正
11、活性。Taq酶最大的特点是耐热性；另外还具有高的催化合成特性。菌落PCR的原理：直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，可以快速鉴定菌落是否为含有目的基因的阳性菌落，此pcr的方法通常被用来进行筛选插入的目的基因或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的片断大小。5. 讨论四：BL21与DH5a等感受态细菌特点及应用的特征，用处。（1）DH5a和BL21都可以作为表达宿主。（2）BL21 是蛋白酶缺陷株，表达出来的蛋白不会被降解，做蛋白表达是比较适合用的，。BL21生长要比DH5a快，这是他们的又一区别，在高密度发酵BL21表达蛋白时，需要控制它的表达条件，使得高密度且高表达。（3）DH5a复制稳定的特点，所以它是核酸疫苗通常使用的宿主株。DH5a中表达时外源基因的启动子必须被大肠杆菌的RNA POLYMERASE 识别，比较好用的载体有PLPR可诱导的启动子。而带有T7 启动子的载体则不能在其中表达，因为识别T7 启动子的T7 RNA POLYMERASE 在DH5a中没有。对于BL21，已将T7 RNA POLYMERASE 的编码基因整合到了菌的基因组上，能识别T7 启动子，从而可容纳外源基因在此T7启动子的带动下表达。
