1、24抗菌药临床试验微生物实验室技术指导原则征求意见稿抗菌药物临床试验微生物实验室技术指导原则 （讨论稿）二一五年七月一.概述 31.抗菌药物临床试验的特殊性 32.抗菌药物临床试验微生物评价的现状 33.本指导原则的目的及应用范围 3二.抗菌药物多中心临床试验中对临床微生物实验室的要求 31.实验室的资质要求 32.实验室的工作内容 4三.抗菌药多中心临床试验研究中临床微生物实验室相关的管理制度 51.检测项目的申请单、鉴定单及结果报告 52.菌种保存、运送及接收 63.菌种复核结果的反馈 74.生物安全制度 75.试验资料的管理和保密制度 86.培训制度 97.外包制度 108.临床试验医疗
2、机构中临床微生物实验室能力评估制度 10四.微生物学疗效评价中所涉及的技术要求 111.标本采集 112.标本的处理 123.病原菌的纯分和菌种鉴定 134.菌种的编号 135.菌种的复核鉴定和保存 146.药物敏感性试验 147.血清学和尿抗原测定 16五.中心实验室微生物学报告的内容与格式 161.病原学资料 162.药物敏感性试验资料 163.报告的格式和内容 17参考文献 18抗菌药物临床试验微生物实验室技术指导原则（讨论稿）一. 概述1. 抗菌药物临床试验的特殊性抗菌药物因其作用于感染人体的细菌等病原微生物而起药效，在其临床试验中必须同时对其微生物学疗效进行评价，并在综合评价临床疗效
3、的同时，才能对其优效性做出评价，对临床使用提供基础数据。因此，对微生物学疗效的评价是抗菌药物研发过程中最重要的不可缺少的研究内容之一。2. 抗菌药物临床试验微生物评价的现状自上世纪80年代末，国内研发的抗菌新药临床试验逐渐增多，微生物学疗效评价已经成为临床试验的重点内容之一，虽然在多中心临床试验中制定了统一的临床试验计划和方案，也包括微生物学评价要求，但在具体的实施过程中，无论是对实验室的管理，还是相关的技术要求，距目前国际上抗菌药物临床试验中微生物学疗效评价要求尚存在较大差距，极大地影响了抗菌药物的研发。因此迫切需要建立能与抗菌药物临床试验技术指导原则相配套的微生物疗效评价所涉及的微生物实验
4、室技术体系，保证临床试验的质量，提高研究与评价水平。3. 本指导原则的目的及应用范围本指导原则遵循药物临床试验的要求，阐明了抗菌药物临床试验中微生物实验室管理要求和基本技术要求，包括微生物中心实验室和分中心微生物实验室，但并不能完全覆盖抗菌药物临床试验中微生物疗效评价可能会发生的各种具体情况。本指导原则为药品注册申请人和临床试验研究者在规划、设计、实施和监督临床试验，收集和分析试验数据提供必要的技术指导，使安全有效的抗菌药物得以更好更早地用于临床治疗。本指导原则主要适用于抗菌药物的临床试验。二. 抗菌药物多中心临床试验中对临床微生物实验室的要求1. 实验室的资质要求(1) 微生物中心实验室(以
5、下称中心实验室)：中心实验室必须具有开展相关微生物实验检测的设施与人员，必须具有公认的检测和质量控制或水平考核项目等能力认可。具体要求为：必须是中国合格评定国家认可委员会（CNAS）关于ISO15189等的医学实验室或其他权威机构认可并颁证的单位，必须能提供质量控制和质量保证程序、标准操作规程及其参加能力验证等室间质评项目活动的颁证或CNAS 或其他认证机构颁发的认可证书。中心实验室一般设立在多中心临床试验负责单位，亦可委托具备上述资质的第三方临床微生物实验室承担微生物中心实验室的任务。(2) 分中心微生物实验室（以下称分中心实验室）：分中心实验室必须至少具有开展相关微生物实验检测的实验设施与
6、人员、必须具有通过公认的检查和质量控制或水平考核项目等实验室资质。具体要求为：分中心实验室必须至少是参加国家卫生行政管理部门的能力验证项目室间质控或省、市和地区的能力验证项目室间质控合格者，并能提供质量控制和质量保证程序、标准操作规程及其参加能力验证项目等室间质评活动的颁证。如分中心医疗机构的临床微生物实验室不具备上述资质亦可委托具备上述资质的第三方实验室承担分中心临床微生物实验室的任务。(3) 临床微生物实验室工作人员的资质要求：中心实验室和分中心实验室所在单位必须是国家食品药品监督管理局批准的国家药物临床试验机构，项目组负责人及项目参与人员必须具有相应的临床微生物工作的能力，具备相应的培训
7、证书；均需是接受由国家指定的抗菌新药临床试验的“GCP”培训机构的“GCP”培训以及通过考试获得“GCP”培训证书；必要时应通过由中心实验室按方案要求对目标细菌设立能力验证室间或室内人员比对等考评。2. 实验室的工作内容(1) 中心实验室1) 按临床试验研究项目方案要求制定检测方案和标准操作规程 可以国家卫生行政管理部门颁布或公认的行业标准要求和标准操作规范，制定统一的临床微生物中心实验室和分中心实验室的操作方案和手册，必须满足临床试验方案中临床微生物学评价要求2) 协助申办方对临床试验分中心临床微生物实验室能力进行评估；要求按本指导原则二、1、（2）和（3）条款的要求进行3) 对参加试验的研
8、究人员包括临床和临床微生物实验室研究者进行临床微生物评价要求的培训；4) 接受各分中心送交的临床分离菌，进行菌种复核鉴定和保存，并出具菌种复核反馈报告；5) 采用稀释法药敏试验测定受试药和对照药对方案中所有基线临床分离菌的最低抑菌浓度（MIC）； 6) 根据方案要求对分中心提供的血清、尿标本进行血清学和尿抗原检测；7) 根据方案要求，必要时可对特殊病原菌的菌种鉴定和耐药性的基因型进行分子生物学测定；8) 根据方案要求，对申办方出具抗菌药多中心临床试验研究临床微生物中心实验室检测报告；9) 如中心实验室同时也作为多中心临床试验研究单位之一直接接受微生物学标本时，需同时承担分中心实验室所需承担的各
9、项职责。(2) 分中心实验室1) 接受中心实验室的评估与培训；2) 临床试验中临床微生物学标本的采集和运送；3) 临床微生物学标本的处理和培养；4) 病原菌的纯分和菌种鉴定，并向标本送检者出具菌种鉴定报告；5) 采用纸片法（K-B法）测定临床分离菌对试验药和对照药的敏感性，并向标本送检者出具菌种敏感性试验结果报告；6) 临床分离菌株的保存，定期进行临床分离保存菌株的活化和将菌种运送至中心实验室；7) 认真按中心实验室反馈报告的要求或复核结果通报临床试验研究者。三. 抗菌药多中心临床试验研究中临床微生物实验室相关的管理制度抗菌药物的、期临床试验均系多中心临床研究，必须遵循统一的临床试验方案，其中
10、也包括微生物学评价方案。为保证其评价的正确性，要求对临床微生物实验室检测的全过程进行质控，故必须在对项目的执行过程中，由中心实验室按临床试验方案要求制定微生物实验室检测工作的各项管理制度，各分中心按此实施。1. 检测项目的申请单、鉴定单及结果报告 按临床试验方案中临床微生物学疗效评价的要求由中心实验室绘制统一的表单供各分中心填写。包括：1) 各类标本及其相关标本的涂片镜检和分离培养的申请单；2) 菌种鉴定表；3) 结果报告单；4) 随同菌种送往中心实验室时的菌种信息表、菌种登记表、菌种运输单；5) 随同血清和尿液标本送往中心实验室时的血清学测定和尿抗原测定的申请单和标本运输单；6) 菌种、血清
11、、尿标本的标签等；2. 菌种保存、运送及接收 分中心实验室应对试验中受试者的每个访视期获得的菌种必须采用合适的方法进行菌种保存。具体可按下述要求进行：(1) 菌种保存1) 一式两份，分别放置在两个不同的冰箱内，以防冰箱故障等以外情况发生；2) 菌种保存的环境应尽可能保存在-70冰箱内；3) 必须有菌种保存位置、使用及菌种运输等详细记录；(2) 菌种运输；1) 定期在申办方监督员的安排下以合适的运输方式运输至中心实验室；2) 菌种活化：菌种运输前，需选择合适的培养基对保存在-70冰箱的菌种行活化和纯分；3) 菌种接种 活化后经纯分，确认是方案中基线分离的菌种接种于菌种运输管，不需要培养；4) 菌
12、种运输 接种好菌种的运输管应在最短的时间内快递运输至中心实验室；5) 运输公司的资质 负责运输菌种和生物活性物质的承运公司必须具有运输菌种和生物活性物质资质的运输公司，并具有相应的卫生监督部门颁发资质证书；(3) 菌种接受：中心实验室应按本指导原则 四、微生物学疗效评价中所涉及的技术要求 5.菌种的复核鉴定和保存 1. 菌种的接受中所描述的要求进行中心实验室的工作。3. 菌种复核结果的反馈：为确保抗菌药物临床试验中微生物学评价的质量，菌种鉴定和药敏试验结果的正确性，要求中心实验室必须制定菌种鉴定复核反馈制度，具体内容可包括对中心实验室反馈报告的工作日、反馈报告的内容以及复核结果和分中心实验室初
13、始鉴定不符合应采取的措施等作出具体要求等。如(1) 中心实验室工作日 一般於7-10个工作日必须给予分中心实验室菌种复核反馈报告(2) 反馈报告 反馈报告的内容应包括：1) 菌种接受的情况描述2) 菌种相关信息收集的情况3) 菌种复核的结果4) 是否需要重送，或需补齐资料等并将上述反馈报告以合适的方式送达分中心实验室(3) 复核结果与原鉴定报告不一致时的处理措施 1) 必须要求分中心重送菌株，再次复核；2) 再次复核结果与分中心实验室原鉴定报告一致时，维持分中心实验室结果3) 再次复核结果与分中心实验室原鉴定报告仍不一致时，并与中心实验室初次复核一致，则要求分中心修改CRF表4) CRF表的修
14、正 再次复核的结果仍维持初次复核结果时，中心实验室应以反馈意见表形式通知试验中心，需以中心实验室菌种鉴定复核结果为准，并修正病史及病例报告表(CRF)中有关病原微生物鉴定结果的相应记录。4. 生物安全制度 对项目研究中，所发生的与所有微生物学操作相关的活动和行为以及产生的结果，包括菌种的保存、销毁、运输等均应制定生物安全措施，保证研究项目正常开展。(1) 参照文件 2004年11月12日颁发的第424号中华人民共和国国务院令病原微生物实验室生物安全管理条例，按二级生物安全实验室的要求规范员工所有操作行为；(2) 菌种的保存 按上述文件第二章“病原微生物的分类和管理”第十四条的要求，认真保管好项
15、目试验期间临床试验分离菌种；(3) 菌种销毁 在项目结束后，申办方通知可以销毁菌种时，应按上述文件第二章“病原微生物的分类和管理”第十六条的要求消毁菌种；并要有详细的销毁记录；(4) 菌种运输 承运菌种或标本的运输公司必须具有运送病原微生物菌（毒）种或样本运输资质，承运的过程应参照卫生部令第45号可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定5. 试验资料的管理和保密制度项目研究中数据和资料是贯穿项目顺利开展始终的生命线。因此为保护受试者隐私和安全以及项目研究过程中研究资料的不泄密，故中心实验室和各分中心实验室必须建立相应的试验资料的管理制度和保密制度，以保证在方案执行的过程中不遗
16、失任何有关记录。如要求做到：(1) 资料备份 所有与试验有关的文件、数据、记录、报告必须要有备份；包括相应的电子文档等(2) 资料归档 方案执行过程中的任何有关记录均要及时妥善保存。这些资料包括：1) 试验中产生的各种运输记录、申请单、菌种复核记录及反馈意见表、进程报告以及与申办者和研究者的来往信件或沟通记录等。2) 整个试验项目结束之后，及时将试验数据和结果等按序整理、编号、目录、分类装订归档。文件归档的要求如下：1. 中心实验室要对来自各分中心实验室的微生物学资料按各试验中心归档，资料应包括：菌种信息单、血清、尿抗原测定等申请单； 2. 菌种和各类标本的运输单、快递单；及反馈意见表(报告单
17、)的签收单等全部编号归档，并装订成册；各临床试验分中心的实验室应参照上述要求将实验过程中发生的资料编号归档，并装订成册，以便溯源；3. 中心实验室应将临床微生物学检测的原始资料归档和编号，包括：临床微生物中心实验室菌种接受和鉴定复核结果登记表； 菌种复核鉴定过程中的所有实验记录(如菌种复核单)； 药敏试验记录单； 血清学和尿抗原等测定记录单等装订成册后归档；(3) 资料保管 与项目有关的原始资料，包括已经完成或正在进行中的检测资料均应双人双锁等；(4) 资料保密 除研究者、申办者和申办者委托的CRC等，与项目无关人员一律不得私自、随意翻阅与项目有关的检测资料；可按下述要求：1) 制定资料借阅制
18、度 如所有资料不外借，不离开检测实验室；2) 规定阅读者权限 如未经实验室技术人员同意不得对检测资料私自修改；私自照相；如有需要可提出要求，进行资料索取等登记，由工作人员统一给予等；3) 教育项目参与者不得与他人（包括和研究者相互间及不相关人员）在公共场所谈论与项目研究的相关进展情况和受试者隐私等；(5) 资料保存和销毁1) 资料保存的期限应按国内药物临床试验有关法规要求，所有的实验记录和总结保留5年，或交申办者另行处理；2) 菌种(包括涂片)、血清和尿标本等资料应在在获得药政部门批准该药生产批文后，经申办者同意，可将该临床试验中的上述相关微生物学标本作销毁处理，或交申办者另行处理。6. 培训
19、制度：为使每一个参与抗菌药临床多中心试验研究项目的研究者了解与项目有关的微生物学疗效评价的内容和要求，必须建立培训制度。参与培训的对象应包括项目中所有的临床和临床微生物实验室研究者，培训的内容可按：(1) 项目启动前 1) 学习培训中心实验室按方案要求制定的多中心临床试验研究的临床微生物学操作手册；2) 通过学习培训，明确项目执行过程中各职能人员在标本的采集、运输以及分离培养等职责；3) 特别要注意对临床微生物学技术人员对项目中要求的目标细菌检测能力和注意事项的培训；(2) 在项目开展中，可结合研究进程中出现的问题及时总结，进行培训；(3) 培训形式：可以会议、培训班等形式，也可以到存在问题较
20、多的单位实地考察培训。 7. 外包制度 当项目需委托第三方临床微生物实验室承担中心实验室的任务或承担分中心临床微生物实验室的任务时，应该由申办方和项目牵头单位研究者可按下述要求共同选定、讨论和考察。(1) 外包单位必须具备本指导原则二、1和2描述的中心实验室或分中心实验室相应的资质(2) 其实验室负责人和具体参与研究的技术人员必须具有本指导原则二、3.临床微生物实验室工作人员的资质要求(3) 对需接受中心实验室工作的实验室需考察其是否有参加并曾承担过抗菌药多中心临床试验研究中心实验室相关的历史记载；(4) 对需接受分中心实验室工作的实验室需考察其是否有参加并曾承担过抗菌药多中心临床试验研究分中
21、心实验室相关的历史记载；(5) 委托外包和接受外包的医疗机构必须具有整个外包过程详尽的流程记录以便朔源；(6) 接受外包的单位必须按方案要求和本指导原则开展工作。8. 临床试验医疗机构中临床微生物实验室能力评估制度无论是申办方还是项目主要研究者均应在项目研究开始前对承担中心实验室和分中心实验室的资质和技术人员的工作能力进行评估。具体要求可按本指导原则二、进行。(1) 必须是国家食品药品监督管理局批准的国家药物临床试验机构的临床微生物实验室，具有临床微生物学试验必备的仪器设备和相应的技术人员；(2) 能提供临床微生物实验室质量控制和质量保证程序、标准操作规程以及相应的培训记录；(3) 能提供参加
22、能力验证等室间质评项目活动的记录和认可证书；(4) 能提供开展室内人员能力比对、仪器比对、方法学比对的活动记录；(5) 临床微生物实验室负责人必须接受过“GCP”培训并获得相应证书；(6) 负责具体的临床微生物学操作的技术人员必须接受过“GCP”培训并获得相应证书；(7) 必要时，还可通过由中心实验室按方案要求，设置的关键技术操作的考评。五. 微生物学疗效评价中所涉及的技术要求依据抗菌药临床试验目标适应证的不同，如社区或医院呼吸道获得性感染（CAP、HAP）、血流感染（BHI）、腹腔感染（CIAI）、复杂性皮肤软组织感染（SSTI）等，其目标病原菌，可包括需氧菌、苛养菌、厌氧菌和真菌，以及非典
23、型病原体。以下-、 2项在分中心实验室完成，、 1和项由临床微生物中心实验室完成。1. 标本采集 (1) 标本采集的时间 基线标本必须在未使用研究药物前采集，访视期的标本采集视临床试验方案要求而定(2) 标本的种类1) 病原学检查的标本 按照抗菌药物临床试验方案要求进行病原学检查的临床标本的种类可包括：1. 血液；2. 痰液、支气管分泌物、及支气管肺泡灌洗液、支气管防污染毛刷取样标本等呼吸道分泌物；3. 清洁中段尿；4. 腹腔渗出液；5. 胸水、脑脊液等无菌体腔标本；6. 脓液或创面分泌物等;注意以不同要求进行临床试验为目的的方案对上述标本种类的要求是不一样的。2) 血清学检查的标本：血清3)
24、 尿抗原检查的标本：中段尿液(3) 标本的采集部位、采集量和运送1) 应严格遵守相关公认的卫生行业标准和操作规范等要求规范临床微生物实验室操作程序。应根据不同的感染部位选用相应的标本采集方法，如呼吸道、泌尿道、皮肤粘膜等，以保证标本的质量、足够的标本量以及准确无误地及时送到各分中心微生物实验室；2) 对于不易到达的部位或正常菌群定植的部位的感染，应当制定具体的统一的标本采取和感染病原菌判断的标准操作规程，如血培养标本应每次在不同的两个部位分别留取；如疑厌氧菌感染的腹腔、关节腔或伤口深部的脓液抽取物，应避免与空气接触；3) 血清标本 （供血清学测定）分别留取基线（即访视1）和4周后的血清标本各2
25、ml；分别放置于2根血清冻存管，每管1ml；4) 清洁中段尿标本（供尿抗原测定）需在基线（即访视1）时留取，放置于2根尿液冻存管，每管1ml 3）和4）的标本在运往中心实验室前均需要放置在-20冰箱内保存。定期在冷冻状态下送样至临床微生物中心实验室2. 标本的处理(1) 标本的涂片、革兰染色和镜检1) 明确标本是否为合格的标本。如痰液等呼吸道分泌物涂片镜检结果示低倍镜下每个视野白细胞25个，上皮细胞10个时为合格标本，方能进行痰细菌培养；对不合格标本必须通知送验者要求重新采样送检；2) 根据革兰染色镜检观察到的细菌染色性状、细菌形态特征，向临床发送涂片结果的初步报告。(2) 标本的分离培养1)
26、 根据各类标本中的目标细菌采用合适的培养基，如血平板、巧克力平板和中国蓝等弱选择性培养基，以提高培养阳性率，保证获取纯培养物进行菌种鉴定；2) 需注意采集自不同感染部位的标本，有不同的要求。如疑为尿路感染采集尿标本时需留取清洁中段尿做培养的同时，并需进行菌落计数；3) 根据血培养采用的方法学不同，注意培养报警的时间。如：自动化血培养系统 5天后不报警应可视作无细菌生长；手工血培养并培养至7天无细菌生长者，需以无菌操作转种血平板和巧克力平板，仍不见生长者可视作无细菌生长；如果研究方案的目标细菌为一些特殊的苛养菌，需培养至2周或更长时间；4) 培养环境和时间，根据目标细菌对培养环境的要求选择合适的
27、培养温度和环境。如痰液等呼吸道分泌物中应考虑苛养菌的培养阳性率， 需注意放置5%-10%CO2的环境；脓液及其他化脓性感染标本通常为混合感染，在需氧培养的同时，应注意厌氧环境的培养。3. 病原菌的纯分和菌种鉴定 (1) 培养物生长情况描述 将在各类培养基上生长的病原菌情况进行描述，如菌落形态、溶血现象、是否为纯培养以及生长的数量等；(2) 病原菌的涂片和镜检 对在各类培养基上培养生长的菌落行涂片、革兰染色、镜检并作描述；(3) 病原菌的纯分 如培养基上未能形成单一生长的菌落必须对疑似主要的目标菌采用合适的培养基再行纯分；(4) 菌种鉴定 对于疑似主要目标菌的纯分菌落必须鉴定到种。根据培养物的形
28、态、菌落特征、选择合适的鉴定体系进行菌种鉴定。5. 菌种的编号 临床试验中分离获得的被认为属于病原菌的每一株细菌在行菌种保存前均应获得明确唯一的菌种编号。其编号原则应包含以下元素(1) 申办者名称的首字母； (2) 试验中心在方案中的编号； (3) 受试者的筛选号（有时通常是药物的编号）； (4) 菌种采集的访视期以及菌株数；(5) 必要时在菌种编号的末位加上方案编号。如泰景公司奈诺沙星静脉二期-C5方案执行过程中的菌种编号第1-5位为病人筛选号 1-3位为试验中心在方案中的编号 4-5位为患者入选序号（第一个入选的患者）第6-8位为患者的药盒号（随机筛选获得的药盒号）第9-10位为菌种序号（
29、其中第9位 ，表示基线的标本）6. 菌种的复核鉴定和保存 中心实验室应对临床试验中心送交的菌种进行复核鉴定并发送反馈意见表，描述菌种复核鉴定结果。(1) 菌种的接受：中心实验室在接受菌种时必须对下述事项进行记录：1) 菌种运输管的检查，发现破损，通过反馈意见表立即要求临床试验中心重送；2) 信息核对，指对菌种管上的标签与运输单、菌种信息单上的信息是否符合。并将菌种运输单和菌种信息单收放在事先已准备好的每个试验中心的文件夹内；3) 菌种复核和保存 在完成上述记录后，需对菌种采用合适的培养基进行划线分离培养，采用合适的鉴定系统对菌种进行复核鉴定，获得的明确的菌种鉴定后，也必须进行一式两份的菌种保存
30、。如同分中心实验室一样。(2) 反馈报告 按本指导原则的要求将菌种鉴定复核结果反馈给分中心实验室7. 药物敏感性试验 对研究中分离获得的病原菌均需按CLSI的操作规程进行药物敏感性试验。如非特殊要求，原则上分中心实验室一般采用纸片法（K-B法）对申办者提供的试验药和对照药同时进行纸片法药敏试验。当试验药无相应的抗菌药物纸片及判断标准进行细菌药敏测定及判读结果时，可由申办者委托中心实验室采用微量稀释法进行受试药对细菌的最低抑菌浓度测定，并由中心实验室出具MIC结果反馈各分中心，记载入CRF表中。本指导原则不涉及有关新抗菌药的折点制定，相关内容另文描述。(1) 中心实验室1) 方法学 要求采用微量
31、肉汤稀释法测定试验药和对照药对临床分离菌最低抑菌浓度（MIC） ，但厌氧菌需采用琼脂稀释法；2) 抗菌药物 试验药标准品由申办者提供；对照药原则上采用中国食品药 品检定研究院标准品；或有资质的第三方提供的标准品或工作对照品。对照药品种选择的原则：必须包括临床试验的对照药，其他对照药尚可包括试验药同类药的主要品种，非同类药对照药中可包括目前临床用以治疗目标病原菌感染有效抗菌药物的主要品种。药物的测试浓度应根据抗菌药物的抗菌活性选择尽可能覆盖合适的浓度范围，以便得到测试浓度范围内的MIC终点；3) 受试菌株 受试菌应该是各临床分中心送交的所有临床试验受试患者基线的分离菌；4) 药敏试验报告 受试药和对照药对受试菌株的MIC的测试结果按本“指导原则”关于微生物学检测资料的分析处理和报告的要求向申办者定期出具药物敏感性试验结果的测试报告，见五、2.（1）。5) 培养基和质量控制 根据细菌和抗菌药物的组合以及选用的药敏试验的方法
