1、乳制品中三聚氰胺的含量的测定高效液相色谱法实验报告2009级化学教育仪器化学综合性与设计性实验指导老师：曹* 2011年 5月 30号 一、实验目的 1通过分析化学综合性实验、设计性实验，培养学生初步的解决分析化学实际问题的能力，培养学生的创新意识与创新能力。 2学习查阅参考文献、综合参考资料、设计小型分析化学实验。 3复习和巩固有关理论基础知识并用于指导实践。 4进一步熟练掌握实验操作技术。 实验题目：乳制品中三聚氰胺的含量的测定（高效液相色谱法） 摘要、关键词：摘要 为建立乳制品中三聚氰胺含量的高效液相色谱测定方法, 通过超声提取, 离子交换萃取小柱净化, 结合高效液相色谱进行样品测定。
2、色谱条件: A液：0.9508 g 辛烷磺酸钠（5 mmol/L）+ 1.0640 g柠檬酸（pH=3-4）用高纯水品配制1L溶液；B液：甲醇；色谱条件：30%B+70%A。 色谱柱：CNWSIL C18液相色谱柱 （4.6250mm，5 m），检测波长：239 nm结果表明: 三聚氰胺标准曲线为y = 4495951 x +18978.83 , 相关系数R = 0.9999693, 在0.17110.0 mg/L范围内线性关系良好, 方法检出限为0.12 mg/L, 两个样品三个水平的加标回收率分别为96.34 % (RSD = 4.76)、84.86 % (RSD = 7.21) 、104
3、.29 % (RSD = 7.63) 和95.31 % (RSD = 4.39) 、89.25 % (RSD = 3.88) 、92.59 % (RSD = 5.27)。关键词 高效液相色谱; 三聚氰胺; 乳制品 引言一、目前有关三聚氰胺在乳制品中的概述：三聚氰胺(melamine) ）（化学式：C3H6N6），俗称密胺、蛋白精，IUPAC命名为“1,3,5-三嗪-2,4,6-三氨基”，是一种重要的氮杂环有机化工原料, 通常用于塑料制品中合成树脂的生产 1 。它是白色单斜晶体，几乎无味，微溶于水（3.1g/L常温），可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等，不溶於丙酮、醚类、对身体有害，
4、不可用於食品加工或食品添加物。 由于中国采用估测食品和饲料工业蛋白质含量方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人掺杂进食品或饲料中，以提升食品或饲料检测中的蛋白质含量指标，因此三聚氰胺也被作假的人称为“蛋白精”。 蛋白质主要由氨基酸组成。蛋白质平均含氮量为16左右，而三聚氰胺的含氮量为66左右。常用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”是通过测出含氮量乘以6.25来估算蛋白质含量，因此，添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量虚高，从而使劣质食品和饲料在检验机构只做粗蛋白质简易测试时蒙混过关。有人估算在植物蛋白粉和饲料中使测试蛋白质含量增加一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实蛋白原料的1/5。三聚氰胺作为一种
5、白色结晶粉末，没有什么气味和味道，所以掺杂后不易被发现。 奶粉事件：近年来, 一些不法厂商将三聚氰胺添加到奶粉中, 以增加蛋白质含量。 2008年9月, 震惊中外的“三鹿婴幼儿奶粉事件” 2 暴露出乳制品行业的“潜规则”, 国内一些知名乳品品牌也被检出其产品中含三聚氰胺 3 。 各个品牌奶粉中蛋白质含量为15-20%（晚上在超市看到包装上还有标示为10-20%的），蛋白质中含氮量平均为16%。某合格奶粉蛋白质含量为18%计算，含氮量为2.88%。而三聚氰胺含氮量为66.6%，是鲜牛奶的151倍，是奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，理论上就能提高0.625%蛋白质。 微溶系指1
6、g(ml)溶质能在100ml1000ml溶剂中溶解，三聚氰胺在水中微溶，在牛奶这种水包油型的乳液中溶解度未找到实验数据，应该比水的溶解度要好一些，待验证。 检测方案：在现有奶粉检测的国家标准中，主要进行蛋白质、脂肪、细菌等检测。三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的，所以现有标准不会包含相应内容。亦即三聚氰胺检测目前并无国家标准。因此，德国莱茵TÜV集团参照美国食品化学品法典(FCC)HPLC-UV定量方法，同时还可采用HPLC/MS检测方法（实验室方法）对婴儿食品，宠物食品，饲料及其原料(包括淀粉，大米蛋白, 玉米蛋白, 谷朊粉、粮油等)开展的检测业务，检测结果具备权威性。
7、因此, 如何快速、准确分析乳制品中的三聚氰胺成为多方关注的问题. 本次设计性实验在NY/T 13722007标准 4 的基础上进行改进, 结合其他产品中三聚氰胺的测定方法 5 , 利用高效液相色谱法对乳制品进行三聚氰胺含量的测定。二、对三聚氰胺的测定方法概述：国家质量监督检验检疫总局与标准化管理委员会联合发布了原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法，即国标GB/T22388-2008。这一新标准制定了高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法及气相色谱-质谱联用法三种检测方法与标准。三聚氰胺的检测方法还包括试剂盒检测法（ELISA）、离子交换色谱-紫外检测法等。1、高效液相色谱法（HPLC)：试样中的三
8、聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，提取液离心后经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，洗脱物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色谱仪进行测定。在添加浓度2mg/kg10mg/kg浓度范围内，回收率在80%110%之间，相对标准偏差小于10%。2、气相色谱-质谱联用法（GC-MS和GC-MS/MS）：试样经超声提取、固相萃取净化后，进行硅烷化衍生，衍生产物采用选择离子监测质谱扫描模式（SIM）或多反应监测质谱扫描模式（MRM），用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比定性，外标法定量。其中GC-MS法在添加浓度0.05mg/kg2mg/kg浓度范围内，回收率在70%110%之间，相对标准偏差小于10%；GC-MS/
9、MS法在添加浓度0.005mg/kg1mg/kg浓度范围内，回收率在90%105%之间，相对标准偏差小于10%。3、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）：试样用三氯乙酸溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，外标法定量。在添加浓度0.01mg/kg0.5mg/kg浓度范围内，回收率在80%110%之间，相对标准偏差小于10%。4、试剂盒检测法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA）：试剂盒检测法即为酶联免疫吸附剂测定，是利用萃取液通过均质及震荡的方式提取样品中的三聚氰胺进行免疫测定的一种方法。5、离子交换色谱-
10、紫外检测法：何强建立离子交换色谱-紫外检测法测定乳制品中三聚氰胺。样品用水和乙腈提取，分析时用LC-SCX离子交换色谱柱分离，浓度为0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（pH3.0）-乙腈（70：30）为流动相，在紫外波长240nm处检测。三聚氰胺为0.5mg/L-100.0mg/L时，质量浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系（r=0.9999），最低检出限为1.0mg/kg，加标回收率为93.8%102.5%，RSD3.5%。6、其他检测法：利用抗原与抗体相互识别的原理，制作出能识别三聚氰胺的抗体试纸，将试纸插入稀释的奶制品中，则可检测出其中是否含有三聚氰胺。使用膜分离技术萃取样品溶液，然后采用紫外
11、可见光度法或化学检验的方法检测样品中三聚氰胺的含量。三、选定实验方案的原理：试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，（其中包括 试样经溶解、超声提取、沉淀蛋白、过滤得到测试液），再经高效液相色谱测定，根据保留时间和紫外吸收光谱定性，根据峰面积进行定量。三聚氰胺呈弱碱性(弱阳离子化合物)，净化过程一般应选择阳离子交换柱。混合型的阳离子交换柱(PCX)通过将磺酸基团(-SO3H)键合在极性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)吸附剂上，具有阳离子交换和反相吸附两种机理，并具有以下优点：a)可通过两种不同溶液的洗涤(水/一定pH值的缓冲溶液和有机溶剂)，使样品更干净，提高检测的灵敏度
12、。 b)批次重复性好。 c)回收率高，重现性好，即使小柱跑干也可以得到较高回收率。 实验部分一、所使用的仪器和试剂：仪器：1200高效液相色谱仪 ;分析天平；小烧杯；玻璃棒；容量瓶（100ml、25ml）；胶头滴管；量筒（10ml、25ml）；具塞刻度试管（50ml）；超声波提取仪；离心管（10ml）；离心机;有机滤膜；微量注射器；试剂：三聚氰胺标准品( Sigma) ; 三氯乙酸、乙腈、(分析纯, ) ;实验用水为去离子水；待测乳制品（伊利奶粉）。二、实验步骤：1、样品的制备参照NY/T 13722007标准的方法 4 , 准确称取伊利奶粉5.0g四份, 其中一份加入到具塞刻度试管后，再加入
13、1%的三氯乙酸溶液15 mL和乙腈溶液5 mL, 超声提取10 min后, 用三氯乙酸定容至刻度，混匀。静置,将其转移至离心管， 于30 000 r/min下离心10 min, 取离心后的上清液10 mL, 转移至25ml的容量瓶中配成25ml的溶液，再转移少量溶液备用用于下次待测。过0.45m滤膜, 上机测定。2、标准溶液的配制以及标准曲线的制作（已做）3、三聚氰胺的含量根据绘制的标准曲线计算待测乳制品中三聚氰胺的含量，并使用有关软件计算出其他有关的数据，再通过数据分析实验，讨论并得出结论。5 结果与讨论（1）实验数据结果与处理高效液相色谱法测定乳制品中三聚氰胺的含量色谱条件：A液：0.95
14、08 g 辛烷磺酸钠（5 mmol/L）+ 1.0640 g柠檬酸（pH=3-4）用高纯水品配制1L溶液；B液：甲醇；色谱条件：30%B+70%A。 色谱柱：CNWSIL C18液相色谱柱 （4.6250mm，5 m），检测波长：239 nm一、定性三聚氰胺保留时间为：15.866 min二、定量配制一系列标准溶液，浓度分别为：0.01 mg/ml、0.02 mg/ml、0.05 mg/ml、0.10 mg/ml、0.25 mg/ml、0.58 mg/ml、1.00 mg/ml，依次进样，每次进样体积为2 l。Y = aX + ba = 4495951b = 18978.83R2 = 0.99
15、99387R = 0.9999693峰号保留时间面积峰高浓度11.8941928.7360.90.0000022.0282445.2546.30.0000032.14943198.17151.70.0000042.497106357.016026.10.0000052.83953720.93821.20.0000063.14535308.05893.30.0000073.28841854.24932.20.0000084.0211869.0203.60.0000099.37223825.42043.90.000001012.6582362.1212.00.00000空白峰号保留时间面积峰高浓度
16、11.9021289.8248.10.0000022.0302342.3517.40.0000032.14936913.96294.80.0000042.49393291.314050.40.0000052.84941051.43060.10.0000063.13129070.85139.50.0000073.27541222.34999.80.0000083.9901363.3170.70.0000099.24220115.31783.90.000001012.4522127.0180.90.000001114.715318221.217928.70.0703125：10峰号保留时间面积峰高
17、浓度11.9001808.6344.80.0000022.0333059.5750.80.0000032.15154231.98725.80.0000042.506125476.218059.50.0000052.84754154.73738.90.0000063.13240664.07282.20.0000073.27555942.76927.70.0000083.9931861.6232.00.0000099.23428462.82502.70.000001012.4432864.3251.90.000001114.699412705.922380.80.0911830：10峰号保留时间面
18、积峰高浓度11.9021960.0365.10.0000022.0312814.7671.40.0000032.15050468.58242.30.0000042.503118354.917232.50.0000052.84552648.43750.20.0000063.13138335.86812.70.0000073.27454378.36596.60.0000083.9931639.9211.70.0000099.22526031.12348.00.000001012.4292835.2244.50.000001114.675402702.022081.70.0889735：10数据比较
19、（2）讨论 参考文献 1 邵静群，温家琪，徐世文。三聚氰胺毒理学进展 J 现代畜牧兽医，2007,12: 52-54. 2 钱中兵。三鹿婴幼儿奶粉受三聚氰胺污染 EB /OL 。2008209211 http: / /news. xinhuanet. com /newscenter/2008209 /11 / content_9932071. htm. 3 国家质量监督检验检疫总局。全国液态奶三聚氰胺专项监督检查结果发布 EB /OL 。 2008209219 。 http: / /www. gov. cn / jrzg/2008209 /19 /content_1099280. htm 4 全国饲料工业标准化技术委员会。NY/T 13722007 饲料中三聚氰胺的测定 S 。北京: 中国标准出版社,2007。 5 王浩, 刘艳琴, 曹红, 等。 固相萃取与高效液相色谱联用测定宠物食品中三聚氰胺 J 。 分析化学, 2008,2 (36) : 273。
