全国病媒生物抗药性监测方案4.docx
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全国病媒生物抗药性监测方案4.docx
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全国病媒生物抗药性监测方案4
全国重要病媒生物抗药性监测(试行)方案
根据卫生部《2007年卫生应急工作要点》中“提高卫生应急能力”的精神,和卫生部发布的2007年卫生工作要点中“大力开展爱国卫生运动”的要求,落实中国疾病预防控制中心的关于重要病媒生物年度工作计划,特制定本方案。
方案的实施能够指导和推进“十一五”期间我国重要病媒生物控制水平、提升突发公共卫生事件中病媒生物控制技术支撑水平、规范我国重要病媒生物抗药性监测方法。
抗药性是影响全球公共卫生、农业、林业、畜牧业等领域中有害生物控制的重要问题,是影响媒介生物性传染病疾病预防控制的关键因素。
抗药性的产生和发展与药剂的使用有非常密切的关系。
开展和加强重要病媒生物抗药性监测,可以指导化学药剂的科学合理使用,提高控制效果,延缓抗药性发展速度,减少人畜中毒事件的发生,保护有益生物,维持生态平衡。
1背景
1.1抗药性监测在疾病预防控制中的重要性
目前,我国登革热、疟疾、鼠疫、肾综合征出血热、肠道传染病(如霍乱、细菌性痢疾)等疫区处理中,化学控制是其媒介生物控制的主要措施。
通过对常用化学药剂的敏感性调查和抗药性动态监测,可以选择并储备适宜的控制药剂,针对疫情种类、疫区的病媒生物种类、疫情的发生季节和生境等背景材料制定“病媒生物应急控制预案”,提高我国在传染病预防控制中病媒生物控制能力。
1.2抗药性概况
据统计,全球几乎所有病媒生物(如蚊类、蝇类、鼠类、蚤类等)都有产生抗药性的报道。
据统计,全世界已经有90种蚊虫对一种或几种杀虫剂产生抗性,其中按蚊51种、库蚊20种、伊蚊19种。
51种按蚊中,对DDT产生抗性的有49种,有机磷抗性24种,氨基甲酸酯14种,拟除虫菊酯10种。
产生抗性的库蚊有20种。
家蝇的抗药性问题在我国十分突出,对DDT、六六六等有机氯类,对敌百虫、敌敌畏、马拉硫磷、毒死蜱等有机磷类,对残杀威等有机磷类,对二氯苯醚菊酯、胺菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯等拟除虫菊酯类药剂,都已经产生了不同程度的抗药性。
1978年,全国蚊虫抗性调查显示:
淡色库蚊对有机氯类杀虫剂产生抗性,且无明显的区域性差异;淡色库蚊对有机磷类杀虫剂抗性在我国的东部高于西部。
中华按蚊对DDT的抗性现象发生普遍。
在1984-1986年的调查显示,淡色库蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂普遍产生抗性。
在二十世纪90年代,淡色库蚊对溴氰菊酯的抗药性趋势显示,东南沿海高于华北和东北,城市高于农村。
目前,淡色库蚊、白纹伊蚊、家蝇、中华按蚊、三带喙库蚊在我国多数地区已经产生了不同程度的抗药性,印鼠客蚤在广东省、云南省产生抗药性,褐家鼠、黄胸鼠、小家鼠在我国的多数分布区也对抗凝血剂产生抗性。
鉴于目前媒介生物性传染病发生的严峻形势,必须加强我国主要病媒生物抗药性监测工作。
1.3抗药性监测的基础条件
1.3.1疫情控制的需要
媒介生物性传染病占我国法定传染病的1/3,控制病媒是控制这类疾病的有效措施之一,化学药剂是快速降低媒介密度的必须手段,其依据是控制预案。
了解当地病媒对常用化学药剂的敏感程度、掌握有效药剂种类及其使用技术、制定针对性的控制预案,以应对可能出现的疫情。
1.3.2人民生活和社会与经济的需要
随着社会和经济的发展,人们的健康意识增强。
控制能够影响人类健康和生活的病媒生物,倍受各界人士的关注。
无论在大型活动(如奥运会、亚运会、世博会等)、大型工程(如三峡工程、南水北调、青藏铁路等),还是在市民群众的出游和日常生活中,对公共卫生要求更高,对环境保护的意识更强,这些都要求我们既要控制有害生物,又要绿色环保,抗药性调查可以使我们科学用药、少用药。
1.3.3已有的工作基础
由于病媒生物控制在我国疾病预防控制中的重要作用,国家对此非常重视,全国爱国卫生委员会是我国的病媒生物控制的积极推动者,在此平台上开展了一系列工作,如于二十世纪70年代末进行的全国蚊、蝇、鼠的抗药性监测,在全国范围广泛进行,基本摸清了当时的抗药性现状和发展动态,奠定了抗药性监测的理论基础和本底资料,同时也培养了大量的专业技术人员。
针对重要媒介生物性传染病和具有严重骚扰性的媒介,进行抗药性调查。
调查以WHO的测定方法为基础,统一检测方法,成果与信息共享。
与此同时,也进行抗性机制、抗性遗传规律、抗药性治理策略等的研究,对我国疾病预防控制和环境卫生的改善起到积极作用。
另外,在全国重要病媒生物监测正在运行,在该平台的支持下,使对抗药性的监测网络化成为可能,可以利用已有的人才、物资和系统资源,丰富各级疾控系统的病媒生物预防控制工作,为了实现病媒生物可持续控制,提高疾控能力。
1.4当前抗药性监测中存在的问题
1.4.1专业技术人员缺乏
二十世纪90年代,由于工作经费紧张和工作重心的转移,全国抗药性协作中断,使一些从事抗药性监测的专业技术人员离开原工作岗位,使病媒生物控制的发展受到极大损失。
1.4.2测定方法不统一
抗药性的检测和研究,主要集中在各级疾控机构、研究所、大学等领域,通过对近20多年发表的文献统计,出现试验方法不一致,即使相同的方法,试验条件不同、试虫不统一、供试药剂各异、死亡率判断标准不一致、数据统计方法各异等现象,致使获得资料间可比性差,不能实现资料的共享。
1.4.3抗药性监测结果的利用率低
对病媒生物的监测是为了指导用药,科学合理用药,进而制定抗性治理方案、疫情控制预案,最终为疾病预防控制提供理论依据。
由于抗药性的发生有区域性,不同的病媒生物、不同的药剂类型其抗性机制不同,只有充分利用抗药性监测和研究的结果,实现成果共享,才能提供资料的利用率,更好地为疾控服务。
2监测目的
2.1掌握抗药性水平,指导防制
掌握我国重要病媒生物对主要化学药剂的抗性水平,了解抗性动态和发展规律。
2.2制定控制预案,提高疾控能力
为病媒生物控制中药剂的选择和使用提供科学依据;针对不同疫情、不同地区、不同病媒生物制定药剂的储备和使用预案。
3监测的组织、分工和职责
3.1监测网络
以中国疾病预防控制中心传染病预防控制所媒介生物控制室为依托,以各省(自治区,直辖市)为监测试点单位,监测点由监测试点设立。
3.2分工和职责
3.2.1中国疾病预防控制中心传染病所
负责《全国重要病媒生物抗药性监测方案》(以下简称《方案》)的制定、组织、协调和督导;承担抗药性监测的技术指导和培训,提供监测药剂的标准样品,负责监测信息的收集、整理、分析、总结和反馈;并进行监测工作的督查和质量控制。
3.2.1省(自治区,直辖市)疾病预防控制部门
按照《方案》要求,落实开展辖区内监测工作;确定一名主管领导负责协调,督促检查监测方案落实;按时上报、分析监测结果。
4监测内容和方法
4.1蚊虫抗药性监测
4.1.1靶标蚊虫及监测点的选择
淡色库蚊/致倦库蚊(幼虫)、中华按蚊(成虫)、白纹伊蚊(幼虫)为监测对象。
各监测试点选择依据:
(1)当地媒介生物性传染病的发生情况;
(2)相关疾病媒介生物的种类和发生强度;(3)病媒生物对人的骚扰程度等选择。
监测点要考虑地理分布(经纬度、生境),每省选两个监测点进行。
监测点要相对固定。
4.1.2监测时间
在当地的发生高峰期,每年进行一次,年度间的测定时间相对固定。
4.1.3试虫采集
淡色库蚊:
雌成蚊100头以上,或幼虫300头以上,或淡色库蚊卵块50个以上,以居民区为主(依据:
自然情况下,昆虫抗药性的等位基因频率为10-6~10-8,抗性个体百分率为10-1。
)。
白纹伊蚊:
幼虫采集在150头以上,成蚊诱集在30头以上(伊蚊捕获成蚊的难度较大)。
中华按蚊:
在牲口棚内采集成蚊100头以上、或在稻田、积水等处采集300头以上幼虫。
抗药性监测,在采集试虫的当代或室内饲养的1~2代进行。
4.1.4监测药剂
拟除虫菊酯类溴氰菊酯、氯氰菊酯、氯菊酯;有机磷类敌敌畏、毒死蜱、倍硫磷;氨基甲酸酯类残杀威。
根据当地用药情况进行药剂的选择。
(需要好好讨论)
4.1.5设施和器材
配备抗性监测实验室,有测试室或光照培养箱(可以调解温湿度和光周期),蚊虫饲养室,有通风橱、烘箱、防蚊驱避剂、防蚊罩等防护用品,诱蚊灯、吸蚊器、采集勺等蚊虫的采集器具。
有电子天平(感量为0.1毫克),200微升、1000微升移液器,200ml烧杯等。
有计算机、数据处理软件。
4.1.6监测方法
4.1.6.1幼虫浸渍法
以4龄初幼虫为测试对象,以丙酮将原药稀释,将待测药剂配置5~7个系列浓度,即在200ml的烧杯中加入99ml脱氯水和1ml相应的药液(最后一次稀释用水为溶剂),加入30头试虫,以200ml脱氯水为对照。
试虫在25℃、相对湿度为80±10%的条件下放置24小时,调查并记录各处理的死亡数。
死亡判断标准,用锐器触动不能逃逸的幼虫为死亡。
试验重复3次。
对照死亡率超过20%,试验无效。
4.1.6.2成蚊监测法
药纸的制备将白油和乙醚(AR)按1∶2比例混合作为溶剂。
杀虫剂按需要量溶解其中,配成一定浓度(附录4),吸取2.14毫升均匀滴于16厘米×12.5厘米的新华1号滤纸或其他质量相近的滤纸上。
2小时后待乙醚完全挥发即可应用。
药纸制备后应在6小时内使用,如需要可以把l0-20张药纸用大小相同的玻璃板夹紧,用橡皮膏把间缝封实,再装入黑纸袋中,在较低温下大约可以存放一个月,但一经开启即不能储存,必须在两三天内用完,如果已经装入接触筒,就只能用一次。
先把恢复筒接装在放隔板的一面,用吸蚊器吸取1~2只雌蚊吹入筒内,然后关闭隔板,在隔板另一面装上已衬贴药纸的接触筒,把隔板抽开,将恢复筒内蚊虫轻吹入接触筒,迅速关上隔板,将筒平放,即开始计算接触时间,完毕后再抽开隔板将蚊虫再吹入恢复筒,关上隔板,将筒直放,用浸有5%葡萄糖水的棉花团置于尼龙网上。
室温27±1℃,无论测定时间的长短,皆从接触完毕后24小时计算死亡率。
为了便于蚊虫在恢复筒内停留,可用白纸衬贴在筒内上端l/2或2/3,空出下端,以便于观察死亡掉下的蚊虫。
每剂量应至少测40只蚊,实验重复3次。
4.1.7统计与计算
用POLO软件或DPS软件进行数据统计,获得致死中浓度(LC50)值及其95%置信限,LC90及其95%置信限,毒力回归线的斜率b值。
4.2家蝇抗药性监测
4.2.1监测点的选择
监测点要考虑地理分布(经纬度、生境),每省选两个监测点进行。
监测点要相对固定。
4.2.2试虫采集
成蝇100头以上、幼虫300条以上,以居民区为主。
4.2.3监测药剂
拟除虫菊酯类溴氰菊酯、氯氰菊酯、氯菊酯;
有机磷类敌敌畏、辛硫磷、毒死蜱;
氨基甲酸酯类残杀威。
4.2.3设施和器材
有抗性测试室或光照培养箱,有能够控制温湿度的家蝇饲养室。
电子天平(感量0.1毫克),200微升、1000微升移液器,0.05~0.1µL微量点滴器;500mL烧杯;饲养缸;养蝇笼。
在温度为25±1℃,相对湿度70~80%的条件下饲养,成蝇羽化后供给奶粉和白糖(比例为1:
1)。
4.2.4监测方法
用丙酮(分析纯)将原药配成5~7个系列浓度。
取3~5日龄,体重为18~20mg的家蝇成虫。
把含有乙醚(分析纯)的棉球将指形管口堵塞、轻度麻醉后,选健康雌虫,每处理30只置于平皿中,用点滴器(类型)将药液按浓度由低到高的顺序,点滴于中胸背板上,放入加有少量奶粉的500mL洁净的烧杯中,以5mL烧杯内放置海绵供水,在温度为25±1℃,相对湿度60%~70%的条件下饲养24h。
记录各处理的死亡虫数。
对照以丙酮处理,死亡率超过20%时需要重新进行。
试验重复3次。
死亡判断标准:
凡腹部上翻,六足抽搐,用探针触之不能翻身爬行者判为死亡。
4.2.5数据统计
用POLO软件或DPS软件进行数据统计,获得致死中浓度(LC50)值及其95%置信限,LC90及其95%置信限,毒力回归线的斜率b值。
试虫名称:
药剂名称:
测定人:
虫态:
;虫龄:
测定培育温度:
℃;湿度:
%
虫源地名:
英文药名:
处理日期:
年月日至月日
测定室温:
℃;湿度:
%
处理浓度
单位:
重复1
重复2
重复3
合计
死虫数
总虫数
死虫数
总虫数
死虫数
总虫数
死/总
对照
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/
处理虫数;毒力回归线:
;卡方X2:
斜率b值(95%置信限):
LC50:
95%置信限:
LC95:
95%置信限:
备注:
附录1淡色库蚊对化学药剂的抗药性测定原始记录表
附录2白纹伊蚊对化学药剂的抗药性测定原始记录表
试虫名称:
药剂名称:
测定人:
虫态:
;虫龄:
测定培育温度:
℃;湿度:
%
虫源地名:
英文药名:
处理日期:
年月日至月日
测定室温:
℃;湿度:
%
处理浓度
单位:
重复1
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重复3
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死虫数
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总虫数
死/总
对照
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处理虫数;毒力回归线:
;卡方X2:
斜率b值(95%置信限):
LC50:
95%置信限:
LC95:
95%置信限:
备注:
附录3中华按蚊对化学药剂的抗药性测定原始记录表
试虫名称:
药剂名称:
测定人:
虫态:
;虫龄:
测定培育温度:
℃;湿度:
%
虫源地名:
英文药名:
处理日期:
年月日至月日
测定室温:
℃;湿度:
%
处理浓度
单位:
重复1
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重复3
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死虫数
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死虫数
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对照
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处理虫数;毒力回归线:
;卡方X2:
斜率b值(95%置信限):
LC50:
95%置信限:
LC95:
95%置信限:
备注:
附录4家蝇对化学药剂的抗药性测定原始记录表
试虫名称:
药剂名称:
测定人:
虫态:
;虫龄:
测定培育温度:
℃;湿度:
%
虫源地名:
英文药名:
处理日期:
年月日至月日
测定室温:
℃;湿度:
%
处理浓度
单位:
重复1
重复2
重复3
合计
死虫数
总虫数
死虫数
总虫数
死虫数
总虫数
死/总
对照
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/
/
处理虫数;毒力回归线:
;卡方X2:
斜率b值(95%置信限):
LC50:
95%置信限:
LC95:
95%置信限:
备注:
附录5中华按蚊测试基本情况记录
1.测定人,单位:
。
测定日期:
年月日。
2.试虫来源:
省(市、自治区)、区(县)、街道(村)、生境。
试虫名称(中文),(拉丁文),性别,龄期,生理状态:
吸血□、未吸血□、半怀孕□、怀孕□。
测试杀虫剂:
药剂来源,有效期年月日,药剂的储存条件。
3.背景资料
杀虫剂使用:
处理蚊帐□;室内滞留喷洒□;使用灭幼剂□;农田用药□.
试虫的采集方式:
幼虫□,F1后代□,人诱法诱捕□,动物诱法诱捕□,室内捕获□,灯诱法□、其它□。
如果采集幼虫注明:
稻田□、雨水坑□、河边□、生活污水□、其它□。
附录6测试杀虫剂的推荐使用浓度
附录7推荐使用敏感基线
附录8成蚊测定用药纸的计算
WH0对纸上的剂量标准系以杀虫剂在白油中的浓度计算。
如混合液的l%实际为0.33%。
按照这种方法,每平方米滤纸滴混合液应为107.1毫升,乙醚全部挥发后仅残留白油35.7毫升,如含药量1%,即为0.357克。
滤纸的面积定为16×12.5=200平方厘米,为1平方米的1/50。
WH0多年来皆以杀虫剂在溶剂中的百分率为剂量标准,如溴氰菊酯的标准剂量为0.025%,实际每平方米药量0.0089克。
WH0专家委员会认为百分率与墙面药量无直接联系,建议今后使用“克/平方米’’的计量单位。
附录9关于化学杀虫剂对昆虫的毒力回归线统计问题
建议使用对大家所公认的统计软件,这样可以大大提高计算速度,减少出错的机会。
基本具有快速、简便、准确的特点。
常用的统计软件有POLO-PC,SAS,BA,DPS等多种。
1.使用国际通用的统计软件POLO-PC
LeOraSoftwarePOLO-PC,Berkeley,Calif
RusselR,RobertsonJL,SavinNE.POLO:
anewcomputerprogramforprobitanalysis.BullEntomolSocAm.1977;23:
202–213.
目前我们一直使用其它单位给的软件,其中有一些参数不能得到,我们正在连续一些国际有人,争取尽快由正规渠道购买正版软件。
例1
=F1
*deltamethrin
01303
0.026060
0.016051
0.00512090
0.011256060
0.00756059
0.0036042
0.0026018
0.00563019
0.003753014
0.00253011
0.0017304
0.001301
Indexofsignificanceforpotencyestimation:
g(.90)=.08179g(.95)=.12361g(.99)=.25008
EffectiveDoses
doselimits0.900.950.99
LD10deltamet.00122lower.00073.00061.00034
upper.00166.00175.00196
LD50deltamet.00309lower.00248.00232.00191
upper.00367.00382.00417
LD90deltamet.00782lower.00632.00607.00557
upper.01088.01213.01701
F1
deltametsubjects630controls130
log(L)=-282.4slope=3.178+-.250nat.resp.=.021+-.012
heterogeneity=4.01g=.124
LD10=.001limits:
.001to.002
LD50=.003limits:
.002to.004
LD90=.008limits:
.006to.012
2.使用具有我国知识产权的DPS数据处理系统
统计结果和POLO的结果相近,经过我们对试验数据核实没有显著差异,即计算的LC50及其95%置信限基本重叠。
例2
唐启义,冯明光著。
实用统计分析及其PDS数据处理系统。
科学出版社,2002。
附录10关于敏感基线的现状和设想
1建立敏感性基线的重要性
基线是衡量抗药性强弱的尺度,基线不统一就不能在全国范围内进行比较、分析。
根据现有文献,很难找到一个统一的标准。
以淡色库蚊对溴氰菊酯的使用的敏感基线为例:
程璟侠等使用淡色库蚊德敏感品系其LC50为0.24μg/mL(程璟侠等,1998);本实验室长期保存的敏感品系LC50为0.987μg/mL,天津卫生防疫站使用的淡色库蚊德敏感品系其LC50为2.7μg/mL;中国科学院上海昆虫所淡色库蚊敏感品系的LC50值为0.1μg/mL。
南京医科大学朱昌亮实验室,引入中国科学院上海昆虫研究所后已在室内传70余代,检测对溴氰菊酯的半数致死浓度(LC50)为0.8μg/L。
问题:
1、溶剂对试验结果的影响。
2、温度、湿度、光周期对试验结果的影响。
3、试虫龄期不同。
敏感基线是相对的,如何建立一系列有代表性的敏感基线,将是我们急待解决的问题。
研究目的不同可以基线的表现不同。
如抗药性机制研究中使用的敏感基线,一般使用未选育的相同种群的毒力回归线为基线,再使用一个大家公认的敏感基线,尽量使其遗传背景一致。
为了进行质量控制,全国性的抗药性监测,敏感基线要有统一标准。
2昆虫产生敏感性差异的原因
抗药性的主要特点是分布上的区域性、抗性机制和及其遗传机制的多样性。
其主要原因有:
(1)抗药性遗传多样性丰富。
即使在没有接触任何药剂的情况下,也会对同种杀虫剂表现出约十倍抗药性差异。
(例1)。
(2)药剂使用历史和交互抗性的影响。
由于用药背景不同,各地蚊虫对淡色库蚊表现出不同的敏感性水平,如河北省冀州市对溴氰菊酯的敏感性资源保留较好,白淑萍等1999年发表的文章显示,其敏感性比实验室的敏感品系还要敏感,其LC50为0.02μg/mL。
药剂的使用背景可以影响一个种群对杀虫剂的抗药性水平。
如DDT与拟除虫菊酯类杀虫剂有交互抗性,二十实际80年代出的测定表明,在很多没有使用过拟除虫菊酯的地区也有抗药性发生。
(3)杀虫剂的作用机制多样,昆虫对药剂的敏感性程度由其行为习性、生理生化和遗传物质的不同所综合决定的。
即使是核酸水平的差异不大,还有细胞质水平的差异(例2)。
3如何建立敏感基线
理论上,敏感基线是没有使用某种杀虫剂,或未使用具有类似作用机制杀虫剂的前提下,采集靶标生物进行敏感性测定的结果。
除了对新开发的药物以外,尽量寻找受药剂污染少的区域,获得敏感品系。
在我国的不同区域,包括各实验室种群和野外种群,用统一的方法测定,获得敏感品系。
利用已经报道的相对敏感的毒力回归线为基线,但是到1998年以前WHO推荐使用区分计量法来测定抗性的强弱,由于该方法是单剂量处理试虫,试验结果不稳定,适用于抗性发生的早期。
随着拟除虫菊酯的大量广泛推广应用,浓度对数与死亡率几率值回归方程——毒力回归线法是国内外的首选方法。
例1:
GeographicVariationinSusceptibilityofChilosuppressalis(Lepidoptera:
Pyralidae)toBacillusthuringiensisToxinsinChina
FengxiaMeng1,2,KongmingWu1,3,XiwuGao2,
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- 全国 病媒 生物 抗药性 监测 方案