柴胡疏肝散对夹尾应激大鼠脑和胃组织GASR mRNA和CCKAR mRNA表达的影响.docx
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柴胡疏肝散对夹尾应激大鼠脑和胃组织GASRmRNA和CCKARmRNA表达的影响
柴胡疏肝散对夹尾应激大鼠脑和胃组织GASRmRNA和CCK-ARmRNA表达的影响
(作者:
___________单位:
___________邮编:
___________)
作者:
张钰琴,凌江红,梁纲,王道刚,农树雄,黄华,农伟东,李艳玲【摘要】 目的探讨柴胡疏肝散对夹尾应激大鼠脑和胃GASRmRNA和CCK-ARmRNA表达的影响。
方法将30只大鼠随机分为3组,正常对照组、模型组和柴胡疏肝散组,每组10只,采用慢性夹尾刺激方法制作慢性应激模型,分别给予生理盐水、柴胡疏肝散水煎剂灌胃,共4周。
观察其一般情况及胃组织学变化,并用原位杂交方法检测大鼠脑和胃组织胃泌素受体(GASR)mRNA和胆囊收缩素受体A(CCK-AR)mRNA的表达。
结果①模型组出现了抑郁和消化不良行为表现,而柴胡疏肝散组则较不显著;②模型组胃黏膜均出现不同程度的糜烂和炎症反应,而柴胡疏肝散组则较轻;③模型组大鼠胃和脑组织上的GASRmRNA表达量较正常对照组有显著升高(均P0.05),柴胡疏肝散组则较模型组有显著降低(均P0.05)。
模型组大鼠胃组织CCK-ARmRNA表达较正常对照组显著升高(P0.05),柴胡疏肝散组较模型组有显著降低(P0.05)。
结论柴胡疏肝散能改善慢性应激抑郁和消化不良行为,其机制可能与其能减低脑和胃组织GASRmRNA表达和减低胃组织CCK-ARmRNA表达有关。
【关键词】柴胡疏肝散;GASRmRNA;CCK-ARmRNA;夹尾应 Abstract:
ObjectiveTostudytheeffectsofChaihushugansanonthegastricreceptormRNA(GASRmRNA)andCCK-AreceptormRNA(CCK-ARmRNA)expressioninstressratsinducedbyconstantlysqueezingtheirtails.Methods30ratswereselectedandrandomlydividedinto3groups:
controlgroup,modelgroupandChaihushugansangroup(eachn=10).Theanimalmodelofstresswasestablishedbyconstantlysqueezingtheirtailsfor4wkandmeanwhilesaline,Chaihushugansandecoctionwereadministeredrespectivelytothreegroupsbygavage.Theanimal’sgeneralsituationandpathologicalchangewereobservedeveryweek,andGASRmRNAandCCK-ARmRNAexpressionofratsinbrainandgastrictissuesweremeasuredfourweekslater.Results①Themodelgroupappeareddepressionanddyspepsia,themanifestationinChaihushugansandecoctionmaynotbesoobviouscomparedwithmodelgroup.②ModelgroupappeareddifferentmoderatestomachmucosaerosionandinflammationbuttheywerenotsoobviousinChaihushugansangroup.③TheGASRmRNAandCCK-ARmRNAexpressionofthemodelgroupratsinbrainandgastrictissueswereincreasedsignificantlythanthoseofcontrolgroup(P0.05),whileChaihushugansangroupwassignificantlylowerthanmodelgroup(P0.05).ModelgroupwassignificantlyhigherthancontrolgroupinCCK-ARmRNAofgastrictissue(P0.05).ConclusionChaihushugansancanimprovedepressionanddyspepsia,itsmechanismisrelatedtodecreasingexpressionofGASRmRNAinbrainandgastrictissuesandCCK-ARmRNAingastrictissneofrats. Keywords:
Chaihushugansan;GASRmRNA;CCK-ARmRNA;Stress 应激是一种常见的机体对紧急事件的反应状态,常可导致胃损伤和运动障碍,与胃肠道心身疾病起病及症状的发生密切相关[1]。
应激损伤属于中医病因学中的情志致病范畴,情志内伤最易伤肝,导致肝失疏泄而出现肝气郁结病证,进一步发展为肝郁脾虚或肝胃不和等,出现胃肠道症状。
文献报道[2,3]及我们的临床实践表明中医疏肝理气法治疗胃肠道心身疾病如功能性消化不良等具有较好效果。
研究表明其作用可能与影响胃肠激素水平有关[4~6],而胃肠激素对消化功能的影响常取决于表达的受体的数目,受体水平的高低在一定程度上更能反映该激素的作用强度,但目前尚无相关研究报道。
本实验通过慢性夹尾激惹刺激法制造大鼠慢性应激模型,观察柴胡疏肝散对其脑、胃组织的胃泌素受体、胆囊收缩素受体表达的影响,以期从中枢及外周脑肠肽受体角度探讨疏肝理气法治疗应激相关胃肠病的作用机制。
1材料 1.1动物30只健康清洁级WistarII级大鼠,雌性,体质量(200±10)g,购自广西医科大学实验动物中心。
1.2药物和仪器经方柴胡疏肝散组成:
柴胡6g,陈皮6g,川芎4.5g,白芍4.5g,枳壳4.5g,香附4.5g,甘草1.5g。
GASRmRNA原位杂交试剂盒和CCK-ARmRNA原位杂交试剂盒,均购自武汉博士德生物工程有限公司。
病理图像分析仪,德国,型号DMR±Q550。
2方法 2.1分组、造模适应性饲养7d,将30只大鼠随机分为3组,即正常对照组、模型组、柴胡疏肝散组,每组10只,每5只一笼。
除正常对照组外,其余各组参照文献[7]加以改进,采用夹尾激惹刺激法制造大鼠模型,方法是:
束缚布包止血钳钳夹标记鼠鼠尾,立即放开,30min/次,2次/d,持续4周。
于造模同一天开始灌胃,正常对照组和模型组分别予0.9%NaCl溶液灌胃,柴胡疏肝散组给柴胡疏肝散水煎液灌胃,量均为1.5ml/100g,早晚各1次。
共喂药4周。
2.2药物配制与用法将柴胡疏肝散按成人(60kg/人)临床用药量的10倍,按1∶5容积比,用蒸馏水浸泡30min,煎煮两次(30min/次)后,过滤,去渣取汁,合并滤液加热蒸发,制成1.41kg/L水煎浓缩液(含生药1.41kg/L),4℃保存待用。
2.3行为学观察通过动物的皮肤毛发、胡须、情绪反应、行为状态、兴奋程度、活跃状况、睡眠、饮食等进行一般情况的观察。
2.4取材及组织学观察处死大鼠前禁食不禁水12h,在实验第29天,所有大鼠用3%戊巴比妥钠1ml/200g腹腔麻醉,剖腹取胃,断头取脑。
10%福尔马林固定,常规包埋,切片,常规HE染色,光镜观察组织学改变。
2.5原位杂交石蜡切片厚4μm。
65℃烤片5h,TO生物透明剂脱蜡,梯度乙醇复水,三蒸水冲洗3遍后,按原位杂交试剂盒说明书操作。
GASR mRNA序列:
①5'-AATCA CCCTT TATGC AGTGA TCTTT CTGAT GAGTG-3';②5'-ACGAG TATGG CAAAC ACGCT CCCAC GCAGC TCGGG-3';③5'-TACTG TTTCA TGCAC CGCCG CTTCC GCCAG GCCTC-3'。
CCK-AR mRNA序列:
①5'-GAAAC AAGAG GATGC GGAGG GTCAC CAACA TCTTC-3';②5'-AAATA ATAAC CAGAC GGCGA ACATG TGCCG CTTCC-3';③5'-TGTGT TAACC CCATC ATCTA TTGCT TCATG AACAA-3'。
设无探针阴性对照。
利用病理图像分析仪进行图像采集和分析:
选取相同的部位的每张切片上选取5个互不重叠的视野,在400×光镜下分别测量各个视野GASRmRNA和CCK-ARmRNA阳性细胞的面积密度,取其平均面积密度值(%)。
2.6统计学处理所有数据以±s表示,采用SPSS13.0统计软件对数据进行处理,多组间比较用One-WayANOVA进行分析,方差齐采用LSD方法。
P0.05显示有统计学意义。
3结果 3.1行为学变化实验第4周,模型组出现了靠边、扎堆状,兴奋性及活跃程度下降,打斗减弱,活动相对迟缓、反应迟钝,毛发蓬松枯黄、不顺,进食量减少等现象。
柴胡疏肝散组上述表现则较不明显。
3.2组织学大体观察正常对照组胃黏膜无明显潮红、肿胀、糜烂等病变,模型组大鼠胃残留饮食物较多,几乎均可见数个针尖样大小的糜烂点,柴胡疏肝散组亦可见残留饮食物、糜烂,但数量、程度均较模型组轻。
光镜检查:
正常对照组大鼠胃黏膜有轻度淋巴细胞浸润;模型组大鼠胃黏膜固有层均有轻、中度淋巴细胞、嗜酸性细胞浸润,黏液分泌亢进,部分腺体扩张,胃小凹中有大量浆液,黏膜下层组织疏松水肿,胃肌层无明显病理改变,柴胡疏肝散组亦可见黏膜轻度炎症反应,部分也存在黏液分泌亢进现象,但程度较模型组为轻。
3.3各组大鼠脑、胃组织GASRmRNA和CCK-ARmRNA的表达 3.3.1形态学观察GASRmRNA阳性细胞在脑组织主要表达于大脑皮层。
CCK-ARmRNA在各组脑组织均无明显表达。
模型组胃组织GASRmRNA和CCK-ARmRNA主要表达于胃窦黏膜固有层和粘膜下层,胞浆染色呈棕黄色。
正常对照组和柴胡疏肝散组在胃和脑组织阳性细胞胞浆染色均不及模型组。
结果见图1~3。
3.3.2各组大鼠脑、胃组织GASRmRNA和CCK-ARmRNA阳性细胞表达面积密度比较结果见表1。
模型组大鼠脑和胃组织GASRmRNA表达量均较正常对照组显著升高(均P0.05),柴胡疏肝散组较模型组显著降低(均P0.05)。
模型组胃组织CCK-ARmRNA表达量较正常对照组显著升高(均P0.05),柴胡疏肝散组则较模型组显著降低(P0.05)。
表1各组大鼠脑、胃组织GASRmRNA和CCK-ARmRNA阳性细胞表达面积密度比较(略) 4讨论 脑肠肽是指存在于胃肠道内分泌细胞、肠道神经系统及中枢神经系统的肽类激素,其作为神经肽或神经内分泌或神经旁分泌物质,调节着胃肠运动、分泌吸收等复杂的功能,并与情绪有关[8]。
Gas对整个胃肠道均有作用,它可抑制胃底、胃体运动,延缓液体胃排空,同时对胃窦收缩有促进作用,促进胆囊收缩[9],CCK对胃运动调节的主要生理作用是控制胃排空[10]。
脑肠肽对消化功能影响的大小,常取决于表达的受体的数目。
CCK受体主要分为CCK-A和CCK-B,有证据表明CCK-A主要分布在外周组织,其可能参与饱感和多巴胺等行为活动的调节,而CCK-B则广泛分布于中枢神经系统,其参与对焦虑、疼痛、觉醒及某些精神疾病的调节[11]。
胃泌素和胆囊收缩素同属一激素家族,两者的受体序列也有同源性,故胃泌素与胆囊收缩素受体统称为Gastrin/CCK-B受体[12]。
受体和激素结合后,与G蛋白偶联并使之激活,循肌醇磷脂信号传递途径,在磷脂酶C的作用下使细胞内多种蛋白质磷酸化并最终产生生理效应[4]。
本研究采用长期夹大鼠尾部诱导大鼠应激反应,通过躯体刺激的方式来诱导并实现心理性应激,结果应激大鼠出现抑郁和消化不良的行为学表现,胃黏膜均出现不同程度的糜烂和炎症反应,提示夹尾对大鼠是一种有效的应激源。
而经柴胡疏肝散干预的大鼠上述表现则较不明显,提示柴胡疏肝散能有效地对抗应激所致的“心身”改变。
原位杂交检测结果显示,模型组大鼠胃组织GASRmRNA和CCK-ARmRNA表达显著高于正常对照组,而经柴胡疏肝散干预后,表达显著减低。
GASRmRNA在大脑皮层表达,柴胡疏肝散组表达量低于模型组。
中枢和外周GASRmRNA和外周CCK-ARmRNA表达上调,提示脑肠肽受体可能在应激相关疾病的病理生理学中起重要作用。
夹尾刺激兴奋迷走神经,分别刺激GAS和CCK的分泌,血循环中的脑肠肽GAS和CCK升高,受体增加并且兴奋迷走神经并通过迷走神经冲动发送信号投射到孤束核,将信号送达到下丘脑,通过中枢神经系统对胃肠动力进行调节,抑制胃肠运动,同时胃泌素和胆囊收缩素在中枢通过迷走神经介导胃酸的分泌[13]。
但中枢神经系统高级部位中内源性GAS和CCK的传导机制尚未清楚,可能是机体GAS和CCK增多,相应受体表达量升高,其化学信号直接从大脑皮层传达到下丘脑发挥作用,其具体机制均有待进一步研究。
另外,本实验对两类脑肠肽GASRmRNA和CCK-ARmRNA进行同步检测,发现CCK-BRmRNA在脑组织中有明显表达而CCK-ARmRNA基本上无表达,这可能由于mRNA极容易被降解且CCK-A受体在脑中比CCK-B受体含量少得多导致,其具体机制有待进一步探索。
本研究结果还提示了柴胡疏肝散对中枢和外周部分脑肠肽受体的调节作用,提示其复方多靶点的整体调治作用。
由此推测柴胡疏肝散能使得肝气正常升发,津血能正常为五脏六腑及脑所用,使脑有所充、脾有所养,调节局部和中枢神经系统脑肠肽的平衡,从而治疗应激相关胃肠病。
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1021.
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