细胞工程基础实验技术细胞育种教案.docx
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细胞工程基础实验技术细胞育种教案
实验1细胞工程基础实验技术
实验准备:
MS培养基母液配制
按配方表配制MS培养基母液:
大量元素配20×,微量元素和其它成分配制成200×,母液贮存于2~4℃的冰箱中。
植物激素配制
BA和NAA配制成浓度为0.5mg/ml的溶液,贮存在2~4℃下备用。
1.1实验目的
使学生了解培养基母液的配制方法和注意事项;掌握培养的配制及灭菌方法,为植物愈伤组织诱导实验准备培养基。
1.2实验用品及溶液
实验按每4个学生一组,每组分发培养基母液及激素母液一套,50ml量筒、1000ml有刻度烧杯、吸球、电炉各1个,5ml移液管9支,50ml三角瓶20个。
公用设备:
pH计,高压灭菌锅。
1.3操作方法
实验按500ml容量一组配制培养基,保证下一次实验每一学生有5瓶培养基供接种用。
愈伤组织诱导培养基:
MS+BA2mgl-1+NAAmgl-1+Sucrose20g-1+Agar7g-1
A.向容量瓶中顺序加入培养基母液:
大量元素25ml
微量元素2.5ml
铁盐2.5ml
其它成分各2.5ml
BA和NAA各2.0ml
B.加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水,加入10g蔗糖后搅拌使其溶化,用0.5N的NaOH和0.5N的HCl调整pH至5.8-6.0。
C.加入3.5g琼脂,将烧杯置于电炉上,搅拌加热使琼脂完全溶化,然后用蒸馏水定容至终体积500ml,继续加热几分钟使之混合均匀后分装于三角瓶中。
用记号笔写上学号或姓名。
D.分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌,灭菌条件为温度121℃,压力1.1kg/cm2,灭菌时间20min.左右。
灭菌后的培养基置于无菌室保存备用。
1.4记载内容
培养基配制过程。
灭菌方法
介绍不同类型灭菌设备的使用方法;采用高压蒸汽灭菌器对配置的培养基进行灭菌。
实验2无菌操作及愈伤组织诱导技术
实验准备:
烟草无菌试管苗培养:
将烟草种子用消毒液84#消毒后,无菌水洗3次,无菌吸水纸吸干水分,接种在MS培养基上。
种子苗具4-5叶时继代扩繁90盒,保证每学生1盒。
无菌培养皿每学生2套。
实验课开始前30min.将实验用具、培养基及无菌烟草苗同时用酒精用75%酒精擦洗后置于超净工作台,打开超净工作台风机和紫外灯。
2.1实验目的
掌握无菌操作技术;基本掌握植物愈伤组织诱导培养技术和调控条件。
2.2实验材料及设备
外植体材料:
烟草无菌苗叶片;实验1配制的培养基。
设备及工具:
超净工作台;不锈钢镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯等;75%酒精。
2.3操作方法
A.在自来水管下将手洗净,然后用75%酒精将手消毒,再进入超净工作台开始接种操作。
B.点燃酒精灯,将镊子、解剖刀在酒精灯下烤干。
C.取一无菌培养皿,然后用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中,并用锋利解剖刀将叶片切成2mm2左右的小片,然后将其接种于准备好的培养基上,一般每瓶接种4-5小片。
D.快速封好瓶口,用记号笔写上姓名和接种日期。
E.接种后的三角瓶置于24℃,条件下黑暗培养一周,然后在同样温度下有光照和全黑暗下培养直至愈伤组织形成。
注意外植体切割时,动作要快,否则会造成失水而影响生长。
为防止操作时失水也可在培养皿中滴几滴无菌水,然后将无菌苗置于其中进行切割。
2.4记载内容
培养基凝固状况;实验操作过程;叶片生长状况、接种外植体大小;每瓶接种数、接种总瓶数。
实验3器官发生与植株再生调控培养;愈伤组织增殖培养
实验准备:
配制器官分化和愈伤组织诱导培养基。
培养基配方:
分化培养基—MS基本培养基附加2.0mgl-1BA、和0.5mgl-1NAA。
愈伤组织增殖培养基—MS基本培养基附加2.0mgl-1BA、和2.0mgl-1NAA。
3.1实验目的
观察和分析不同光照条件形成的愈伤组织对器官分化的影响,观察和分析愈伤组织诱导和器官分化的激素使用差异;了解器官分化和植株再生的过程。
掌握离体培养中的转接技术。
3.2实验材料及设备
实验材料:
实验2中诱导的愈伤组织
实验设备和用具:
同实验2。
3.3操作方法
A.观察实验1愈伤组织诱导结果:
统计愈伤组织诱导率;观察记载黑暗和光照条件下愈伤组织的差异,结合理论学习进行分析。
愈伤组织形成率=愈伤组织数/接种外植体数
B.按照实验2相同的步骤,作好无菌操作准备。
C.将实验2中光照下诱导的愈伤组织,全部转入分化培养基上,黑暗诱导的愈伤组织一半转入分化培养基,所有转入分化培养基的愈伤组织均置于连续光照或16h/d光照,温度20-22℃条件下培养。
需要注意的是,愈伤组织的状态常常受许多因素的影响,如果转入分化培养后3-4周仍然没有芽的形成,或愈伤组织状态没有明显变化,应及时调整培养基激素浓度,更换新鲜培养基。
D.将另黑暗下培养的另一半愈伤组织转入增殖培养基中,继续置于黑暗条件下培养,培养温度24℃。
3.4记载内容
上次实验愈伤组织诱导结果:
愈伤组织诱导率;愈伤组织状态、大小;不同光照形成的愈伤组织状态描述;污染率统计。
本次实验操作过程,接种瓶数,每瓶接种量。
实验4细胞悬浮培养
实验准备:
用MS培养基配置2%的果胶酶并用过滤灭菌器过滤;配置液体培养基分装于200ml的三角瓶中,每瓶50ml。
培养基配方:
MS无机盐附加烟酸0.05mgL-1、VB6和VB1各0.01mgL-1、甘氨酸3mgL-1、肌醇100mgL-1、激动素0.2mgL-1、2,4—D0.1mgL-1、蔗糖20gL-1,pH5.8。
4.1实验目的
了解细胞悬浮系建立的全过程,掌握细胞液体悬浮培养技术。
4.2实验材料
烟草叶片在黑暗条件下培养形成的愈伤组织,再经过1-2次增殖培养后用于悬浮细胞系的建立(可与体细胞胚诱导实验同时培养)。
4.3操作方法
A.按照实验2相同的步骤,作好无菌操作准备。
B.在净化工作台上,用无菌注射器将果胶酶1ml加入到已灭菌的含有液体培养基的三角瓶中,轻轻摇匀,再将复合要求的松散愈伤组织用细胞铲接种于液体培养基中。
接种量大约为培养基体积的十分之一。
C.接种后的三角瓶用1/100的天平称取重量并记载,然后置于摇床上,在转速100rpm,25℃下培养。
D.培养24小时后,将培养物收集到50的离心管中,在800rpm下离心5min.,去除含有果胶酶的培养基,加入新鲜培养基,摇匀再离心一次,去除上清夜,然后按照细胞与培养基1:
10的比例接种到三角瓶中。
E.培养5天后观察结果。
4.4结果观察内容
采用重量法测定细胞生长量。
实验5种子细胞筛选与细胞规模化培养
实验准备:
经过多次继代的悬浮细胞;配置含8%琼脂糖的固体培养基,按组分装成7份;配置液体培养基2升;每人2套灭菌培养皿。
5.1实验目的
掌握单细胞分离和培养技术;了解细胞规模化培养设备与进样接种技术。
5.2种细胞的筛选
单细胞平板培养。
A.将琼脂糖培养基在加热器上融化,将悬浮细胞过滤除去大的细胞团,然后离心并将密度调整至5×105左右。
B.将融化的琼脂培养基在未凝固前,与上述细胞悬浮液按4:
1混合后,平铺在培养皿中,操作时特别注意温度不能过高,以免给细胞造成伤害。
C.在细胞分裂形成可见的小愈伤组织时,将单个细胞的愈伤组织分别接种在平板培养基上单独培养,由每个细胞形成的愈伤组织即为一个细胞系(clone)。
*实际应用中,待单个愈伤组织长至能检测成分的大小时,取每个愈伤组织的一半用于成分分析,另一半继续培养。
成分分析完成后,淘汰不符合要求的愈伤组织,对复合要求的愈伤组织扩大繁殖。
繁殖到一定规模后即可用于规模化生产。
5.3细胞规模化培养
以班为单位,将各自的悬浮细胞收集在一起,按照生物反应器的进样操作接种,接种后每隔3天取样测定培养情况,2周后结束实验,根据测定结果绘制细胞生长曲线图。
实验6原生质体分离与体细胞杂交
实验准备:
配置并过滤灭菌2%的纤维素酶和0.4%果胶酶;蔗糖22%的原生质体漂浮培养基;原生质体培养基;FDA母液和工作液。
6.1实验目的
掌握植物细胞酶解去壁方法;原生质体活力鉴定的方法;了解细胞杂交的基本程序和方法。
6.2原生质体分离
实验材料:
烟草无菌苗叶片,烟草悬浮细胞系。
实验操作:
A.取生长3周的烟草无菌苗平展嫩叶,置于含有一薄层600mmol/L甘露醇-CPW溶液中,置于4℃黑暗下预处理6-8小时;悬浮细胞置于4℃黑暗下预处理48小时。
B.预处理的叶片用吸管吸去预处理液,悬浮细胞离心转入培养皿中,然后加入2%纤维素酶、0.4%果胶酶溶液,用封口膜将培养皿封严,置于暗处在24~26℃下保温酶解;
C.在倒置显微镜下观察,细胞壁已降解,有圆球形原生质体释放到溶液中,即终止酶解。
用吸管轻轻压挤,以释放出全部原生质体;
D.通过一个60~80μm的细胞筛过滤以除去较大的碎屑。
滤液置于1个螺帽离心管中,在100g下离心3min,使原生质体沉降;
E.弃取上清夜,将沉降物缓慢加入含有CPW配制的860mmol/L蔗糖溶液的螺帽离心管中,在在100g下离心10min;
F.将蔗糖溶液的上部原生质体带收集起来,并转入到另一个离心管中。
在离心管中加入原生质体培养基以使原生质体悬浮,在100g下离心3min,重复本相清洗过程至少3次;
G.最后一次清洗之后,加入培养基调整原生质体密度至0.5×105到1×105/ml。
将原生质体按讲授的方法培养。
6.3原生质体活力与密度测定
A.取一小指形管(已灭菌),加入1ml刚分离的原生质体悬浮液,再在其中加入1-2滴FDA工作液;
B.在血球计数板上滴一滴经FDA处理的原生质体悬浮液,置于荧光倒置显微镜下观察。
C.根据发荧光细胞占总细胞的比例计算原生质体生活力,根据单位体积的细胞数计算细胞密度。
6.4PEG诱导细胞体融合
A.将上述分离的原生质体密度调整为4×105/ml的原生质体悬浮液备用;
B.在1个60×15mm的培养皿中滴1滴(2~3ml)硅液200,然后在硅液上面放一张22×22mm的盖片;
C.将叶片原生质体和悬浮细胞原生质体等体积(一般各0.5ml)混合,然后用吸管吸取大约150μl原生质体悬浮液置于盖玻片上。
静止大约5min,以使原生质体沉降在盖片上形成一个薄层;
D.然后在原生质体悬浮液中,加入等体积的PEG溶液(50%PEG1540,10.5mmol/LCaCl2?
2H2O,0.7mmol/LKH2PO4?
H2O)。
室温(24℃)下,将PEG溶液中的原生质体保温10~20min.,在倒置显微镜下观察原生质体粘连的情况;
E.以5min间隔轻轻加入2滴稀释液(50mmol/L甘氨酸,50mmol/LCaCl2?
2H2O,300mmol/L葡萄糖,pH9~10.5),保持5min后,加入1滴原生质体培养基;
F.用新鲜的原生质体培养基,以各为5min的间隔,将原生质体清洗5遍,每次洗完之后,不要把盖片上的培养基全部去掉,要在原生质体上留下一薄层旧培养基,而将新鲜培养基加于其上。
此时可在倒置显微镜下,根据叶绿体标记统计异核融合率;
G.洗涤完成后在盖玻片上滴大约500μl原生质体培养基,在盖玻片周围以小滴形式再加入500~1000μl培养基,以保持培养皿内的湿度,封口后置于25℃黑暗条件下培养。
6.5细胞电融合演示
通过实际操作,演示电融合的操作过程和细胞融合过程。
实验7实验结果统计分析与实验论文写作
.实验结果统计分析
1.1愈伤组织诱导
编号
每瓶接种数
培养条件(暗、光)
愈伤组织诱导率(%)
愈伤组织状态
污染率(%)
愈伤组织诱导率(%)=实际形成愈伤组织数/接种外植体数×100
1.2器官分化与植株再生
烟草叶片愈伤组织再生植株情况统计表
编号
愈伤组织来源
分化率(%)
每个愈伤组织分化芽数
分化芽状态
污染率(%)
分化率(%)=能够分化芽的愈伤组织/接种愈伤组织数×100
1.3两种类型愈伤组织分化能力差异显著性分析
A.分化率的差异显著性分析;
B.芽分化数的差异显著性分析。
2.论文写作
2.1基本要求
字数不少于2000字;参考文献不少于12篇。
文字流畅,逻辑性强;注意应用科学语言进行协作,避免口语化描述;对于所涉及的科学概念与术语力求准确、严谨。
2.2格式要求
按理科学术论文发表格式撰写。
2.3具体要求
A.前言部分应对细胞工程的整体情况进行必要的综述;
B.材料与方法部分要求详细叙述实验过程;
C.结果分析部分,要求实事求是对本人实验结果进行清晰的叙述,实验失败的必须详细分析可能的原因;实验结果涉及到数据的内容必须准确、不得使用大概、约多少等不确定词;能够用本课程的理论原理对实验结果进行分析讨论;并能够将相关学科的知识应用于结果分析中。
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